生物胺熒光響應(yīng)膜在肉及肉制品新鮮度檢測中的應(yīng)用研究進展

夏 菲，李文博，董 越，黃 歡，孫文秀

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

肉及肉制品中含有大量人體所必需的各種蛋白質(zhì)、脂肪、維生素以及鐵、鋅、鎂等礦物質(zhì)，是人類膳食結(jié)構(gòu)中的一個重要組成部分[1]。預(yù)計到2030年，全球肉類消費量和供應(yīng)量將比2018—2020年的平均水平分別增加14.0%和5.9%[2]。然而，由于外部微生物的污染和內(nèi)源酶分解的作用，肉及肉制品在運輸和貯存過程中都極易發(fā)生腐敗變質(zhì)[3-4]。新鮮度是評估肉及肉制品品質(zhì)屬性的一項重要指標(biāo)，目前能指示新鮮度的指標(biāo)主要包括二氧化碳、揮發(fā)性堿性氮、硫化氫等物質(zhì)[5]。生物胺是在肉腐敗過程中產(chǎn)生的一種低分子質(zhì)量（小于200 Da）堿性含氮化合物，其含量與腐敗微生物數(shù)量成正比，是目前肉及肉制品新鮮度評估中應(yīng)用最廣泛的指標(biāo)之一，此外，由于過量的生物胺可引起人體過敏性食物中毒，對消費者健康產(chǎn)生潛在威脅[6]，因此開發(fā)高效的檢測方法用于監(jiān)測肉及肉制品中的生物胺具有重要意義。

熒光是指當(dāng)物質(zhì)完全暴露在某種特定波長的入射光下（通常是紫外線），物質(zhì)吸收入射光給予的光能進入激發(fā)狀態(tài)后，迅速退激發(fā)而輻射出的另一波長的光[7]。熒光響應(yīng)膜是一種固體光學(xué)傳感器，通常由具有熒光性質(zhì)的熒光材料和高性能的傳感薄膜（濾紙、玻璃和滴定板等）兩部分構(gòu)成，近年來因靈敏度高、成本低、操作簡單、響應(yīng)速度快等優(yōu)點被廣泛用于肉及肉制品新鮮度的高靈敏度檢測[8-10]。其檢測原理是負(fù)載在傳感薄膜中的熒光材料能與肉及肉制品腐敗產(chǎn)生的生物胺發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生特定的顏色變化，從而實現(xiàn)對肉與肉制品新鮮度的監(jiān)測。本文首先對肉及肉制品中生物胺的形成與分類以及生物胺對人體的危害進行簡要概述，其次重點介紹基于不同熒光響應(yīng)原理構(gòu)建的熒光響應(yīng)膜在肉及肉制品新鮮度監(jiān)測中的應(yīng)用，并對未來熒光響應(yīng)膜檢測技術(shù)在新鮮度監(jiān)測中的發(fā)展趨勢進行了展望。

