PI3K/Akt/mTOR 通路與足細(xì)胞自噬在糖尿病腎病腎功能修復(fù)中的研究

陳 婷，劉金彥

（1.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，山東 濟(jì)寧 272067；2.濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院腎內(nèi)科，山東 濟(jì)寧 272011）

隨著肥胖、久坐以及高糖（hyperglycemia，HG）、高脂（hyperlipemia，HLP）等不良飲食習(xí)慣的改變及遺傳因素的影響，糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）患者群體不斷擴(kuò)大[1，2]。DM 及其并發(fā)癥糖尿病腎病（diabetic kidney disease，DKD）的出現(xiàn)顯著增加了全身多臟器功能障礙以及衰竭的風(fēng)險(xiǎn)[3，4]。在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝紊亂的環(huán)境下，PI3K/Akt/mTOR 為軸的信號(hào)通路可顯著激活自噬，促使足細(xì)胞為自身輸送能量，延長(zhǎng)壽命，減少蛋白尿的流失[5]。本文對(duì)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路下多種調(diào)節(jié)因子激活足細(xì)胞自噬的相關(guān)生化途徑進(jìn)行綜述，為尋找未來治療的潛在靶點(diǎn)提供參考。

1 DKD 的概述

DKD 是DM 最為嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，是終末期腎病的源頭所在，是進(jìn)入腎臟替代治療的主要原因[6，7]。DM 病程、血糖控制情況、基礎(chǔ)疾病和遺傳因素是DKD 的驅(qū)動(dòng)因素[8]。1 型和2 型糖尿病患者發(fā)生DKD 風(fēng)險(xiǎn)及病理生理機(jī)制基本相似，均需要10～20 年才能表現(xiàn)出來。近些年來，DM 及DKD 患病人數(shù)不斷擴(kuò)大，長(zhǎng)期HG 損害腎臟、心血管系統(tǒng)、神經(jīng)、骨骼、眼等多個(gè)器官[9-11]。根據(jù)2020 年KDIGO 指南所述，DKD 的界定標(biāo)準(zhǔn)為尿蛋白排泄率持續(xù)升高≥30 mg/g，尿蛋白與尿肌酐的比值≥3 mg/mmol，或腎小球?yàn)V過率eGFR＜60 ml/（min·1.73 m2），或兩者兼有，持續(xù)3 個(gè)月以上[12]。近年來，DKD 患者出現(xiàn)了一種非蛋白尿CKD 表型，其特征是eGFR 逐漸降低，無蛋白尿的出現(xiàn)[13，14]。有研究[15，16]通過建立DKD發(fā)展為腎衰竭的預(yù)測(cè)模型，探究影響DKD 預(yù)后的因素，結(jié)果顯示較低的eGFR 與血紅蛋白含量、高胱抑素C 水平、中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞比率和24 h 尿蛋白顯著增加了DKD 患者接受腎臟替代治療的風(fēng)險(xiǎn)。此外，肥胖、高血壓、高尿酸與同型半胱氨酸血癥、HG、HLP 等代謝綜合征（metabolic syndrome，MS）可加速腎臟超微結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[17-19]。

由內(nèi)皮細(xì)胞和足細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）異常周轉(zhuǎn)與修飾所致的腎小球基底膜（glomerular basement membrane，GBM）增厚是DKD 的早期病理改變；損傷的內(nèi)皮細(xì)胞表面產(chǎn)生促凝、促血管收縮因子以及抗血管生成因子，粘附分子、血管生成因子及其受體減少，內(nèi)皮祖細(xì)胞減少，內(nèi)皮細(xì)胞大量凋亡與血管平滑肌細(xì)胞增殖引起進(jìn)行性腎微血管性缺血，上述多種病理改變通常被認(rèn)為是DKD 中足細(xì)胞激活的早期信號(hào)[20，21]。若上述過程未能給予早期干預(yù)，將發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的腎損害。Balmer LA 等[22]僅在HG 數(shù)天觀察到腎小管肥大，小管間質(zhì)改變，隨著DKD 的進(jìn)展，腎小管發(fā)生萎縮，小管間質(zhì)纖維化改變，管周毛細(xì)血管稀疏。長(zhǎng)期在HG 環(huán)境下，缺血缺氧促使足細(xì)胞發(fā)生代償性肥大，ECM 產(chǎn)生過多，系膜基質(zhì)中的蛋白質(zhì)發(fā)生非酶糖基化導(dǎo)致系膜基質(zhì)擴(kuò)張，腎小球毛細(xì)血管袢被粉紅色透明物質(zhì)包圍形成腎小球內(nèi)微動(dòng)脈瘤，又稱Kimmelstiel Wilson（KW）結(jié)節(jié)，腎臟功能逐漸退化[17]。

