響應(yīng)面法優(yōu)化姜根多酚類成分提取及純化工藝

＊肖湲 胡露 陳杰 聶艷峰 郭朝萬(wàn)

（廣東丸美生物技術(shù)股份有限公司 廣東 510530）

引言

姜為多年生草本植物姜（Zingiberoffi cnale Rosc.），其根莖是一種重要的調(diào)味品，也是我國(guó)傳統(tǒng)的藥食同源植物[1]。姜酚是姜中一類具有生物活性的酚類化合成分，由于苯環(huán)的取代基不同、位置不同及側(cè)鏈長(zhǎng)短、環(huán)化與否等差異，組成了許多分子質(zhì)量不同、分子結(jié)構(gòu)僅略有差異的不同姜酚類物質(zhì)，包括6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、12-姜酚等，其中6-姜酚含量最高[2]。姜酚中苯環(huán)和長(zhǎng)鏈烴的結(jié)構(gòu)決定其易溶于有機(jī)溶劑體系，難溶于水[3]。在提取過(guò)程中姜酚成分在加熱、酸、堿及其他氧化劑存在的環(huán)境下極易發(fā)生降解反應(yīng)、脫水反應(yīng)和氧化反應(yīng)，這些均給其分離、提純工作帶來(lái)了很大的難度[4]。此外，姜酚中苯環(huán)上含有的甲氧基、酚羥基等結(jié)構(gòu)的破化也會(huì)影響到姜酚的原本的生物活性[5]。

目前姜酚提取的方法主要有溶劑浸提法[6]、壓榨法[7]、超聲波輔助提取法[8]、微波輔助提取法[9]、超臨界CO2萃取法和滲漉提取法[10]。其中，超聲波提取技術(shù)具有提取速度快、選擇性好、操作方便及有利于活性成分的保留等特點(diǎn)。經(jīng)過(guò)溶劑提取的姜酚成分往往還存在較多的雜質(zhì)，因此還需要合適的分離方式純化姜酚。在姜酚的分離純化研究中最常見(jiàn)的就是大孔樹脂吸附法[11]、硅膠柱層析法[12]、高速逆流色譜法[7]等，本文采用單因素和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方法優(yōu)化生姜中多酚成分的提取工藝，為姜酚的工藝生產(chǎn)提供理論指導(dǎo)。

1.材料和儀器

（1）材料：姜根，購(gòu)于市售新鮮樣品，于冷凍干燥離心機(jī)凍干后再進(jìn)行提取；試劑：沒(méi)食子酸、福林酚、碳酸鈉、蒸餾水、乙醇。

（2）儀器：紫外分光光度計(jì)UV-2600（日本，島津）、萬(wàn)分之一天平（德國(guó)，賽多利斯）、中藥粉碎機(jī)（淄博粉體設(shè)備有限公司）、數(shù)顯恒溫水浴鍋HH系列-1型、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DGG-9023A）、冷凍干燥離心機(jī)（FD-2A-80）、超聲儀380W。

2.實(shí)驗(yàn)方法

(1)多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以沒(méi)食子酸作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照。分別配制質(zhì)量濃度為0.05 mg/mL、0.1mg/mL、0.15mg/mL、0.2mg/mL、0.25mg/mL、0.3mg/mL的沒(méi)食子酸乙醇溶液，分別取2mL加入1mL福林酚試劑，搖勻后靜置30s，加入2mL 12% Na2CO3，用蒸餾水定容至20mL，搖勻，在765nm處測(cè)定吸光度值，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，制定標(biāo)曲。本實(shí)驗(yàn)得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：A=0.0089c+0.0858，R2=0.997，沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度在0.05～0.3mg/ml范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性范圍。

(2)多酚成分提取單因素實(shí)驗(yàn)

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，實(shí)驗(yàn)基本設(shè)定為取生姜粉末1g，加入75%乙醇20mL，功率100%，在50℃下，超聲提取20min，4500r離心4min，得到濾液，按以上方法測(cè)定姜酚含量。實(shí)驗(yàn)因素條件為：料液比（1:5、1:10、1:15、1:20、1:25）、提取時(shí)間（10min、15min、20min、25min、30min）、提取溫度（30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（55%、60%、75%、80%、95%）。

(3)多酚成分提取響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

基于上述單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)一步采用Design-Expert 8.0.6軟件設(shè)計(jì)Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，主要分析了料液比（A）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（B）、提取時(shí)間（C）3個(gè)因素之間的相互作用對(duì)姜酚得率（Y）所產(chǎn)生的影響。試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)因素及水平表

