洋甘菊多糖中單糖組分的高效液相色譜及高效毛細管電泳測定比較

陳 蕾，何新苗，孟 磊，馬曉麗

（1.信陽市中心醫(yī)院康復科，河南 信陽 464000；2.新疆醫(yī)科大學 藥學院，新疆 烏魯木齊 830011）

洋甘菊為菊科植物，母菊屬，一年生草本植物，原產(chǎn)歐洲，學名為Matricaria chamomillaL.[1]，主要以干燥的花或全草入藥，屬于新疆特色地產(chǎn)藥材[2-3]。洋甘菊具有消炎、鎮(zhèn)定、舒緩的功效，是中成藥祖卡木顆粒的主要成分之一。新疆特殊的生態(tài)環(huán)境使洋甘菊中含較豐富的黃酮、多糖、維生素和氨基酸等成分[4-6]。多糖類化合物具有抗腫瘤[7]、抗氧化[8]、降血糖降血脂[9]、調(diào)劑免疫等生物活性。但有關藥洋甘菊多糖中單糖組分的分析及活性研究未見報道。本研究采用超聲水提、乙醇沉淀得到粗多糖，對高效液相色譜（HPLC）及高效毛細管電泳（HPCE）兩種單糖組分測定方法進行比較，為洋甘菊多糖的功效研究測定奠定基礎。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters e2695高效液相色譜儀（美國Waters公司 ）；Hypersil BDS C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；P/ACE毛細管電泳儀（Benkman公司），配PDA檢測器；未涂層毛細管柱（永年銳灃色譜器件公司，d=75 mm）；PHSJ-3F pH計（上海雷磁）；KQ-500PE型超聲儀（昆山超聲儀器公司）；DZKW-S-4水浴鍋（北京永光明）。

1.2 材料

洋甘菊在成熟期采自新疆喀什市，由新疆醫(yī)科大學徐海燕副教授鑒定為德國洋甘菊，粉碎過200目篩。葡萄糖對照品，甘露糖對照品，半乳糖對照品，鼠李糖對照品，半乳糖醛酸對照品，木糖對照品，阿拉伯糖對照品（純度≥98 %，中國食品藥品檢定研究院）；乙腈（Fisher，色譜純）；氯仿，甲醇，乙醇，三氟乙酸（分析純，天津富宇）； HCl，NaOH（分析純，洛陽市化學試劑廠）；乙酸銨（優(yōu)級純，天津光復）；冰乙酸（分析純，西安化學試劑廠）；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP，分析純，上海試劑二廠）。

2 方法與結果

2.1 粗多糖制備

取過200目篩的洋甘菊粉末約10 g，精密稱定，置入錐形瓶，加100 ml超純水，60 ℃超聲30 min，過濾，濾渣在60 ℃下再次超聲30 min，合并提取液，抽濾，將濾液轉移至旋轉蒸發(fā)儀，濃縮至10 ml，在其中加無水乙醇使含醇量達80 %，室溫下靜置24 h，得多糖沉淀，棄上清，沉淀物于60 ℃真空干燥12 h，即得干燥的洋甘菊多糖。

2.2 樣品液的水解

精密稱取洋甘菊多糖約0.01 g，共6份，分別置入安瓿瓶，分別加入2 mmol/L 三氟乙酸溶液2 ml，封口后于105 ℃放置4 h，減壓回收三氟乙酸，超純水溶解，0.45 μm微孔濾膜過濾，定容至5 ml，搖勻，即得供試液，4 ℃保存。

2.3 混合單糖對照品溶液配制

精密稱取木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、鼠李糖、甘露糖、半乳糖、半乳糖醛酸7種單糖對照品適量，置入10 ml量瓶，制成濃度均為20 mmol/L的單糖對照品溶液，精密吸取7種單糖對照品溶液各1.0 ml，置入10 ml量瓶，定容，搖勻，即得。

