氧化應(yīng)激在糖尿病性角膜病變中的研究進(jìn)展

黃鈺清，楊燕寧

references for clinical diagnosis and treatment of DK.

0引言

根據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟(IDF)的最新統(tǒng)計(jì),全球現(xiàn)有約4.64億糖尿病(diabetes mellitus，DM)患者，患病人數(shù)約占全球成年人口的9.3%，其中中國約有1.164億患者，數(shù)量位居世界第一[1]。以糖尿病視網(wǎng)膜病變、并發(fā)性白內(nèi)障、糖尿病性角膜病變(diabetic keratopathy, DK)為代表的DM眼部并發(fā)癥嚴(yán)重影響患者視力，降低患者生活水平，是眼科醫(yī)生一直較為關(guān)注的領(lǐng)域。氧化應(yīng)激(oxidative stress，OS)是指細(xì)胞內(nèi)促氧化和抗氧化平衡失調(diào)，導(dǎo)致氧化作用增強(qiáng)的一種氧化還原狀態(tài)，它參與眾多疾病的發(fā)生發(fā)展。OS在DM眼部并發(fā)癥的作用既往已有較多研究，但主要集中在糖尿病視網(wǎng)膜病變，隨著DK發(fā)病率上升日益受到重視，OS反應(yīng)在DK中的作用愈顯重要，本文對(duì)此項(xiàng)研究進(jìn)行綜述。

1 DK的病理表現(xiàn)和發(fā)病機(jī)制

DK一般表現(xiàn)為眼部外傷或術(shù)后持續(xù)性角膜上皮缺損、愈合延遲、淺層點(diǎn)狀角膜炎，逐步發(fā)展為角膜潰瘍[2]，而這些體征均源于高糖對(duì)角膜各層組織細(xì)胞的損害。其病理表現(xiàn)主要包括[3-4]：(1)上皮細(xì)胞增殖和遷移受到影響，細(xì)胞間的黏附下降；(2)上皮基底膜增厚，其間的半橋粒數(shù)目減少伴有晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)的沉積；(3)角膜基質(zhì)中的錨原纖維組織減少，導(dǎo)致其與基底膜之間的連結(jié)變松；(4)角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度降低，形態(tài)異常；(5)角膜基底神經(jīng)叢纖維長(zhǎng)度變短、纖維密度以及分支數(shù)量均減少。DK的發(fā)病機(jī)制主要包括三大類：(1)糖基化終末產(chǎn)物的沉積；(2)有關(guān)上皮修復(fù)信號(hào)通路活化的抑制；(3)氧化應(yīng)激反應(yīng)。這三類分子機(jī)制并非獨(dú)立參與DK的發(fā)生，而是共同作用進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡、細(xì)胞壞死、激發(fā)炎癥反應(yīng)，最終損害角膜。

2 OS與DM

OS是指活性氧(reactive oxygen specices, ROS)和活性氮(reactive nitrogen specices，RNS)的產(chǎn)生與機(jī)體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)的清除相失衡，造成ROS和RNS過多，進(jìn)而對(duì)機(jī)體組織細(xì)胞產(chǎn)生損害。有研究證明[5]免疫細(xì)胞在病原體防御中發(fā)揮吞噬作用時(shí)，ROS起著至關(guān)重要的作用，這說明輕度OS對(duì)機(jī)體新陳代謝有積極影響，產(chǎn)生了一定的保護(hù)作用。然而ROS、RNS的產(chǎn)生與機(jī)體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)的清除平衡一旦被打破，過量的ROS不僅會(huì)損傷組織細(xì)胞的核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子，還會(huì)引起機(jī)體代謝途徑異常，導(dǎo)致一系列疾病的發(fā)生。既往研究表明[6-7]，OS與癌癥、帕金森病、阿爾茨海默癥、動(dòng)脈粥樣硬化、心力衰竭等多種疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，同時(shí)也在DM相關(guān)并發(fā)癥中起重要作用。DM患者血液中持續(xù)的高血糖水平會(huì)通過增加線粒體氧耗量損傷線粒體功能，導(dǎo)致線粒體功能障礙，還因激活NADH/NADPH氧化酶從而上調(diào)ROS水平，同時(shí)增強(qiáng)一氧化氮合酶(NOS)活性導(dǎo)致一氧化碳(NO)合成增加以及抗氧化劑(例如超氧化物歧化酶、谷胱甘肽和多種維生素)表達(dá)降低，進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體組織細(xì)胞氧化還原狀態(tài)失衡[8-11]。

