復合水果酵素發(fā)酵過程中理化特性及抗氧化活性分析

李悅，張云娟，趙葉，章金龍，宋志姣*

1.保山學院資源環(huán)境學院（保山 678000）；2.云南省高校怒江河谷生物質資源高值轉化與利用重點試驗室（保山 678000）

獼猴桃（Actinidia chinensis Planch）含有豐富的維生素C、果糖、果酸和酚類物質，具有較高的營養(yǎng)價值和藥用價值[1]。經常食用獼猴桃，可以降低血液中膽固醇，防治心血管疾病。其所含有的SOD酶，具有出眾的抗氧化性能，可以消除皺紋和細紋。此外，獼猴桃中的維生素C和維生素E還能夠促進人體對糖分的吸收，提高抵抗力[2]。葡萄（Vitis vinifera L）含有較多葡萄糖、B族維生素、維生素C、礦物質以及多種人體所需的氨基酸。鮮葡萄中的多種果酸有助于消化，黃酮類物質能防止形成膽固醇斑塊。此外，葡萄籽中富含的原青花素能清除人體內有毒的自由基，保護人體細胞組織免受自由基的氧化損傷，具有輔助降低心腦血管疾病發(fā)生、防輻射、美白祛斑等功效[3]。獼猴桃及葡萄均是進行果蔬深加工的良好原料。

酵素是用一種或多種新鮮水果、蔬菜等為原料，經多種有益微生物發(fā)酵的一種含有酶、礦物質和次生代謝產物等多種生物活性物質的功能性微生物發(fā)酵液體或固體[4]，因其具有抗氧化、美容養(yǎng)顏、減肥瘦身、增強機體免疫力等多種保健功效，加之水果蔬菜氣味芬芳，香氣宜人，果蔬類酵素在年輕消費人群中備受青睞，并有添加酵素的保健食品和面膜等副產品問世，現(xiàn)階段酵素產品已實現(xiàn)商業(yè)化，在國內外市場的發(fā)展空間廣闊[5-7]。

研究以獼猴桃和葡萄為原料發(fā)酵水果酵素，通過測定酵素自然發(fā)酵過程中pH、總酸、總酚、維生素C含量變化來分析發(fā)酵過程中活性成分的變化；以DPPH自由基清除率、羥基自由基清除率和還原力為抗氧化性指標，評價獼猴桃葡萄酵素的抗氧化活性，為水果酵素的綜合開發(fā)利用提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄、獼猴桃、白砂糖、檸檬，購于保山市紅葉超市；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼/DPPH（上海阿拉丁生化科技有限公司）；氫氧化鈉、鐵氰化鉀、3,5-二硝基水楊酸（廣州化學試劑廠）；抗壞血酸、硫酸亞鐵、碳酸氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、碳酸鈉（北京化學試劑公司）；三氯化鐵（合肥巴斯夫生物科技有限公司）；2,6-二氯靛酚（上海展云化工有限公司）；鄰苯二甲酸氫鉀、三氯乙酸、無水乙醇、沒食子酸（天津市風船化學試劑科技有限公司）。

1.2 設備與儀器

UV-2600紫外-可見分光光度計（日本島津公司）；HH-4恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司）；PHS-3C pH計（上海儀電科學儀器有限公公司）；1DL 5A離心機（上海安亭科學儀器廠）；SW CJ 1D單人雙面無菌操作臺（蘇州凈化設備有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 獼猴桃葡萄酵素的制備

純凈水對新鮮獼猴桃、葡萄及檸檬簡單沖洗以除去表面灰塵，在無菌操作臺中晾干表皮水分，獼猴桃去皮切片、葡萄保留完整，檸檬切片，白砂糖用紫外燈殺菌30 min后備用。獼猴桃、葡萄與白砂糖按質量比1∶1∶1的比例加入到已消毒的玻璃發(fā)酵罐中，按照一層獼猴桃、一層葡萄、一層糖的順序鋪到罐子八分滿，底層和最后一層鋪上檸檬。在25±2 ℃恒溫箱中發(fā)酵49 d，pH穩(wěn)定于3～3.5之間判斷發(fā)酵結束。