1 肉及肉制品中的生物胺

1.1 生物胺的形成和分類

肉及肉制品中的蛋白質(zhì)含量高，其存在的生物胺主要是肉中的蛋白質(zhì)在自身蛋白酶和肽酶作用下分解成游離氨基酸后，微生物釋放的外源性脫羧酶對特定游離氨基酸進行脫羧反應(yīng)（即脫去相應(yīng)氨基酸中的α-羧基）產(chǎn)生的[11-13]，形成過程如圖1所示。肉及肉制品中存在的生物胺主要包括8 種，按照其自身化學(xué)結(jié)構(gòu)可劃分為脂肪族胺（腐胺、尸胺、精胺和亞精胺）、芳香族胺（酪胺和苯乙胺）及雜環(huán)類胺（組胺和色胺）三大類，按照化合物結(jié)構(gòu)中存在的氨基數(shù)量又可劃分為單胺（組胺、色胺、苯乙胺和酪胺）、二胺（腐胺和尸胺）和多胺（精胺和亞精胺）三大類[14-15]，其具體的結(jié)構(gòu)式如表1所示。然而，生物胺的產(chǎn)生與加工方式、理化因素、微生物因素都有密切相關(guān)性，因此不同肉及肉制品中生物胺的種類與含量也會有所不同。Sun Xia等[16]對四川地區(qū)零售市場30 種發(fā)酵香腸中的生物胺種類與含量進行測定，結(jié)果表明，所有香腸中都含有色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺和亞精胺，其中組胺含量最高，平均值高達196.06 mg/kg，原因主要是四川香腸屬于一種自發(fā)酵香腸，其微生物在自然環(huán)境中可能具有組氨酸脫羧酶活性，從而導(dǎo)致香腸中組胺的大量積累。胡永金等[17]研究云南三川火腿加工過程中生物胺的變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)三川火腿在整個加工過程中存在苯乙胺、尸胺、腐胺、組胺、酪胺、亞精胺和精胺，其中尸胺含量最高，在加工過程中呈現(xiàn)出一種快速上升的趨勢，在發(fā)酵后期達到69.24 mg/kg，精胺和亞精胺是鮮肉中天然存在的2 種多胺，其含量不受加工過程的影響；此外，組胺含量較低，最高僅為22.52 mg/kg，符合國家標(biāo)準(zhǔn)，且在新鮮火腿中未檢測出組胺，這可能是三川火腿在腌制期的高食鹽濃度抑制了組胺的形成。Sang Xue等[18]對盤錦蚱蜢蝦醬不同發(fā)酵時期的生物胺含量變化進行測定，在蝦醬發(fā)酵過程中一共檢測出5 種生物胺（色胺、尸胺、腐胺、組胺和酪胺），且組胺、尸胺和色胺含量均隨著發(fā)酵過程不斷增加，當(dāng)發(fā)酵時間達到180 d時，色胺含量最高，為77.20 mg/L，而組胺含量較低，僅略有增加。Li Wenya等[19]對河北黃驊自制蝦醬中的生物胺含量和細菌多樣性之間的相關(guān)性進行研究，結(jié)果表明，色胺、酪胺和組胺是商業(yè)黃驊蝦醬中存在的主要生物胺，平均含量分別為39.20、35.50、6.05 mg/kg，且研究發(fā)現(xiàn)四聯(lián)球菌與色胺和組胺含量呈正相關(guān)，可能是蝦醬中生物胺積累的主要原因。

表1 常見生物胺的基本信息Table 1 Chemical structure of common biogenic amines

圖1 肉及肉制品中常見生物胺的形成過程Fig.1 Formation process of common biogenic amines in meat and meat products

1.2 生物胺對人體的危害及殘留限量

生物胺是生物體中許多特定化合物（如生物堿、激素等）合成的重要氮源及前體，人體攝入低劑量的生物胺后，能在自身腸黏膜中通過胺氧化酶（單胺氧化酶和二胺氧化酶）反應(yīng)迅速解毒，從而不會對人體健康造成嚴(yán)重危害；然而當(dāng)攝入高劑量生物胺時，由于自身解毒酶的有效性受限，人體會出現(xiàn)嘔吐、呼吸困難、出汗、心悸、低血壓或高血壓以及偏頭痛等一系列明顯癥狀[20-22]。組胺和酪胺是肉及肉制品中存在的生物胺中毒性最強的2 種。組胺中毒又稱為“鯖魚中毒”，其毒性最強，組胺可通過與細胞膜上的2 種受體（H1和H2）相互作用引起舌頭發(fā)麻、皮疹、嘔吐、腹瀉、燒灼感、惡心、血管擴張、顱內(nèi)出血、心悸或呼吸困難等不良反應(yīng)，其癥狀通常在數(shù)小時內(nèi)開始，并持續(xù)12 h或幾天[23-25]。酪胺毒性弱于組胺，中毒的最初癥狀出現(xiàn)在食用后1～2 h，中毒癥狀包括偏頭痛、腸胃不適、心動過速、血糖升高和高血壓[26]。

