DHEA 和EPEA 對(duì)小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的體外作用研究

張旭東，劉浩昂，蘭 凱，廉 婷，王志浩，陳 蕊，劉碧波

（1.西安醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院中尼友好拉吉姆醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，陜西 西安 710021；2.西安醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院陜西省呼吸病預(yù)防與診治工程中心，陜西 西安 710021；3.西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西 西安 710077）

脊柱外傷（spine injury，SCI）是一種嚴(yán)重的損害，會(huì)造成運(yùn)動(dòng)和感覺降低及其他并發(fā)癥[1]。目前治療神經(jīng)疼痛的藥物包括普瑞巴林、加巴噴丁等[2，3]。由于中樞神經(jīng)疼痛在不同階段有不同的機(jī)制，且這些藥物都存在嚴(yán)重的副作用。因此，亟須探尋新的治療藥物并了解其作用機(jī)制。二十二碳六烯酸單乙醇酰 胺（docosahexaenoyl ethanolamide，DHEA）、二十碳五烯酸單乙醇酰胺（eicosapentaenoyl ethanolamide，EPEA）是Ω-3 多不飽和脂肪酸DHA、EPA 的衍生物[4]。DHEA、EPEA 具有抗炎、抗腫瘤效果，然而其在中樞神經(jīng)性疼痛的作用仍然未知[5]。研究表明[6]，中樞神經(jīng)疼痛與小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的狀態(tài)有密切關(guān)系。本研究主要探究DHEA 和EPEA 在脊柱外傷后對(duì)小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的作用，旨在為中樞神經(jīng)性疼痛治療提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 DMEM 高糖培養(yǎng)基、GlutaMAXTM、HEPEs、胎牛血清FBS、雙抗（美國(guó)英杰生命技術(shù)有限公司），多聚賴氨酸PDL、脂多糖LPS、Hoechst（美國(guó)默克公司），細(xì)胞培養(yǎng)皿（廣州杰特生物有限公司），DHEA、EPEA（美國(guó)開曼生物科技有限公司），山羊血清、綠色熒光二抗、iNOS、GFAP（美國(guó)生命科技有限公司）。

1.2 小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)原代細(xì)胞培養(yǎng)

1.2.1 小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的獲取方法 細(xì)胞混懸液4 ℃1500 r 離心10 min，棄去上清加入DMEM 重懸后，細(xì)胞計(jì)數(shù)。取用18 mm 蓋玻片置于12 孔細(xì)胞盤，將稀釋后的細(xì)胞混懸液分別鋪于蓋玻片上。最后將附著好的12 孔培養(yǎng)皿置于37 ℃，5%CO2，培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2.2 星形膠質(zhì)細(xì)胞的獲取 加入PBS 溶液沖洗3次，盡可能去除殘留的小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。之后加入Trypsin-EDTA 靜置于培養(yǎng)箱5 min，用于分離附著于涂層的星形膠質(zhì)細(xì)胞。4 ℃1500 r 離心5 min 去除上清液，用DMEM 重懸后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。最后將細(xì)胞混懸液加至放有18 mm 的蓋玻片的12 孔細(xì)胞皿，37 ℃，5% CO2，培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.3 小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞給藥處理

1.3.1 小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞同時(shí)治療 將鋪好的小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞分為4 組（control、100 ng/ml LPS、8 μmol/L DHEA 和8 μmol/L EPEA 組）。control 組加入無(wú)血清培養(yǎng)液，100 ng/ml LPS 組加入100 ng/ml LPS，DHEA 組加入8 μmol/L DHEA 及LPS，EPEA 組加入8 μmol/L EPEA、LPS。

1.3.2 小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞延期治療 與同時(shí)治療一樣，將兩種細(xì)胞分為4 組（Delay control、Delay 100ng/ml LPS、Delay 8 μmol/L DHEA 和8 μmol/L EPEA 組）。Delay control 組加入無(wú)血清培養(yǎng)液，Delay LPS 組，Delay DHEA 組，Delay EPEA 組分別加入100 ng/ml LPS 進(jìn)行激活，小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞激活16 h，星形膠質(zhì)細(xì)胞激活24 h 后，加入無(wú)血清培養(yǎng)液到Delay LPS 組，分別加入8 μmol/L DHEA及8 μmol/L EPEA 到Delay DHEA 組和Delay EPEA 組。

1.4 免疫熒光 4%PFA 固定10 min，PBS 清洗細(xì)胞3 次，每次10 min。小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞染色：用PBS+0.1% sodium azide+0.2% triton 稀釋后的10% goat serum 加入小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中室溫下培育1 h，加入第一次一抗（1∶1000）4 ℃過夜，之后加入第一次二抗（1∶400）室溫下避光孵育2 h，PBS 洗3 次，加入第二次一抗，anti-iNOS（1∶200）4 ℃過夜，次日加入第二次二抗goat anti-mouse（1∶1000）室溫避光培育2 h后PBS 清洗3 次。加入Hoechst（0.02 mg/ml PBS）孵育2 mins 后PBS 清洗3 次，自然風(fēng)干后使用PBS-glycerol（1∶8）置于載玻片上固定。