1.3.2 樣品液的制備

在整個發(fā)酵過程中，每隔7 d取樣一次進行相關指標測定。樣品的制備：取20 mL酵素原液，按3 500 r/min離心10 min，取上清液得到樣品。

1.3.3 理化指標的測定

pH的測定：按參考文獻[8]GB/T 10468規(guī)定的方法測定；總酸的測定：參照參考文獻[9]GB 12456食品中總酸的測定。

1.3.4 功效成分的測定

1.3.4.1 總酚含量的測定

參考李飛等[10]方法，取1 mL酵素樣品，用超純水稀釋至10 mL得到待測液，取0.5 mL待測液加入到0.5 mL 50%的福林酚試劑中，充分混勻后靜置2 min，再加入1.5 mL 20%的碳酸鈉溶液，混勻，常溫避光靜置1 h后在760 nm處測定其吸光度，平行測定3次。用超純水做空白對照，以沒食子酸等價物來表示。以沒食子酸為標準品，繪制標準曲線，得標準曲線線性方程y=0.082 0 x+0.003 5（R2=0.999 3）。

1.3.4.2 維生素C含量的測定

參照參考文獻[11]《GB 5009.86食品中抗壞血酸的測定》2,6-二氯靛酚滴定法。

1.3.5 抗氧化活性分析

1.3.5.1 DPPH自由基清除能力[12]

取1 mL酵素樣品液，用超純水稀釋至10 mL得待測液。取2 mL待測液，加入2 mL的2×10-4mol/L的DPPH乙醇溶液，用超純水稀釋到20 mL，混勻避光放置30 min，在波長517 nm條件下，測定其吸光度。以0.01 mg/mL的維生素C作對比。DPPH清除率按式（1）計算。

式中：A1為待測液吸光度；A2為乙醇溶液替代DPPH溶液的吸光度；A3為乙醇溶液替代待測液的吸光度。

1.3.5.2 羥基自由基清除率[13]

取1 mL酵素樣品，用超純水稀釋至10 mL得到待測液。取2 mL待測液，加入2 mL 6 mmol/L的硫酸亞鐵溶液和2 mL 6 mmol/L過氧化氫溶液，用超純水稀釋到20 mL，混勻后靜置10 min，再加入2 mL的6 mmol/L的水楊酸溶液，混勻置于37 ℃恒溫水浴鍋中恒溫30 min后，在波長510 nm處測定其吸光度。以0.01 mg/mL的維生素C作對比。羥基自由基清除率按式（2）計算。

式中：A1為樣品液吸光度；A2為蒸餾水代替水楊酸的吸光度（對照）；A3為蒸餾水替換待測液的吸光度（空白）。

1.3.5.3 還原力的測定

采用鐵氰化鉀還原法[14]，取1 mL酵素樣品，用超純水稀釋至10 mL得到待測液。取0.5 mL待測液，加入2.5 mL pH 6.6的磷酸緩沖液和質量分數(shù)為1%的鐵氰化鉀溶液2.5 mL，充分混勻后在50 ℃水浴鍋中反應30 min，冷卻，再加入2.5 mL質量分數(shù)為1%的三氯乙酸，充分混勻，加入0.5 mL三氯化鐵，用超純水在試管中稀釋到20 mL，靜置5 min后在波長700 nm處測定吸光度。

