人乳牙牙髓干細胞膜片在組織工程牙髓再生中的實驗研究

謝 娜，陸 磊，姬小婷，王丹楊，唐成芳，李子夏，胡 妍，李 旋

（1.西安醫(yī)學院口腔醫(yī)學院 陜西 西安 710021；2.陜西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院口腔科 陜西 咸陽 712000）

牙髓再生是目前牙齒組織再生中最具挑戰(zhàn)性的課題之一，這是由于牙髓組織穩(wěn)定的內(nèi)部結(jié)構(gòu)和自身有限的修復能力所致。隨著現(xiàn)代組織工程技術(shù)的發(fā)展和各種干細胞的發(fā)現(xiàn)將為年輕恒牙牙髓壞死的治療開辟新的研究領(lǐng)域[1]。本實驗中利用人乳牙牙髓干細胞（Stem cells derived from exfoliated deciduous teeth，SHED）、生物支架材料聚乙丙交酯（PLGA）、人乳牙牙髓干細胞膜片以及處理過的牙本質(zhì)基質(zhì)片段在裸鼠體內(nèi)進行牙髓再生的實驗研究，以期構(gòu)建出一種適合臨床應用的牙髓再生策略，為年輕恒牙發(fā)生牙髓壞死的生物學治療提供新的參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物：BALB/c裸鼠（上海斯萊克實驗動物有限公司購買，西安交通大學醫(yī)學院動物房飼養(yǎng)）。

1.2 試劑和器材

1.2.1 主要試劑：DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清（Hyclone，北京）；Ⅰ型膠原酶、Dispase酶（Gibco，美國）；DSPP單克隆抗體（Santa，美國）；PLGA（濟南岱罡生物科技有限公司，山東）。

1.2.2 主要儀器：細胞培養(yǎng)箱（Thermo，美國）；酶聯(lián)檢測儀（Amersham Biosciences，瑞典）；Motic Med 6.0數(shù)碼醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)（廈門麥克奧迪有限責任公司，福建）。

1.3 實驗方法

1.3.1 人乳牙牙髓細胞的獲取、培養(yǎng)和純化：選取臨床中需要拔除的6～8歲兒童滯留的乳前牙（經(jīng)倫理審批會審批，拔除前患者簽署知情同意書），在超凈臺內(nèi)用PBS液沖洗后拔除牙髓組織，浸泡于1:1混合的Ⅰ型膠原酶和Dispase酶中。將牙髓組織剪成0.5～1 mm3大小的組織塊，5% CO2、37℃的細胞培養(yǎng)箱中孵育45～60 min。待組織塊完全消化、溶解后轉(zhuǎn)移至離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清，用含15%胎牛血清的DMEM/F12（培養(yǎng)基中加入100 U/ml青霉素，100 μg/ml鏈霉素和2 mM的L-谷氨酰胺）培養(yǎng)基重懸細胞，隨后移至60 mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。有限稀釋法對所培養(yǎng)的細胞進行克隆純化。

1.3.2 牙本質(zhì)基質(zhì)片段的制備

1.3.2.1 實驗材料獲?。簩嶒炈璧难辣举|(zhì)片段來源于臨床上5～12歲患者所拔除的多生牙（經(jīng)倫理審批會審批，拔除前患者簽署知情同意書）。

1.3.2.2 制備實驗所需的牙本質(zhì)基質(zhì)片段：去除牙齒表面的牙周組織，以根尖處為起點，截取長度約為6～7 mm的牙根，拔除根管內(nèi)的牙髓組織，均勻磨除根管內(nèi)壁的部分前期牙本質(zhì)，擴大根管直徑為1～2.5 mm。根管一端用MTA封閉1 mm，另外一端不做任何處理。將所制備的牙本質(zhì)片段分別放入17% EDTA、19%檸檬酸、碘伏和5.25%次氯酸鈉溶液中處理，用PBS漂洗數(shù)次后，置于無菌PBS液中，37℃的條件下浸泡3～7 d。4℃儲存于DMEM/F12的培養(yǎng)基中備用[2]。

1.3.3 人乳牙牙髓干細胞膜片的培養(yǎng)：取第3代SHED，調(diào)整細胞濃度為1×105個/毫升，用含10% FBS、100 μmol/L的L-抗壞血酸-2-磷酸鹽、2 mmol/ml的L-谷氨酰胺的DMEM/F12培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)14 d。動物實驗前棄去培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，用探針和眼科鑷沿著培養(yǎng)皿的邊緣將所培養(yǎng)的細胞膜片緩慢的從培養(yǎng)皿底部剝離，將剝離后的SHED細胞膜片小心折疊為長約4～5 mm，直徑約為1～2 mm的圓柱體，再置于所制備的牙本質(zhì)基質(zhì)片段的根管內(nèi)，將負載細胞膜片的牙本質(zhì)基質(zhì)片段迅速的置入培養(yǎng)皿中，加入培養(yǎng)基后在37℃、5% CO2細胞孵育箱內(nèi)繼續(xù)孵育3 h，用于后續(xù)的動物實驗。