3 OS與DK

DK的發(fā)病是一個(gè)復(fù)雜的過程，而OS貫穿其中。慢性的高糖狀態(tài)會(huì)從多個(gè)方面影響角膜組織細(xì)胞包括角膜神經(jīng)的正常生理狀態(tài)。例如AGEs的沉積、炎性反應(yīng)激活、線粒體功能障礙等，然而這多個(gè)途徑最終匯集于一點(diǎn)及ROS/RNS的增多及OS反應(yīng)，OS會(huì)引起脂質(zhì)過氧化、蛋白修飾、DNA損傷進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡、壞死、角膜神經(jīng)節(jié)段性脫髓鞘、軸突變性、角膜神經(jīng)功能障礙最終引起DK[12]。下文將分述OS如何與DK發(fā)病機(jī)制中的各重要物質(zhì)相互作用。

3.1OS與AGEs在DK中的相互作用AGEs是一組在蛋白質(zhì)、脂肪酸或核酸的氨基基團(tuán)與還原糖的醛基之間發(fā)生非酶性糖基化反應(yīng)(又稱Maillard反應(yīng))所形成的一系列具有高度活性終產(chǎn)物的總稱，其結(jié)構(gòu)具有高度異質(zhì)性，最早由Maillard于1912年發(fā)現(xiàn)[13]。糖尿病患者在長(zhǎng)期高糖狀態(tài)下體內(nèi)合成過量AGEs蓄積在角膜各層，通過與糖基化終末受體(receptor for advanced glycation end products，RAEG)的相互作用激活NADPH氧化酶，導(dǎo)致氧自由基的形成影響下游多條代謝通路，同時(shí)過量的ROS產(chǎn)生誘導(dǎo)RAGE表達(dá)，從而啟動(dòng)正反饋循環(huán)，加劇氧化應(yīng)激和炎癥的惡性循環(huán)[14]。AGEs與RAGE結(jié)合還導(dǎo)致MAPK、JAK/STAT等信號(hào)通路的激活，增加單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1, MCP-1)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6, IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor, TNF-α)和血管細(xì)胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1, VCAM-1)的表達(dá)，引起炎性反應(yīng)。RAGE的激活也可導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和細(xì)胞凋亡[15-17]。有研究表明，通過抑制AGEs可以降低OS反應(yīng)，對(duì)組織起到保護(hù)作用。Kim等[18]團(tuán)隊(duì)將一種四味草藥提取物制成的藥物KIOM-79通過口服用于2型糖尿病大鼠模型，13wk后發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組小鼠角膜厚度和細(xì)胞凋亡程度明顯低于對(duì)照組，且各層角膜組織AGEs的積累減少。此外，通過對(duì)相關(guān)標(biāo)記物的檢測(cè)，其團(tuán)隊(duì)還發(fā)現(xiàn)KIOM-79減弱了角膜中的氧化性DNA損傷、NF-κB激活和Bax過表達(dá)，說明其通過抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)對(duì)角膜起到了保護(hù)性作用。大量報(bào)道顯示[19]，許多類型的天然化合物，如多酚、多糖、萜類、維生素和生物堿，都是抑制AGEs形成的良好候選者。這些化合物通過清除自由基、螯合金屬離子、捕獲活性羰基化合物、覆蓋蛋白質(zhì)的糖化位點(diǎn)和降低血糖水平來阻止AGEs的形成。