2 結果與分析

2.1 酵素發(fā)酵過程中理化指標的測定

2.1.1 酵素發(fā)酵過程中pH的變化

pH的動態(tài)變化在一定程度上能反映發(fā)酵過程是否正常。由圖1可知：發(fā)酵液pH在7 d內從起始pH 4.71降到3.40，表明酵素前期發(fā)酵非常迅速，主要是乳酸菌發(fā)酵導致發(fā)酵液中有機酸急劇增加所致；7 d后pH在3.4上下小范圍波動，這可能是發(fā)酵進入穩(wěn)定期，其次菌體在生長和代謝過程中產生大量CO2，CO2在水溶液中溶解度不穩(wěn)定，產生的HCO3-可從有機酸結合H+，從而防止氫離子濃度進一步升高，使發(fā)酵液具有一定緩沖能力[15]。

圖1 酵素發(fā)酵過程中pH的變化

2.1.2 酵素發(fā)酵過程中總酸含量的變化

酸度是衡量酵素發(fā)酵成熟度和發(fā)酵液品質的重要理化指標[16]。由圖2可知，總酸含量從0.07 g/L上升至0.13 g/L，前三周增長較快，這可能是因為在此期間環(huán)境中營養(yǎng)物質豐富，有利于一些產酸微生物大量繁殖，從而產生大量的乳酸、醋酸等次生代謝產物[12]。過后增長有小幅波動后趨于平穩(wěn)，可能是因為發(fā)酵液中糖類物質的消耗，部分微生物開始利用有機酸作為碳源，從而使得總酸含量下降，發(fā)酵后期乳酸菌繼續(xù)進行發(fā)酵，將多元酸轉變成一元酸，抑制總酸上升的趨勢[17]。

圖2 發(fā)酵過程中總酸含量的變化

2.2 酵素發(fā)酵過程中功效成分的測定

2.2.1 酵素發(fā)酵過程中總酚含量的變化

酵素發(fā)酵過程中總酚含量變化如圖3所示?？偡邮侵笜右褐兴械姆宇愇镔|，是絕大多數(shù)具有抗氧化活性物質的總稱。通過測定總酚含量，可判斷出抗氧化性的變化趨勢[18]。酵素在發(fā)酵過程中總酚含量總體呈上升趨勢，第4周和第5周有小幅下降，發(fā)酵后期總酚含量達24.96 mg/mL，相較發(fā)酵前提高19.7%。猜測總酚含量的增加原因有二：一是總酚含量增加的原因是微生物把龐雜的酚類物質變換成了簡單的酚類物質[19]；二是發(fā)酵過程中部分酚類物質的持續(xù)溶出，使總酚含量逐步增加[20]。21～35 d出現(xiàn)總酚含量下降，可能是酚類物質被微生物分解成小分子物質，發(fā)生降解反應引起的[5]，這可能與微生物對多種構型多酚的轉化有關，多酚組分含量的變化會影響酵素的抗氧化酚類物質含量的變化，會相應增強酵素的抗氧化活性[21]。

圖3 酵素發(fā)酵過程中總酚含量變化

2.2.2 酵素發(fā)酵過程中維生素C含量的變化

由圖4可知，由于新鮮的獼猴桃和葡萄含有大量維生素C，故發(fā)酵第一天維生素C含量高達82.8 mg/100 mL。隨著發(fā)酵時間延長，維生素C含量一直呈下降趨勢，發(fā)酵第2周和第3周下降幅度較大，分析原因可能是由于微生物的相關活動和利用，另外，雖然酵素的酸性環(huán)境能保護其穩(wěn)定性，但維生素C作為強還原性物質會有不同程度的流失[22]。發(fā)酵至49 d時維生素C含量僅有33.2 mg/100 mL，發(fā)酵前后下降61.1%。