1.5 數(shù)據(jù)分析 小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞激活態(tài)的定量分析，使用Adobe Photoshop CC 2017 合成iNOS 染色圖片與iba-1 染色圖片分析小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的激活態(tài)。每個(gè)蓋玻片選擇5 個(gè)隨機(jī)區(qū)域，采用Nikon 熒光顯微鏡拍照。DAPI 顯示細(xì)胞核染色，GFP 可以觀察到iba-1 染色，M-cherry 表示iNOS 表達(dá)情況。星形膠質(zhì)細(xì)胞的定量分析采用ImageJ 1.52d 進(jìn)行分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用GraphPad Prism 5.0（GraphPad Software Inc）軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，計(jì)量資料采用（±s）表示，多組間比較采用One-way ANOVA 通過Tukey's test 多組間檢驗(yàn)，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01 表示統(tǒng)計(jì)學(xué)意義顯著，P＜0.001 表示統(tǒng)計(jì)學(xué)意義極顯著。

2 結(jié)果

2.1 小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞同時(shí)治療結(jié)果

2.1.1 體外同時(shí)給藥處理小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)變化與control 組相比，LPS 組細(xì)胞形態(tài)變化非常明顯，細(xì)胞胞體變大，細(xì)胞突起縮短（圖1A、1B）；經(jīng)DHEA和EPEA 處理后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)趨向于control 組細(xì)胞（圖1C、1D）；小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞用iba-1 抗體染色標(biāo)記（圖1E），激活態(tài)的小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞用iNOS 染色標(biāo)記（圖1F）；經(jīng)DHEA 和EPEA 處理后可觀察看到箭頭所指出的激活態(tài)（圖1G、1H）。

圖1 體外同時(shí)給藥處理小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)變化

2.1.2 同時(shí)給藥處理能改變小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的激活態(tài) 經(jīng)同時(shí)給藥處理后，LPS 組相比其他組別其細(xì)胞突起占比明顯降低。control 組占比最高，其次為DHEA 和EPEA 組。此外，LPS 組中iNOS 表達(dá)遠(yuǎn)高于其他3 組，其次為EPEA 組，DHEA 組（P＜0.001），見圖2A；在同時(shí)給藥處理后，DHEA 和EPEA 都能改變小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)，同時(shí)可以減少iNOS 在小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，見圖2B。

圖2 體外同時(shí)給藥處理能改變小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的激活態(tài)

2.2 小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞延期治療

2.2.1 延期給藥處理能改變小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)通過觀察發(fā)現(xiàn)control 組大部分細(xì)胞都有細(xì)長(zhǎng)的單突起或雙突起（圖3A），而LPS 處理組的細(xì)胞體變大、線狀突起變粗變短（圖3B）；經(jīng)8 μmol/L DHEA、8 μmol/L EPEA 處理后，發(fā)現(xiàn)大部分細(xì)胞有從LPS激活的形態(tài)變回對(duì)照組的形態(tài)趨勢(shì)（圖3C、3D）；延期給藥方案中control 組、LPS 組的結(jié)果與同時(shí)治療結(jié)果相類似（圖3E、3F），經(jīng)DHEA、EPEA 處理后細(xì)胞形態(tài)也能恢復(fù)，同時(shí)iNOS 在小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)顯著降低（圖3G、3H）。

圖3 小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)延期給藥處理后細(xì)胞形態(tài)變化

2.2.2 延期給藥處理能改變小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的激活態(tài) 經(jīng)延期治療后處理后，發(fā)現(xiàn)8 μmol/L DHEA 和8 μmol/L EPEA 組帶有突出細(xì)胞的占比相近，但明顯高于LPS 組（圖4A）。同時(shí)LPS 組小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的iNOS 表達(dá)明顯是最高的，DHEA 組低于LPS組，然而卻高于EPEA 組（圖4B）。

圖4 體外延期給藥處理能改變小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的激活態(tài)

2.3 星形膠質(zhì)細(xì)胞同期治療

2.3.1 同時(shí)給藥處理能改變星形膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài) 與LPS 處理組相比，control 組的星形膠質(zhì)細(xì)胞有著更小的胞體和更長(zhǎng)的突起（圖5A、5B，5E、5F）；經(jīng)DHEA、EPEA 處理24 h 后，DHEA、EPEA 組與LPS組相比細(xì)胞體縮小，細(xì)胞突起加長(zhǎng)（圖5C、5D，5G、5H）。