3.結(jié)果與分析

(1)單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化

①研究提取料液比對(duì)姜酚提取得率的影響

由圖1A可知，在一定的料液比范圍內(nèi)，隨著料液比的增加，姜酚的溶解度也隨之增大，從而使得總多酚含量也隨之增加，在料液比1:25的條件下，總多酚得率達(dá)到最高，再隨著料液比的增加，多酚可能由于雜質(zhì)的析出而溶解度下降，從而使得得率也相應(yīng)下降，因此在料液比1:25的條件下，提取率相對(duì)最高。

圖1 提取條件單因素試驗(yàn)結(jié)果

②研究提取時(shí)間對(duì)姜酚提取得率的影響

由圖1B可知，隨著提取時(shí)間的增加，總多酚含量呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)，在時(shí)間20min達(dá)到最高點(diǎn)，而時(shí)間超過(guò)20min之后，超聲波的作用也會(huì)破壞姜酚中的一些不穩(wěn)定成分，從而降低總多酚的含量。

③研究提取溫度對(duì)姜酚提取得率的影響

如圖1C所示，為了避免多酚成分在高溫作用下氧化破化，選擇溫度在30～70℃下提取，通過(guò)溫度變化可以發(fā)現(xiàn)，溫度在50℃提取條件下，更加有利于多酚成分的釋放，同時(shí)也避免了多酚成分的破化，從而在50℃下，提取率達(dá)到最高。

④研究乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)姜酚提取得率的影響

如圖1D所示，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的變化，姜酚提取得率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加先增加后下降，當(dāng)乙醇體積濃度為75%時(shí)，姜酚提取得率相對(duì)最高。而當(dāng)乙醇體積濃度超過(guò)75%后，可能由于生姜細(xì)胞中的色素、雜質(zhì)等脂溶性成分的溶出量增加，導(dǎo)致多酚的溶解度下降。因此選擇乙醇體積濃度75%較為合適。

(2)響應(yīng)面結(jié)果與分析

①響應(yīng)面數(shù)據(jù)處理

響應(yīng)面數(shù)據(jù)結(jié)果如表2所示，以料液比A，時(shí)間B，乙醇體積分?jǐn)?shù)C為自變量，以姜酚得率Y為響應(yīng)值，通過(guò)軟件進(jìn)行多元回歸方程擬合發(fā)現(xiàn)：得到自變量與因變量的回歸方程：Y=0.53-0.084×A-0.059×B-0.041×C-0.041×A×B-0.059×A×C-0.012×B×C-0.18×A2-0.19×B2-0.19×C2，同時(shí)由表3所知，回歸模型的P值小于0.01，說(shuō)明該模型具有顯著性，一次項(xiàng)中的A料液比總多酚得率有顯著影響；二次項(xiàng)A^2、B^2、C^2影響極顯著；各因素對(duì)得率的影響大小為料液比＞提取時(shí)間＞乙醇體積分?jǐn)?shù)。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

表3 響應(yīng)面回歸模型方差分析

續(xù)表

②各因素交互作用分析及驗(yàn)證

由圖2～圖4可知，沿著曲線上各因素的坡度的變化和等高線密度變疏，等高線呈圓型，因此各因素交互關(guān)系不顯著。同時(shí)預(yù)測(cè)最佳參數(shù)：料液比1:30，提取時(shí)間20min，乙醇體積分?jǐn)?shù)65%，提取率為1.0%；為考察結(jié)果的準(zhǔn)確性進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，選擇料液比:1:30，提取時(shí)間20min，乙醇體積分?jǐn)?shù)65%，多酚成分實(shí)際提取率為（0.98±0.02%），與預(yù)測(cè)值接近，在該試驗(yàn)?zāi)Ｐ拖碌玫降淖罴压に嚄l件具有一定的參考價(jià)值，有待于進(jìn)一步工藝生產(chǎn)放大驗(yàn)證。

圖2 料液比與時(shí)間的交互作用

圖3 料液比與乙醇體積分?jǐn)?shù)的交互作用

圖4 乙醇體積分?jǐn)?shù)與時(shí)間的交互作用

3.結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以姜酚得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)得到，當(dāng)料液比為1:25，提取時(shí)間為20min，提取溫度為50℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)為75%，超聲提取功率為90%（342W）的條件下，總多酚的提取得率達(dá)到最高1.52±0.05%，同時(shí)運(yùn)用響應(yīng)面優(yōu)化三因素（料液比，乙醇體積分?jǐn)?shù)，提取時(shí)間）對(duì)姜根多酚提取率的影響力依次為料液比＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞提取時(shí)間，結(jié)合軟件分析，并對(duì)二次多項(xiàng)回歸方程模型的最佳條件進(jìn)行驗(yàn)證，在實(shí)際操作時(shí)，將各工藝參數(shù)修正為：乙醇體積分?jǐn)?shù)65%，料液比1:3，提取時(shí)間為20min。通過(guò)試驗(yàn)驗(yàn)證得到總多酚提取率為（0.98±0.02%），實(shí)際值與預(yù)測(cè)值十分接近，模型建立基本成功。