2.4 衍生化處理

2.4.1 混合單糖對照品的衍生化 取混合單糖對照品溶液500 μl，加0.5 mmol/L 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）甲醇溶液500 μl，0.3 mmol/L NaoH溶液500 μl，渦旋30 s，置70 ℃水浴加熱30 min，冷卻至室溫，加入0.3 mmol/L HCl溶液，渦旋30 s，加入2 ml氯仿，渦旋30 s，吸取下層液棄去，重復3次，吸取上層液體，過0.45 μm微孔濾膜，進樣。

2.4.2 樣品衍生化 精密吸取2.2項下洋甘菊多糖水解后供試液500 μl，按2.4.1項下方法進行衍生化。

2.5 色譜條件

2.5.1 HPCE色譜條件 熔融未涂層石英毛細管柱（d=75 mm）；緩沖液：180 mmol/L硼酸溶液，pH 10.05；柱溫：25 ℃；電壓：15 kV；氣壓進樣：0.5 psi，進樣時間：10 s；檢測波長：245 nm。清洗程序：第1次進樣前分別以甲醇、水、0.1 mol/L鹽酸、水、0.1 mol/L NaOH、水、緩沖液，沖洗毛細管20 psi×5 min；每更換1次電泳緩沖液，均用緩沖液平衡至電流平穩(wěn)（10 min）后才進樣測定[6]。色譜圖見圖1。

2.5.2 HPLC色譜條件 色譜柱：Hypersil BDS C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙酸銨緩沖溶液（pH 5.5）-乙腈（22:78）；流速：1.0 ml/min；柱溫25 ℃；進樣量 ：10 μl；壓力：0.4 Pa；檢測波長：245 nm。色譜圖見圖2。

圖1 HPCE色譜圖（A：混合單糖對照品；B：洋甘菊多糖樣品）

由圖1、圖2可見各單糖色譜峰與鄰近峰均能達到基線分離，分離度＞1.5,理論塔板數(shù)＞3000，表明該方法具有良好的系統(tǒng)適應性，衍生化反應試劑不干擾各單糖的測定。

2.6 線性關系考察

分別按HPLC及HPCE檢測方法配制系列濃度的混合對照品溶液，經(jīng)衍生化后測定，HPLC以對照品濃度x（mmol/L）為橫坐標，峰面積y為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程，相關系數(shù)R2＞0.99。HPCE以對照品濃度x（mmol/L）為橫坐標，峰面積y為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程，相關系數(shù)R2＞0.99，結果見表1。結果表明兩種方法的線性關系均良好。差別之處在于兩種方法的線性范圍不同，HPCE比HPLC的線性范圍寬。

圖2 HPLC色譜圖（A：混合單糖對照品；B：洋甘菊多糖樣品）

表1 7種單糖的標準曲線

2.7 精密度、重復性、穩(wěn)定性

精密量取一定量的混合單糖對照品溶液，衍生化后，在上述色譜條件下，連續(xù)進樣6次，進行日內(nèi)精密度檢查，測定峰面積，計算得HPCE測定各單糖峰面積的RSD值均在3 %以下，HPLC測定各單糖峰面積的RSD值均在1 %以下。二者精密度均符合測定要求，HPLC略優(yōu)于HPCE。

精密稱取一定量2.1項下洋甘菊多糖樣品6份，水解、衍生化后，在上述色譜條件下進樣，進行重復性檢查，測定峰面積，HPCE與HPLC計算得各單糖峰面積的RSD值均在3 %以下。

精密量取一定量2.2項下供試品液，衍生化后，在上述色譜條件下，在0，2，4，6，8，12，24，48 h分別進樣測定，進行穩(wěn)定性檢查，計算得HPCE測定各單糖峰面積的RSD值均在4 %以下，HPLC測定各單糖峰面積的RSD值均在3 %以下。結果表明48 h內(nèi)各單糖色譜峰面積無明顯變化，被測樣品在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。HPCE和HPLC的精密度、重復性、穩(wěn)定性結果見表2。由表2可見，HPCE的精密度、重復性、穩(wěn)定性均小于5 %，HPLC測定的精密度、重復性及穩(wěn)定性均較好，小于2 %，優(yōu)于HPCE。