1.3.4 細胞-支架材料復合物的制備：取生長狀態(tài)良好的第三代SHED，待其融合至培養(yǎng)皿底的80%～90%時，更換為礦化誘導液，體外連續(xù)誘導7 d后胰蛋白酶消化3～5 min，1 000 r/min離心5 min，用不含胎牛血清的礦化誘導液吹打細胞沉淀，制備成單細胞懸液，調(diào)整細胞密度為1×107個/毫升，按此密度將50 μl的細胞懸液接種至已滅菌消毒過的大小為1.5～2.0 mm3的支架材料PLGA上，將細胞-材料復合物置入預先制備的牙本質(zhì)基質(zhì)片段中，再將其轉(zhuǎn)移至37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育3 h，用于后續(xù)的動物實驗。

1.3.5 實驗分組：分為5組，空白對照組（單純牙本質(zhì)基質(zhì)片段組）、陰性對照組（負載支架材料的牙本質(zhì)基質(zhì)片段組）、SHED-PLGA組（負載細胞-支架材料復合物的牙本質(zhì)基質(zhì)片段組）、SHED細胞膜片組（負載細胞膜片的牙本質(zhì)基質(zhì)片段組）和陽性對照組（臨床上拔除的多生牙，其未作任何處理）。

1.3.6 裸鼠體內(nèi)異位移植實驗：取4周齡雄性裸鼠6只，腹腔麻醉后，在其背部皮膚處剪開約10 mm的切口，制備皮下袋，左右兩側(cè)相對應的部位分別隨機植入不同的實驗組。裸鼠皮下異位移植12周后，取出裸鼠背部皮下組織中植入的復合物，固定、脫鈣、包埋、切片，進行HE染色和DSPP免疫組織化學法染色。

1.3.7 灰度掃描：利用Motic Med 6.0數(shù)碼醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)對免疫組化染色結(jié)果進行灰度掃描，將所得數(shù)據(jù)與陰性對照組的灰度值相比后，對所得數(shù)據(jù)利用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件進行分析。

2 結(jié)果

2.1 人乳牙牙髓細胞的培養(yǎng)：采用酶解組織塊法對人乳牙牙髓細胞進行原代培養(yǎng)，一般培養(yǎng)24 h后就可觀察到細胞的偽足已經(jīng)開始逐漸伸展（見圖1A），3～5 d后偽足基本上已經(jīng)全部伸展開。大多數(shù)完全伸展開的人乳牙牙髓細胞呈長梭狀，類似于成纖維細胞的形狀，少數(shù)人乳牙牙髓細胞為多角形、橢圓形或者呈現(xiàn)出紡錘形（見圖1B）。

圖1 倒置相差顯微鏡下觀察人乳牙牙髓細胞（100×）

2.2 SHED細胞膜片的培養(yǎng)：生長狀態(tài)良好的第3代SHED用含維生素C的DMEM/F12培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)7～10 d后，在培養(yǎng)皿的底部，肉眼可見一層成絨狀的白色薄膜，薄膜與培養(yǎng)皿底部緊密貼附，在培養(yǎng)皿邊緣處的薄膜有輕微的卷曲，晃動或倒置后薄膜均不會發(fā)生脫落，此層薄膜即為細胞膜片。倒置顯微鏡下觀察可見細胞彼此間連接緊密呈長梭形，并呈重疊的復層（見圖2A），細胞繼續(xù)培養(yǎng)至14 d時，用探針和眼科鑷沿著培養(yǎng)皿的邊緣將所培養(yǎng)的細胞膜片緩慢的從培養(yǎng)皿底部剝離，所得的膜片出現(xiàn)皺縮，呈現(xiàn)為乳白色的膜狀物，具有一定的厚度和強度（見圖2B）。

圖2 培養(yǎng)的SHED細胞膜片

2.3 裸鼠體內(nèi)的異位移植

2.3.1 取4周齡的雄性裸鼠6只，用4%的水合氯醛腹腔麻醉后，分別將體外所構(gòu)建的牙本質(zhì)基質(zhì)片段移植入裸鼠的背部所制備的皮下袋中，嚴密縫合（見圖3）。