2 足細(xì)胞損傷

腎小球?yàn)V過屏障是最復(fù)雜的生物膜，允許水分子通過，中小分子不能完全通過，白蛋白和大分子營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)完全不能通過。足細(xì)胞是通過足突錨定在GBM 的外層的終末分化上皮細(xì)胞，參與構(gòu)成濾過屏障，是減少蛋白尿產(chǎn)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，一旦損傷，不可再生[23]。生理情況下，足細(xì)胞作為胰島素敏感細(xì)胞，可通過細(xì)胞膜表面的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體（glucose transporter，GLUTs）將葡萄糖轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)。DKD 患者體內(nèi)存在著廣泛的胰島素抵抗，HG 使GLUTs 數(shù)量難以代償性增加，葡萄糖向胞外轉(zhuǎn)運(yùn)率降低，如多元醇通路通量、晚期糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs）大量蓄積、AGEs 受體及其活化配體表達(dá)升高、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)遞質(zhì)PKC 亞型的刺激和氨基己糖信號(hào)通路激活使得細(xì)胞內(nèi)葡萄糖水平持續(xù)升高[24]。HG 與HLP 引起活性氧、糖化蛋白和氧化脂質(zhì)等多種有害生化因子大量產(chǎn)生可直接激活補(bǔ)體系統(tǒng)，啟動(dòng)促炎信號(hào)傳導(dǎo)[25，26]。血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的易感性增加，腎素-血管緊張素系統(tǒng)（renin-angiotensin system，RAS）激活、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）、TGF-β/SMAD 通路等多種機(jī)制誘導(dǎo)促炎因子釋放[25]。線粒體穩(wěn)態(tài)難以維持，細(xì)胞器的工作信號(hào)相互串?dāng)_，傳入與傳出小動(dòng)脈玻璃樣變，腎小球血流動(dòng)力學(xué)改變導(dǎo)致灌注不足，自我調(diào)節(jié)功能受損，腎小球微循環(huán)受阻，系膜基質(zhì)、小管間質(zhì)中的膠原蛋白、纖維連接蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)蛋白沉積，致使?fàn)I養(yǎng)素信號(hào)傳遞及攝取中斷，能量代謝的平衡狀態(tài)被嚴(yán)重打破，足細(xì)胞發(fā)生凋亡[26，27]。Matsusaka T 等[28]通過體外試驗(yàn)對(duì)足細(xì)胞損傷特點(diǎn)進(jìn)行挖掘，結(jié)果顯示毒素蓄積導(dǎo)致的足細(xì)胞損傷，損傷的足細(xì)胞可釋放轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、內(nèi)皮素-1、趨化因子等多種有毒物質(zhì)波及周圍的細(xì)胞，腎單位大量丟失。

3 足細(xì)胞自我保護(hù)機(jī)制

自噬是細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、營(yíng)養(yǎng)缺乏等惡劣條件下作出的應(yīng)激反應(yīng)，分為巨噬、伴侶蛋白介導(dǎo)的自噬與微自噬三種模式，包括自噬誘導(dǎo)與自噬小體的形成等多個(gè)過程[29，30]。自噬程序的啟動(dòng)可將胞內(nèi)衰老受損的細(xì)胞器以及異常的大分子物質(zhì)、病原體轉(zhuǎn)入溶酶體內(nèi)降解，降解產(chǎn)物可作為能源物質(zhì)被回收利用。這種自我清潔與能量循環(huán)的過程有利于節(jié)約外界能量供給，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育，提高細(xì)胞生存適應(yīng)性，保持細(xì)胞活力[31-33]。自噬周轉(zhuǎn)的相對(duì)速率反映自噬活性的高低，又被稱為自噬通量[34]。