由于生物胺受到其他化合物或不同個體解毒機制的特定效率影響，因此很難在食品中確定一種統(tǒng)一的生物胺最大攝入限量。美國食品和藥品管理局規(guī)定，食品中組胺的最高限量為500 mg/kg[27]。加拿大、澳大利亞和新西蘭等國家允許食用魚肉中存在的組胺最高限量為200 mg/kg[14]。歐盟規(guī)定鯖魚科和鯖魚屬魚類中的組胺最大可接受值為100～200 mg/kg[28]。我國規(guī)定高組胺魚類中的組胺含量不得高于40 mg/100 g，其他海水魚類中的組胺含量不得高于20 mg/100 g[29]。隨著近年來對生物胺研究水平的不斷深入，各個國家也會更加具體地制定食品中生物胺的最大限量標(biāo)準(zhǔn)，從而確保民眾的生命安全。

2 傳統(tǒng)技術(shù)檢測肉類新鮮度

隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，為了避免復(fù)雜的樣品基質(zhì)和結(jié)構(gòu)類似物對目標(biāo)分析物的干擾，適用于肉及肉制品中生物胺測定的分析方法應(yīng)該具有較高的分離效率、選擇性和靈敏度。

高效液相色譜法具有操作快速簡便、分離性好、靈敏度高、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點，是目前最為常用的生物胺檢測方法[30]。如Bashiry等[31]以1-辛醇作為萃取溶劑，乙腈作為分散溶劑，建立一種分散液-液萃取結(jié)合紫外檢測器的高效液相色譜法，用于雞胸肉中腐胺、亞精胺和精胺3 種多胺的分離測定。結(jié)果表明，該方法具有良好的靈敏度和準(zhǔn)確度，適用于肉制品中多胺的檢測。張殿偉等[32]以5 g/100 mL三氯乙酸作為提取劑，丹磺酰氯為衍生化試劑，建立一種可快速測定發(fā)酵肉制品中8 種生物胺的高效液相色譜法，結(jié)果顯示，該方法線性范圍廣（0.05～50.00 μg/mL），重復(fù)性好（83.34%～111.40%），準(zhǔn)確性高（相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于4.85%），在發(fā)酵肉制品中生物胺的大批量檢測中具有廣闊的應(yīng)用前景。

此外，氣相色譜-質(zhì)譜法、毛細管電泳法也是較為常用的生物胺檢測方法。Wojnowski等[33]采用分散液-液微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)對家禽、豬肉和牛肉樣品中的生物胺進行測定。該方法的提取過程高效、重現(xiàn)性好，且成功通過線性范圍、回收率、精密度、定量限和檢測限（limit of detection，LOD）驗證了方法在肉類生物胺檢測中的適用性。An Dong等[34]根據(jù)生物胺能與三聯(lián)吡啶釕（Ru(bpy)32＋）發(fā)生電化學(xué)反應(yīng)使Ru(bpy)32＋信號強度增強的原理，將毛細管電泳與電化學(xué)發(fā)光相結(jié)合，研究牡蠣貯藏過程中生物胺的含量變化，研究發(fā)現(xiàn)，亞精胺和腐胺是牡蠣貯藏和腐敗過程中的主要生物胺，在0.01～10.00 mg/L線性范圍內(nèi)，亞精胺和腐胺的LOD分別為6.0×10-4、9.6×10-4μg/mL，平均回收率為92.5%～104.2%，能滿足牡蠣中生物胺測定的需要。綜上所述，以上這些方法都具有較高的靈敏度和準(zhǔn)確性，但往往需要繁瑣的樣品前處理過程、昂貴的儀器設(shè)備及耗時的結(jié)果分析過程，限制了其在現(xiàn)場實時生物胺檢測中的廣泛應(yīng)用[35-37]。因此，迫切需要開發(fā)一種簡單、快速、準(zhǔn)確和低成本的方法來實時監(jiān)測肉及肉制品中的生物胺。