3.2OS與沉默信息調(diào)節(jié)因子1在DK間的相互作用沉默信息調(diào)節(jié)因子1(SIRT1)是一種具有代表性的組蛋白脫乙酰酶，作為Sirtuin蛋白家族的一員，其酶活性依賴于NAD+作為輔助因子。SIRT1通過組蛋白修飾控制基因表達(dá)、DNA修復(fù)、代謝、氧化應(yīng)激反應(yīng)、線粒體功能等來調(diào)節(jié)多種細(xì)胞活動(dòng)[20]。SIRT1調(diào)控氧化應(yīng)激的機(jī)制主要包括：(1)通過去乙酰化激活過氧化物增殖子激活-受體因子γ輔激活因子(peroxisome proliferator-activated receptorcoactivator-1，PGC-1α)的基因轉(zhuǎn)錄，并通過調(diào)節(jié)核受體過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)、核呼吸因子(NRF)和線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(TFAM)等基因的轉(zhuǎn)錄，參與調(diào)節(jié)線粒體功能[21]以及葡萄糖和脂質(zhì)的代謝[22]。(2)SIRT1調(diào)節(jié)抗氧化劑如超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶的表達(dá)[23]。此外，由于線粒體功能障礙會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，SIRT1可以通過介導(dǎo)PGC-1α的乙酰化直接調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡過程[24]。SIRT1還通過調(diào)控NF-κB p65的乙?；娇刂蒲装Y反應(yīng)，同時(shí)調(diào)控炎癥因子相關(guān)基因的表達(dá)：如白細(xì)胞介素(IL)-1、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、IL-8、IL-6等[21-22,25]。近年來，關(guān)于SIRT1對(duì)DK作用機(jī)制的研究逐漸增多，且OS是不可或缺的一環(huán)。Wei等[26]研究發(fā)現(xiàn)在1型DM小鼠模型中，SIRT1的下調(diào)可促進(jìn)ROS的產(chǎn)生、抑制角膜上皮細(xì)胞活性促進(jìn)細(xì)胞凋亡，可望通過調(diào)節(jié)SIRT1的表達(dá)影響細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激進(jìn)而起到對(duì)DK的保護(hù)作用；Liu等[27]通過建立DM相關(guān)干眼小鼠模型觀察到相對(duì)于普通干眼對(duì)照組，OS反應(yīng)顯著增強(qiáng)伴SIRT1表達(dá)下降；Li等[28]發(fā)現(xiàn)NAD+含量和NAMPT表達(dá)在1型DM小鼠和2型DM患者中均下降，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明體外補(bǔ)充NAD+可恢復(fù)角膜上皮細(xì)胞增殖和遷移的能力，此外，在DM小鼠中，NAD+及其前體煙酰胺單核苷酸(nicotinamide mononucleotide, NMN)和煙酰胺核糖苷(nicotinamide riboside, NR)也促進(jìn)角膜上皮和神經(jīng)再生，同時(shí)還伴有SIRT1、磷酸化的上皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)以及AKT和ERK1/2的表達(dá)增加。