圖3 裸鼠皮下移植實驗

2.3.2 HE染色：空白對照組的根管內(nèi)未見牙髓樣組織生成，僅有裸鼠背部的修復性組織長入，長入的組織中含有完整的血管樣結(jié)構(gòu)（見圖4A～B）；陰性對照組的根管內(nèi)也未見有牙髓樣組織生成，除了長入的裸鼠背部的修復性組織之外，還在根管內(nèi)見到一些未完全降解的支架材料（見圖4C～D）；SHED-PLGA組在根管內(nèi)可見疏松的牙髓樣組織生成，其間有血管穿行，還可見到少量的尚未完全降解的支架材料，原有牙本質(zhì)根管壁最內(nèi)側(cè)有一層不連續(xù)的成牙本質(zhì)細胞樣細胞生成，細胞呈單層排列，并且有少量粉染的牙本質(zhì)基質(zhì)形成，甚至還可見一些成牙本質(zhì)細胞樣細胞突起伸入到新形成的牙本質(zhì)基質(zhì)中（見圖4E～F）；SHED細胞膜片組在根管內(nèi)也可見一些牙髓樣組織生成，其組織密度介于陽性對照組和SHED-PLGA組之間，血管穿行于其中，在根管壁的最內(nèi)側(cè)也可見到不連續(xù)的單層成牙本質(zhì)細胞樣細胞生成，在新生成細胞的牙本質(zhì)側(cè)形成了牙本質(zhì)基質(zhì)，有成牙本質(zhì)細胞樣細胞的突起伸入到新形成的牙本質(zhì)基質(zhì)中（見圖4G～H）；陽性對照組可見大片呈紅染的牙本質(zhì)，根管內(nèi)的牙髓組織較致密，其中包含完整的血管，在牙本質(zhì)最內(nèi)層有一層淺染的尚未礦化的前期牙本質(zhì)層，緊貼著前期牙本質(zhì)層有復層排列的柱形成牙本質(zhì)細胞，其細胞頂端有細長的突起深入到牙本質(zhì)基質(zhì)內(nèi)（見圖4I～J）。

圖4 HE染色結(jié)果

2.3.3 牙本質(zhì)涎磷蛋白免疫組化染色：對各組樣本進行牙本質(zhì)涎磷蛋白免疫組化染色，可見陽性對照組前期牙本質(zhì)對牙本質(zhì)涎磷蛋白呈陽性表達，組織染色后為棕黃色；成牙本質(zhì)細胞對牙本質(zhì)涎磷蛋白也同樣呈陽性表達：細胞的胞漿為棕黃色著色，胞核復染后為藍色；SHED-PLGA組和SHED細胞膜片組均可見新生的成牙本質(zhì)細胞樣細胞和牙本質(zhì)基質(zhì)對牙本質(zhì)涎磷蛋白呈陽性表達，這與陽性對照組的染色結(jié)果一致；空白對照組和陰性對照組可見根管內(nèi)新生成的組織對牙本質(zhì)涎磷蛋白呈陰性表達：細胞的胞漿未見明顯著色，胞核復染后為藍色（見圖5）。

圖5 DSPP免疫組織化學法染色結(jié)果

2.3.4 灰度掃描結(jié)果分析：利用Motic Med 6.0數(shù)碼醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)對DSPP免疫組化染色結(jié)果進行灰度掃描，將SHED細胞膜片組、SHED-PLGA組和陽性對照組的灰度值與陰性對照組的灰度值進行比較后，對所得的結(jié)果利用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件采用單因素方差分析后可知SHED細胞膜片組的組織生成量明顯的多于SHED-PLGA組，組間比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖6。

圖6 DSPP免疫組化灰度掃描分析

3 討論

利用組織工程技術(shù)進行牙髓再生的實驗研究中，尋找合適的種子細胞是首先要解決的問題之一。牙源性干細胞與其他組織來源的干細胞一樣，都具有自我更新和多向分化的特性，因此可作為種子細胞應用于牙髓再生的實驗研究中。兒童脫落的乳牙屬于廢棄的組織，因而較少涉及倫理以及道德等方面的問題，且乳牙具有取材簡便、對供體的損傷較少、不容易污染、便于實現(xiàn)后期自體移植等方面的優(yōu)點，在臨床應用中的前景十分廣闊[3-4]。因此，本實驗選用人乳牙牙髓細胞作為種子細胞，探討其在牙髓再生應用中的可行性。

牙本質(zhì)基質(zhì)片段作為一種純天然的多孔支架材料，本身含有多種有機成分，如胰島素樣生長因子（Insulin-like growth factor，IGF）、轉(zhuǎn)化生長因子（Transforming growth factor-β，TGF-β）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白（Bone morphogenic proteins，BMP）等，這些生長因子作為牙本質(zhì)和牙髓組織修復過程中的重要信號分子，在組織的生理再生過程中發(fā)揮著非常重要的作用，因此它與其它化學合成的支架材料相比具有一定的優(yōu)越性，被廣泛的應用于組織工程牙髓再生的實驗研究之中[5-6]。