mTOR 是自噬重要的調(diào)節(jié)因子，是一種絲氨酸/蘇氨酸磷酸化酶，共分為兩種：mTOR 復(fù)合物1（mTORC1）和復(fù)合物2（mTORC2）[35]。mTORC1 是一種對(duì)RAPA 敏感的蛋白激酶復(fù)合物，由mTOR 調(diào)控相關(guān)蛋白（RAPTOR）、G 蛋白β-亞基樣蛋白（Gβl）等多種成分組成，通過感知葡萄糖、氨基酸、氧的水平，磷酸化p70、S6K1、4EBP1 等多種調(diào)節(jié)因子參與細(xì)胞周期與自噬進(jìn)程，維持營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)平衡[32]。mTORC2 對(duì)RAPA 的敏感性遠(yuǎn)低于mTORC1，由mTOR、Gβ、對(duì)mTOR 的RAPA 不敏感的伴侶蛋白R(shí)ICTOR 等成分組成，對(duì)生長(zhǎng)因子敏感，負(fù)責(zé)細(xì)胞骨架的搭建[36]。

自噬程序的啟動(dòng)受多種信號(hào)通路的調(diào)控，高度進(jìn)化保守的自噬相關(guān)基因（autophagy-related gene，ATG）的表達(dá)決定了自噬通量的大小與底物降解的高度選擇性[37]。Audzeyenka I 等[36]通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期暴露于HG 環(huán)境下，由于細(xì)胞對(duì)胰島素的敏感性被抑制，大鼠原代足細(xì)胞自噬相關(guān)基因Atg12-Atg5 表達(dá)減少，LC3-II、Beclin1 等自噬相關(guān)蛋白表達(dá)大幅度降低，自噬通量下調(diào)。mTORC1 抑制劑雷帕霉素（RAPA）是防止器官移植后臨床排斥反應(yīng)的常用藥物，可特異性結(jié)合mTOR 激酶，抑制mTOR 活性[38，39]。Li Q 等[40]研究表明，AGEs 的積累抑制了足細(xì)胞對(duì)纖維連接蛋白的粘附與遷移，降低足細(xì)胞活力，提升凋亡水平。RAPA 的應(yīng)用減少了HG 對(duì)足細(xì)胞的不利影響，而mTORC1 和mTORC2雙抑制劑KU0063794 的應(yīng)用進(jìn)一步增加了HG 環(huán)境足細(xì)胞存活的可能性。Fang L 等[41]使用自噬增強(qiáng)劑低劑量RAP（1 ng/ml）恢復(fù)自噬，雙免疫熒光染色顯示足細(xì)胞素表達(dá)減少，分布模式得到明顯改善，缺陷性自噬得以修復(fù)，濾過屏障功能受損得到緩解，因此恢復(fù)自噬活性可能是緩解足細(xì)胞損傷的新靶點(diǎn)。Yu S 等[42]也得出同樣的結(jié)論。

4 PI3K/Akt/mTOR 通路與足細(xì)胞自噬調(diào)節(jié)

生理狀態(tài)下，足細(xì)胞膜表面鑲嵌著大量生長(zhǎng)因子受體與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)通道蛋白。當(dāng)機(jī)體血糖水平升高時(shí)，胰島素的分泌促進(jìn)葡萄糖向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，推進(jìn)氨基酸、脂質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)素的生物合成，抑制糖異生，足細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境處于穩(wěn)定狀態(tài)，以PI3K/Akt/mTOR通路為主軸的自噬機(jī)制往往不被激活而處于休眠狀態(tài)[43，44]。在DKD 患者體內(nèi)，在足細(xì)胞長(zhǎng)期處于HG、HLP 環(huán)境時(shí)，使抗氧化能力大大受限[48]，活性氧的誘導(dǎo)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)的表達(dá)、胰島素抵抗、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝紊亂、毒素蓄積及激素的異常分泌、HG、HLP 刺激胰島素樣生長(zhǎng)因子1（IGF-1）、胰高血糖素、一氧化氮（NO）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）和前列腺素等血管活性介質(zhì)的釋放[21]。DKD 前期腎小球內(nèi)部灌注不足，足細(xì)胞長(zhǎng)期處于饑餓狀態(tài)，極易發(fā)生程序性死亡[40]。此時(shí)，能量感知因子與生長(zhǎng)因子激活腦Ras同源蛋白（Rheb）開關(guān)，并與G 蛋白偶聯(lián)受體（GPCRs）、酪氨酸激酶受體（TKRs）結(jié)合，觸發(fā)磷脂酰肌醇激酶（PI3K）、PI3K 下游的蛋白激酶B（Akt）的磷酸化，進(jìn)而激活mTORC1 的組成成分4EBP1 與S6K1 誘導(dǎo)自噬[46]，胞內(nèi)有益成分的繼續(xù)保留，異常免疫復(fù)合物及衰老損傷的細(xì)胞器及大分子物質(zhì)降解，部分排出體外，部分合成核酸及其前體、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、ATP 和NADPH 等能源物質(zhì)平衡細(xì)胞合成代謝與分解代謝[47]。mTORC2 位于Akt 的下游，磷酸化的Akt 啟動(dòng)mTORC2 參與細(xì)胞骨架的搭建，與此同時(shí)，mTORC1 也得到了最大程度的激活，mTORC1 與mTORC2 二者相輔相成，共同減少胰島素抵抗誘導(dǎo)的細(xì)胞毒作用，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的循環(huán)使用，細(xì)胞外源源不斷的能量供應(yīng)與足細(xì)胞的自我修復(fù)[43]。