3.3OS與炎性反應(yīng)在DK中的相互作用炎癥是機(jī)體對(duì)病原體入侵、組織損傷和刺激物等各種病理過程的重要生理反應(yīng)。慢性炎癥主要通過自由基的持續(xù)和過量產(chǎn)生以及抗氧化劑的消耗導(dǎo)致細(xì)胞損傷[29]。ROS可以刺激核因子-κB(NF-κB)和激活蛋白-1(AP-1)等轉(zhuǎn)錄因子，增加促炎細(xì)胞因子的表達(dá)。因此，有理由認(rèn)為靶向氧化應(yīng)激-炎癥細(xì)胞因子信號(hào)通路可能是治療糖尿病并發(fā)癥的潛在策略[30]。人高遷移率族蛋白B1(high-mobility group box 1 protein, HMGB1)是一種在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起重要作用的非組蛋白核蛋白[31]，HMGB1是介導(dǎo)糖尿病并發(fā)癥一關(guān)鍵的炎癥介質(zhì)。它通過與晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation endproducts，RAGE)、Toll樣受體(TLR2和TLR4)結(jié)合激活NF-κB,進(jìn)而導(dǎo)致促炎因子、黏附分子和血管生成因子的上調(diào)。Hou等[32]研究表明，HMGB1及其相關(guān)受體與DK的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示RAGE和TLR4(HMGB1受體)以及HMGB1相關(guān)信號(hào)通路也可能參與糖尿病角膜傷口和神經(jīng)愈合。促炎性HMGB1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑主要通過其兩個(gè)受體TLR和RAGE進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)，最終增加NF-κB的活化和促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，包括TNF-α，IL-1β和IL-6。NF-κB的激活和促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生反過來又可以誘導(dǎo)HMGB1及其受體的表達(dá)，從而導(dǎo)致過度和持續(xù)的炎癥反應(yīng)正反饋循環(huán)。給予外源性HMGB1肽可以明顯抑制糖尿病眼損傷后角膜上皮/角膜神經(jīng)的恢復(fù)，而甘草酸二鉀(dipotassium glycyrrhizinate，DG)(HMGB1抑制劑)治療可以顯著加速這種恢復(fù)過程。HMGB1的兩個(gè)受體RAGE和TLR4也被發(fā)現(xiàn)參與糖尿病患者角膜上皮/角膜神經(jīng)愈合過程。這些結(jié)果表明HMGB1信號(hào)通路在DK的發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用，有望通過對(duì)HMGB1的抑制調(diào)控炎癥反應(yīng)進(jìn)而治療DK并促進(jìn)角膜神經(jīng)修復(fù)。

3.4OS與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在DK中的相互作用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)是一種專職于蛋白質(zhì)折疊和運(yùn)輸?shù)募?xì)胞器，對(duì)細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞外刺激的變化高度敏感。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress, ERS)主要是由ROS積累、毒性物質(zhì)、基因突變等引起應(yīng)激反應(yīng)，其應(yīng)激原主要來自細(xì)胞內(nèi)部環(huán)境改變，包括蛋白錯(cuò)誤折疊、鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)、未折疊蛋白聚集等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂[33]。研究發(fā)現(xiàn)ERS和OS存在相互作用：OS可誘導(dǎo)ERS,相反ERS也可以促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)ROS生成。正常狀態(tài)下,細(xì)胞內(nèi)部分ROS來源于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的氧化蛋白折疊過程中二硫鍵的形成,該過程中蛋白二硫化異構(gòu)酶(protein disulphide isomerase, PDI)通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化酶1α(endoplasmic reticulum oxidase, ERO1α)轉(zhuǎn)移電子給分子氧,相繼生成了副產(chǎn)物過氧化氫[34]。高糖狀態(tài)可誘發(fā)ERS,上調(diào)的PDI和ERO1α可導(dǎo)致大量過氧化氫形成,同時(shí)細(xì)胞代償功能有限，生成的還原性谷胱甘肽不足以中和超量的過氧化氫,繼而引起OS損傷。伴隨著細(xì)胞內(nèi)線粒體裂解和鈣超載,ERO1α介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子的釋放,亦可引起線粒體超氧化物的生成[35-36]。Wang等[37]的研究發(fā)現(xiàn)，中腦星形膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(MANF)在小鼠和人的角膜廣泛存在，其促進(jìn)糖尿病患者角膜上皮修復(fù)和神經(jīng)再生。主要機(jī)制是通過調(diào)控Akt信號(hào)通路抑制了高糖環(huán)境所致的細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及ERS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，MANF有望在改善DK患者角膜上皮延遲愈合和神經(jīng)損傷再生中扮演重要角色。