表2 HPCE和HPLC的精密度、重復性、穩(wěn)定性

2.8 加樣回收率

精密稱取已知含量的樣品粉末約0.01 g，共9份，分為3組，按測定濃度的80 %，100 %，120 % 分別加入一定量混合單糖對照品溶液，按2.2項方法制備供試品溶液，衍生化處理后按2.5項色譜條件分別進行HPCE及HPLC分析，計算加樣回收率。結果顯示，HPCE和HPLC測定的平均回收率均在98.0 %～102.0 %之間，RSD值均在0.48 %～1.41 %之間，表明方法產(chǎn)生的誤差小，實驗操作規(guī)范。見表3、表4。

表3 HPCE加樣回收率實驗結果

表4 HPLC加樣回收率實驗結果

0.0 6 9 6 0.0 8 0.1 5 2 3 1 0 4.4 0 0.7 3 0.0 6 9 6 0.1 0 0.1 7 4 0 0.0 6 9 6 0.1 2 0.1 9 3 1葡萄糖0.0 9 3 2 0.0 8 0.1 6 2 1 8 5.2 0 0.6 4 0.0 9 3 2 0.1 0 0.1 7 8 4 0.0 9 3 2 0.1 2 0.1 9 5 4半乳糖0.1 6 6 3 0.0 8 0.2 4 7 3 9 9.4 0.9 6 0.1 6 6 3 0.1 0 0.2 6 5 7 0.1 6 6 3 0.1 2 0.2 8 7 2阿拉伯糖、木糖半乳糖醛酸0.0 8 9 4 0.0 8 0.1 7 1 4 1 0 3.4 0.4 8 0.0 8 9 4 0.1 0 0.1 9 2 8 0.0 8 9 4 0.1 2 0.2 1 2 5

2.9 樣品中各單糖的含量

通過在多糖水解樣品中加混合單糖對照品后峰增高法定性可知，HPCE測定出的洋甘菊多糖主要由甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖7種單糖組成；由校正因子法計算得各單糖物質(zhì)的量之比為1:1.53:3.10:4.12:7.28:2.27:0.90。HPLC測定洋甘菊多糖主要由甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖與木糖7種單糖組成；其中阿拉伯糖與木糖在HPLC中未實現(xiàn)分離，出現(xiàn)疊峰，由于木糖含量較少，故本實驗中HPLC測得的阿拉伯糖與木糖統(tǒng)稱為阿拉伯糖。最終由校正因子法計算得甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖及阿拉伯糖與木糖之和的物質(zhì)的量之比為1:1.51:2.23:3.53:6.61:2.98。

3 討論

本文采用 HPLC和HPCE兩種方法分別對洋甘菊多糖中單糖組成進行了分析。本實驗以超聲提取為主要手段，采用傳統(tǒng)的熱水浸提、乙醇沉淀法得到洋甘菊粗多糖，實驗中HPLC和HPCE條件均在文獻基礎上進行了優(yōu)化[8-9]。線性實驗結果顯示，HPCE靈敏度較高；精密度方面HPLC優(yōu)于HPCE。加樣回收實驗結果表明，二者加樣回收率均能滿足測定要求，且結果相近。

本研究發(fā)現(xiàn)，HPLC測定多糖時，阿拉伯糖與木糖出現(xiàn)疊峰，無法完全分離，其原因可能是二者在結構上屬同分異構體，因此在普通液相色譜系統(tǒng)下難以分開，而HPCE可有效分離兩種單糖，雖然文獻報道HPCE重現(xiàn)性差，但在單糖分析中可作為HPLC的補充方法輔助區(qū)分阿拉伯糖與木糖。且本研究采取了以下措施：毛細管電泳儀每次進樣前，分別以甲醇、水、0.1 mol/L鹽酸、水、0.1 mol/L NaOH、水、緩沖溶液沖洗毛細管5 min；每更換1次電泳緩沖液，均用緩沖液平衡至電流平穩(wěn)（10 min）；減小操作電壓（15 kV）；利用冷卻液盡快除去熱量，使系統(tǒng)盡可能保持恒溫。結果證實這些辦法可有效改善HPCE在精密度、穩(wěn)定性方面的不足，使測定結果滿足需要。