有研究顯示[48]，用正常培養(yǎng)液和無氨基酸培養(yǎng)液對(duì)足細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，Western blot 檢測(cè)到LC3Ⅱ和beclin1 水平增加，逆轉(zhuǎn)錄-定量聚合酶鏈反應(yīng)結(jié)果顯示LC3Ⅱ?qū)?yīng)的mRNA 水平呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，透射電鏡觀察自噬小體大量產(chǎn)生，由此可知：氨基酸饑餓（amino acid starvation，AAS）可促進(jìn)核轉(zhuǎn)位，提高轉(zhuǎn)錄因子EB（TFEB）的活性，高活性的TFEB 可抑制mTOR，促進(jìn)自噬體、自噬溶酶體的形成和底物降解。糖原合成酶激酶3β（GSK3β）作為糖原代謝的重要組成部分，已被證實(shí)為PI3K/Akt 通路的下游靶點(diǎn)，其活性與自噬呈負(fù)相關(guān)。

前期研究發(fā)現(xiàn)，肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）通過抑制GSK3βHG 還原Ser9 磷酸化而增加自噬通量，因此Ser9 磷酸化是GSK3β 活化的指標(biāo)。Hou B 等[49]評(píng)估HGF 在DKD 中足細(xì)胞穩(wěn)態(tài)中的作用并進(jìn)一步闡明其機(jī)制：對(duì)自噬相關(guān)蛋白和足細(xì)胞骨架蛋白--突觸素（Synapt）進(jìn)行免疫熒光雙染色發(fā)現(xiàn)DKD 患者足細(xì)胞自噬通量受損。與未接受HGF 治療的DM 小鼠相比，接受HGF 治療的DM 小鼠的尿白蛋白排泄率、足細(xì)胞損失量顯著降低，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比例增加。HGF 的這些有益作用可被其抑制劑克唑替尼或PI3K 抑制劑LY294002 阻斷，與對(duì)照組相比，DKD小鼠組p-Akt（ser473）/Akt 和pGSK3β（ser9）/GSK3β比值降低。上述實(shí)驗(yàn)證實(shí)HGF 在足細(xì)胞中通過PI3K/Akt-GSK3β-TFEB 軸改善溶酶體功能和自噬。表皮生長(zhǎng)因子（EGF）已被認(rèn)為是慢性腎臟疾病進(jìn)展的潛在生物標(biāo)志物，是典型的表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）配體，主要來源于腎臟。Sun Y 等[50]使用EGF 處理HG 刺激后的足細(xì)胞，DNA 甲基化表達(dá)譜分析顯示，與HG 組相比，HG+EGF 組有9309 個(gè)CpG 高甲基化位點(diǎn)（5220 個(gè)基因）和3111 個(gè)CpG低甲基化位點(diǎn)（2511 個(gè)基因），差異甲基化基因在PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路中顯著富集，提示EGF介導(dǎo)的保護(hù)作用通過PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路中的相關(guān)DNA 甲基化參與腎足細(xì)胞的修復(fù)。