圖5 體外同時(shí)給藥處理能改變星形膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)

2.3.2 同時(shí)給藥處理能改變星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP 的表達(dá) LPS 組中GFAP 的熒光強(qiáng)度最高，DHEA 組與EPEA 組GFAP 熒光強(qiáng)度接近且都低于LPS 組（圖6）。

圖6 星形膠質(zhì)細(xì)胞同期治療后GFAP 表達(dá)

2.4 星形膠質(zhì)細(xì)胞延期治療

2.4.1 延期給藥處理能改變星形膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài) 與LPS 組相比，control 組星形膠質(zhì)細(xì)胞有著更小的胞體和更長(zhǎng)的突起（圖7A、7B，7E、7F）。同樣經(jīng)DHEA、EPEA 處理后，星形膠質(zhì)細(xì)胞體更小，突起恢復(fù)更長(zhǎng)（圖7C、7D，7G、7H）。

圖7 體外延期給藥處理星形膠質(zhì)細(xì)胞的狀態(tài)改變

2.4.2 延期給藥處理能改變星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP 的表達(dá) 延期治療中LPS 組GFAP 的強(qiáng)度明顯高于其他組別，DHEA 組GFAP 的表達(dá)與對(duì)照組相接近，但是低于EPEA 組（圖8）。

圖8 星形膠質(zhì)細(xì)胞延期治療后GFAP 表達(dá)

3 討論

DHA 是一種Ω-3 多不飽和脂肪酸（Ω-3PUFAs），在脊柱損傷模型中起保護(hù)作用[7-9]，同時(shí)DHA和EPA 在神經(jīng)系統(tǒng)中也具有保護(hù)神經(jīng)和促進(jìn)運(yùn)動(dòng)機(jī)能的作用[10]。一項(xiàng)利用成年大鼠脊柱外傷模型的研究發(fā)現(xiàn)EPA 能夠促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞存活[11]。此外，DHEA 與DHA 都有抗炎作用[12]。Ω-3PUFAs 的消耗可以導(dǎo)致EPEA 大量累積，而在脊柱外傷后Ω-3PUFAs 會(huì)影響大鼠中甘油酯類CB 受體的表達(dá)，并促進(jìn)Ω-3PUFAs 的作用[13，14]。同時(shí)，DHA和EPA 乙醇酰胺衍生物DHEA 和EPEA 對(duì)小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞因子表達(dá)有很好的效果[15，16]。因此，探究DHEA 和EPEA 在中樞神經(jīng)疼痛的作用機(jī)制就顯得尤為重要。

生理狀態(tài)下小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞為長(zhǎng)分枝突起且胞體小，而星形膠質(zhì)細(xì)胞在靜息階段是神經(jīng)元樣形態(tài)。經(jīng)LPS 處理后小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞都呈現(xiàn)出高的激活態(tài)狀態(tài)，細(xì)胞胞體變大，但突起數(shù)量和長(zhǎng)度卻最低。經(jīng)DHEA 和EPEA 兩種給藥處理后兩種細(xì)胞的激活態(tài)降低，同時(shí)細(xì)胞突起顯著增加，趨向于正常細(xì)胞形態(tài)。對(duì)比兩種給藥方案，發(fā)現(xiàn)同時(shí)給藥處理在本研究中可以保持更多的細(xì)胞突起數(shù)量，而延期給藥處理突起數(shù)量的占比相對(duì)較低，因此同期治療方案對(duì)細(xì)胞形態(tài)的保護(hù)性更好。已有研究表明在神經(jīng)病理性疼痛中，小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞活化發(fā)生在損傷24 h 后，星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化發(fā)生于受損72 h后，由此可見星形膠質(zhì)細(xì)胞激活是慢性疼痛的主要原因，而小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞活化是急性疼痛的主要誘因[17]。本研究初步探究發(fā)現(xiàn)DHEA 和EPEA 同時(shí)給藥處理對(duì)小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞效果更好，而延遲給藥處理對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的改變更佳，為合并用藥提供了理論可能。脊柱外傷后疼痛受NF-κB 炎癥因子調(diào)控[18，19]。此外，細(xì)胞因子可以增加神經(jīng)性疼痛，因此對(duì)信號(hào)通路探究可以對(duì)未來(lái)治療方案有更好地理解。通過減少或阻斷細(xì)胞因子的接收或釋放，以達(dá)到治療效果[20，21]。

綜上所述，DHEA 和EPEA 在同時(shí)、延期給藥兩種處理下均能改變激活態(tài)小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)和狀態(tài)。接下來(lái)將進(jìn)一步深入地研究DHEA、EPEA 對(duì)疼痛治療的分子機(jī)制。