圖4 發(fā)酵過程中維生素C含量的變化

2.3 抗氧化活性測定

2.3.1 酵素發(fā)酵過程中DPPH自由基清除能力的變化

DPPH自由基被廣泛運用于評價短時間內的抗氧化活性[23]。由圖5可知，酵素對DPPH自由基清除率變化趨勢為波動中逐漸增大，發(fā)酵至49 d時清除率為77.55%，但相較于0.01 mg/mL維生素C對DPPH自由基清除率（92.71%）仍有一定差距。分析原因可能是發(fā)酵初期酚類物質少，而維生素C含量較高。維生素C能顯著清除自由基，但在發(fā)酵過程中維生素C含量不斷減少，DPPH自由基清除率出現(xiàn)了短時間的下降，發(fā)酵后期總酚含量增加，而維生素C含量不斷下降，此時DPPH自由基清除率主要受總酚含量影響。研究表明酚類物質能給出一個氫離子并通過共振雜化而穩(wěn)定，具有高自由基清除能力[24]，這也基本符合試驗DPPH自由基清除率在一定程度上隨著總酚含量變化而產生相應波動的規(guī)律。

圖5 發(fā)酵過程中DPPH自由基清除率的變化

2.3.2 酵素發(fā)酵過程中羥基自由基清除能力的變化

羥基自由基屬活性氧中的一種，在體內可與金屬離子發(fā)生氧化，使金屬離子形成高氧化態(tài)，可損害機體細胞，進而引發(fā)慢性病以及衰老等疾病[25]。由圖6可知，酵素對羥基自由基的清除率總體呈平穩(wěn)上升的趨勢。發(fā)酵至49 d時清除率為63.65%，接近0.01 mg/mL維生素C對羥基自由基清除率（65.69%）。發(fā)酵中期清除率增幅較大，可能是發(fā)酵過程中產生SOD、多酚、皂苷和多糖等具抗氧化活性物質[26]。

圖6 酵素發(fā)酵過程中羥基自由基清除率的變化

2.3.3 酵素發(fā)酵過程中還原力的變化

一種物質還原能力的大小直接反應其抗氧化活性的大小。由圖7可知，獼猴桃葡萄酵素的還原力總體呈上升趨勢，之后緩慢下降。第35天時達到0.246，發(fā)酵第49天時，由最初的0.206上升到0.239，接近0.01 mg/mL維生素C的還原力（0.253），說明隨著發(fā)酵的進行發(fā)酵液中抗氧化成分逐漸增加。

圖7 酵素發(fā)酵過程中還原力的變化

2.4 總酚含量、與抗氧化能力參數(shù)相關性分析

利用SPSS 17軟件，對發(fā)酵過程中總酚含量與其抗氧化能力參數(shù)的相關性進行分析，結果見表1。

表1 總酚含量與抗氧化活性的相關性

從表1可知，總酚含量與DPPH清除率、羥基自由基清除率、還原力的相關系數(shù)分別為0.875，0.923和0.804，且一般認為相關系數(shù)（r）在0.8～1.0之間是極強相關，r在0.6～0.8之間是強相關，0.4～0.6之間是中等程度相關，r在0.2～0.4之間是弱相關。說明總酚含量與DPPH清除率、羥基自由基清除率、還原力之間存在極強的正相關性（P＜0.01）。

3 結論

文章以獼猴桃和葡萄為原料，通過自然發(fā)酵制備酵素，監(jiān)測發(fā)酵過程中各理化指標及體外抗氧化能力的變化，并進行相關性分析。結果表明，發(fā)酵過程中pH和維生素C持續(xù)降低，總酸、總酚呈波動式上升趨勢；抗氧化活性（DPPH自由基清除率、羥自由基清除率和還原力）總體呈現(xiàn)持續(xù)增長趨勢并于發(fā)酵后期達穩(wěn)定狀態(tài)，其中羥自由基清除率和還原力與0.01 mg/mL維生素C表現(xiàn)接近，DPPH自由基清除率與對照仍有一定差距。功能成分與抗氧化能力參數(shù)相關性表明，總酚含量與DPPH清除率、羥基自由基清除率、還原力之間均存在極顯著正相關性（P＜0.01）。綜上所述，發(fā)酵能促進體系中物質轉換和活性物質生成，從而提升酵素的品質，研究結果可為獼猴桃葡萄酵素的發(fā)酵機理以及產品的綜合開發(fā)利用提供一定的理論參考。