當(dāng)HG 誘導(dǎo)的脂質(zhì)蓄積超過細(xì)胞的代償能力時(shí)，對(duì)足細(xì)胞產(chǎn)生不可逆轉(zhuǎn)的損傷[51]。既往研究表明[52-54]，硫氧還蛋白互作蛋白（thioredoxin-interacting protein，TXNIP）參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的糖、脂代謝。Du C等[55]研究了TXNIP 對(duì)DKD 中脂質(zhì)積累的影響，與DM 野生型小鼠相比，敲除TXNIP 相關(guān)基因后，乙酰輔酶a 羧化酶、肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶Ⅰ等脂代謝相關(guān)酶以及Akt、mTOR 的表達(dá)減弱，小鼠體內(nèi)脂質(zhì)積聚增加。使用PI3K 特異性抑制劑LY294002 阻斷Akt/mTOR 信號(hào)通路，可以復(fù)制TXNIP 沉默的效果。因此，TXNIP 的存在可通過抑制Akt/mTOR 通路抑制自噬，加重脂質(zhì)在腎臟中積聚。抑制TXNIP 的產(chǎn)生與釋放可能為足細(xì)胞損傷相關(guān)腎病患者提供新的希望。HG 可誘導(dǎo)足細(xì)胞中精子相關(guān)抗原5（SPAG5）的mRNA 和相應(yīng)蛋白表達(dá)上調(diào)，沉默SPAG5 可逆轉(zhuǎn)HG 處理的足細(xì)胞凋亡小體與自噬小體減少的狀況[56-58]。Xu J 等[59]發(fā)現(xiàn)SPAG5-as1 作為SPAG5 的鄰居基因，與泛素特異性肽酶14（USP14）相互作用，使SPAG5 蛋白去泛素化并趨于穩(wěn)定狀態(tài)。因此，當(dāng)SPAG5-as1 作用于SPAG5/AKT/mTOR 通路時(shí)，對(duì)足細(xì)胞自噬具有抑制作用，加劇足細(xì)胞凋亡。靶向調(diào)節(jié)SPAG5-as1/SPAG5 激活自噬為緩解足細(xì)胞損傷提供一種新的治療選擇。

含SH2 結(jié)構(gòu)域的肌醇5'-磷酸酶（SHIP）被稱為PI3K/Akt 通路的負(fù)調(diào)控因子[60]。Li F 等[61]研究發(fā)現(xiàn)，在DKD 小鼠體內(nèi)，HG 以時(shí)間依賴性的方式降低了SHIP 的表達(dá)，同時(shí)激活了PI3K/Akt 信號(hào)通路導(dǎo)致ECM 的產(chǎn)生，而轉(zhuǎn)染M90-SHIP 載體可以顯著阻止這一過程；在DM 小鼠體內(nèi)腹腔注射SHIP 表達(dá)載體促使SHIP 高表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，Akt 與結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（CTGF）的表達(dá)明顯降低，腎小管細(xì)胞的ECM 積累減少。可見，過表達(dá)SHIP 可能是一種通過失活PI3K/Akt 通路和抑制DKD 中CTGF 的產(chǎn)生來減少ECM 積聚的有效方法[62-64]。

5 總結(jié)

自噬廣泛存在于足細(xì)胞內(nèi)，感知細(xì)胞內(nèi)外能量變化并激活相應(yīng)通路作出應(yīng)答。生理情況下，PI3K/AKT/mTOR 通路往往不被激活；在DKD 初期，細(xì)胞處于饑餓環(huán)境下并具有一定的代償能力，以PI3K/AKT/mTOR 通路為軸，HGF、EGF、GSK3β-TFEB 等多種調(diào)節(jié)因子共同參與自噬，線粒體的生化反應(yīng)以及細(xì)胞的大分子營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的生物合成得以順利進(jìn)行。然而，在DKD 終末期，MS 是其常見的并發(fā)癥，TXNIP、SPAG5-AS1 等相關(guān)因子產(chǎn)生增多，SHIP 含量降低，抑制自噬，加速足細(xì)胞凋亡。上述多項(xiàng)研究結(jié)果多基于體外試驗(yàn)，為推進(jìn)靶向治療的進(jìn)一步發(fā)展，今后還應(yīng)加大藥物研發(fā)力度，提高藥物療效。