然而無論使用任何支架材料作為種子細胞的載體，細胞和支架材料負載的過程中都存在著以下的問題[7-8]：①細胞外基質(zhì)（Extracellular matrix，ECM）存在的多種細胞生長因子以及蛋白會因為胰蛋白酶消化獲取種子細胞的過程中大量破壞，進而會嚴重影響細胞的生物學行為；②細胞與支架材料復合的過程中，接種在支架材料上的細胞密度有限，也會影響組織的再生能力；③可降解的支架材料在降解的過程中會遺留有一定的空隙，進而會影響組織再生的范圍；④支架材料在體內(nèi)有可能會和機體發(fā)生炎癥反應。

由于這些問題的存在，具有一定三維立體結(jié)構(gòu)的細胞膜片技術(shù)被廣泛的應用于組織工程的研究之中。細胞膜片最早由Okano等[9]發(fā)現(xiàn)以來，因其能最大限度的保護細胞膜表面的相關(guān)蛋白、細胞間相互連接以及細胞-細胞外基質(zhì)連接等結(jié)構(gòu)，因此受到廣大學者們的關(guān)注。細胞膜片是采用高密度濃度接種細胞、成膜誘導液以及結(jié)合相關(guān)物理化學手段，從而構(gòu)建一種富含細胞外基質(zhì)并且具備一定可操作性以及兼?zhèn)錂C械強度的細胞膜片結(jié)構(gòu)[10-11]。本實驗中采用Yang等[2]的培養(yǎng)方法，在培養(yǎng)基中加入了適量的維生素C和L-谷氨酰胺，成功誘導形成了SHED細胞膜片。

裸鼠背部皮下組織中異位移植12周后，經(jīng)HE染色以及DSPP免疫組化實驗發(fā)現(xiàn)：SHED細胞膜片組和SHED-PLGA組均在多生牙的根管內(nèi)生成了包含完整血管的牙髓樣組織，并且在原有的牙本質(zhì)壁上還形成了一層不連續(xù)的鈣化牙本質(zhì)基質(zhì)，緊貼著新生成鈣化組織的內(nèi)側(cè)有一層成牙本質(zhì)細胞樣細胞生成。DSPP免疫組化的灰度掃描分析提示：SHED細胞膜片組與SHED-PLGA組相比，可以新生出更多成牙本質(zhì)細胞樣細胞并且分泌出更多的牙本質(zhì)基質(zhì)。

究其原因，這可能與細胞膜片本身所具備的特點有關(guān)[12]：①細胞膜片是由種子細胞自身產(chǎn)生的ECM所形成的膜片狀物質(zhì)，種子細胞在體外通過條件誘導液誘導后可以在短時間內(nèi)促使細胞分泌大量的細胞外基質(zhì)，從而將細胞與細胞之間緊密連接之后形成一種三維立體的膜片狀結(jié)構(gòu)，不需要經(jīng)過胰蛋白酶消化后獲取種子細胞，因此對種子細胞損傷較??；②細胞膜片可維持細胞之間正常的連接，并可最大限度地保持細胞外基質(zhì)的完整性，膜片本身富含大量的細胞外基質(zhì)可誘導SHED分化為牙本質(zhì)細胞樣細胞，從而分泌大量的牙本質(zhì)基質(zhì)，并進一步礦化為牙本質(zhì)樣組織，因此細胞膜片對于組織工程牙髓再生起到了極其重要作用[13-15]。

但是，SHED細胞膜片組新生成的組織并沒有達到整個根管充滿，推測這主要與細胞膜片在折疊后沒有具備一定的孔隙結(jié)構(gòu)，因而會對新生成組織的血供產(chǎn)生一定的影響，進而限制了組織的進一步生成。在后續(xù)的實驗中考慮是否可以將所培養(yǎng)的細胞膜片包裹于支架材料上，這樣既解決了種子細胞獲取過程中的損傷問題，又為細胞的生長提供了一定的空隙，從而為新形成的組織提供必要的條件。

人乳牙牙髓干細胞是牙科再生醫(yī)學研究領(lǐng)域中極具潛力的牙源性的成體干細胞之一，因此對其的研究具有十分廣泛的意義。目前，對于發(fā)生牙髓疾病的生物學治療的最終目標是要生成具有活力的牙髓組織。因此，隨著組織工程學的不斷發(fā)展，在高效的誘導分子調(diào)控機制作用下，在不久的將來，希望可以利用人乳牙牙髓干細胞和適合的生物支架材料再生出具有活力的牙髓組織，并將其廣泛的應用于臨床治療年輕恒牙發(fā)生牙髓壞死的患者之中，為廣大患者帶來福音。