4 DK氧化應(yīng)激的治療

4.1甘草酸甘草酸(glycyrrhizin，GLY)是一種從甘草根中提取的皂苷類物質(zhì)，具有抗炎等多種藥理作用，其已被證明對(duì)敗血癥、結(jié)腸炎腦損傷、角膜炎的動(dòng)物模型有效[38-40]，在臨床上已被用于治療慢性肝炎患者。Somayajulu等[41]將GLY作用于高糖培養(yǎng)的小鼠角膜上皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其具有一定的保護(hù)作用，且降低了促炎癥反應(yīng)和OS標(biāo)志物如HMGB1、IL-1b、TLR2、TLR4、NOD樣受體蛋白3炎癥小體(NOD-, LRR-and pyrin domain-containing protein 3，NLRP3)、環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase2, COX2)、超氧化物歧化酶-2(superoxide dismutase 2，SOD2)血紅素氧合酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)、谷胱甘肽過氧化酶2(glutathione peroxidase 2，GPX2)的表達(dá)量。另外該團(tuán)隊(duì)在糖尿病小鼠模型的飲水中給予GLY，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比除了上述標(biāo)志物，C-X-C型趨化因子配體2(C-X-C motif chemokine ligand 2，CXCL2)和誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)表達(dá)也下降，這進(jìn)一步說明GLY對(duì)高糖所致的OS具有保護(hù)作用。

4.2色素上皮衍生因子色素上皮衍生因子(PEDF)主要由視網(wǎng)膜色素上皮合成，是一種50kDa的分泌蛋白，屬于非抑制性絲氨酸蛋白酶抑制劑超家族的一員[42]。它也存在于角膜、結(jié)膜和睫狀體上皮細(xì)胞、穆勒神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、視網(wǎng)膜星形膠質(zhì)細(xì)胞和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞[43]。大量研究證明PEDF可以降低RAGE的表達(dá)并發(fā)揮抗氧化作用，Liu等[44]選取6周齡小鼠注射STZ建立1型DM小鼠模型，并給予50nmol/L量的PEDF滴眼每日3次，持續(xù)8wk后發(fā)現(xiàn)與給予人工淚液的DM對(duì)照組小鼠對(duì)比，其角膜上皮染色評(píng)分降低且淚液分泌量和角膜敏感性均有顯著提高。進(jìn)一步對(duì)小鼠角膜行組織學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PEDF可減少DM小鼠角膜中ROS的累積、降低RAGE的表達(dá)以及增加抗氧化劑SOD1的表達(dá)，說明PEDF對(duì)DM所致的眼表損傷具有保護(hù)作用。

4.3α-硫辛酸α-硫辛酸(alpha-lipoic acid, ALA)是一種天然存在的低分子量(206.32g/mol)二硫醇微量營(yíng)養(yǎng)素，作為與線粒體代謝相關(guān)的生物能酶活性的輔助因子，它參與體內(nèi)的物質(zhì)代謝中的酰基轉(zhuǎn)移，能消除導(dǎo)致加速老化與致病的自由基。ALA的潛在抗氧化作用可歸因于直接活性氧(ROS)清除能力、金屬離子螯合能力和恢復(fù)細(xì)胞抗氧化劑的能力，如還原谷胱甘肽(GSH)、輔酶Q、維生素C和E水平。研究證明[45-47]ALA具有抗氧化的生物活性，對(duì)心血管疾病、炎癥、衰老和阿爾茨海默病認(rèn)知功能障礙具有保護(hù)作用，因而其藥理機(jī)制受到關(guān)注。另外關(guān)于ALA的大多數(shù)臨床研究顯示了其在減輕DM患者的OS、神經(jīng)病變和神經(jīng)病變相關(guān)疼痛和感覺異常方面也具有較強(qiáng)潛力[48]。

5展望

OS參與眾多疾病的發(fā)生發(fā)展，其重要性體現(xiàn)在連接包括異常代謝、炎癥反應(yīng)以及ERS等多種發(fā)病機(jī)制。目前OS在DM眼部并發(fā)癥的研究主要集中在糖尿病視網(wǎng)膜病變，在DK中的研究尚有不足，且多局限于角膜上皮損傷修復(fù)，未來OS在DK的發(fā)病機(jī)制中的作用有待進(jìn)一步研究。