3 熒光響應(yīng)膜在肉及肉制品新鮮度檢測中的應(yīng)用

熒光響應(yīng)膜是近年來新興的一種光學(xué)傳感技術(shù)，因靈敏度高、熒光顏色多樣性、成本低、操作簡單、響應(yīng)速度快等優(yōu)點被廣泛用于肉及肉制品新鮮度檢測。在熒光響應(yīng)膜的構(gòu)建中，熒光材料的選擇至關(guān)重要，熒光材料的結(jié)構(gòu)決定了檢測的熒光響應(yīng)方式。目前，基于肉及肉制品中生物胺構(gòu)建的新鮮度監(jiān)測熒光響應(yīng)膜所用到的熒光響應(yīng)方式主要包括質(zhì)子轉(zhuǎn)移性熒光響應(yīng)、化學(xué)反應(yīng)性熒光響應(yīng)、基于聚集誘導(dǎo)發(fā)光（aggregation-induced emission，AIE）原理的熒光響應(yīng)等，因此本文重點圍繞這幾種類型展開綜述。

3.1 質(zhì)子轉(zhuǎn)移性熒光響應(yīng)膜

一般來說，利用生物胺本身的物理化學(xué)性質(zhì)誘導(dǎo)其光物理變化，可以有效簡化生物胺的檢測。生物胺自身帶有1 個或多個氨基基團，屬于堿性化合物，能與酸性熒光分子或質(zhì)子化熒光分子發(fā)生反應(yīng)，即熒光分子給出自身陽離子基團中的質(zhì)子，改變熒光分子的構(gòu)象結(jié)構(gòu)或電子密度，從而使熒光分子的熒光顏色發(fā)生改變，而這種顏色變化恰好能通過人眼所識別。因此，基于這種設(shè)計理念，越來越多的質(zhì)子轉(zhuǎn)移性熒光響應(yīng)膜被開發(fā)，用于監(jiān)測肉及肉制品新鮮度。

3.1.1 基于熒光素構(gòu)建的熒光響應(yīng)膜

熒光素是一種自身帶有酚羥基和螺內(nèi)酰胺結(jié)構(gòu)的氧雜蒽熒光材料，表現(xiàn)出一定的酸性，當(dāng)肉及肉制品發(fā)生腐敗時，酚羥基能在堿性環(huán)境下脫去質(zhì)子，而且螺內(nèi)酰胺結(jié)構(gòu)也能脫去質(zhì)子，發(fā)生開環(huán)反應(yīng)形成羧基，進而改變熒光素的發(fā)射波長，因此被廣泛應(yīng)用于新鮮度監(jiān)測中[7]。Jia Ruonan等[38]利用靜電紡絲技術(shù)制備了一種可用于海產(chǎn)品新鮮度監(jiān)測的比率熒光型納米纖維響應(yīng)膜，該熒光膜通過共價連接的方式將異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）固定在醋酸纖維素上，與物理共混的方式相比，化學(xué)鍵合能有效實現(xiàn)FITC在纖維素骨架上的均勻分布，從而緩解自身具有的聚集誘導(dǎo)猝滅行為，提高檢測靈敏度。結(jié)果表明：制備的熒光膜在蝦和豬肉生物胺新鮮度檢測中的LOD為5×10-6mg/L，隨著生物胺含量的增加，顏色由紅色（新鮮）變?yōu)榫G色（腐敗）；此外，醋酸纖維素骨架的化學(xué)固定作用還有效防止了熒光材料在使用過程中的遷移和泄漏，充分保障了食品的質(zhì)量安全，但由于穩(wěn)定的共價鍵相互作用，也限制了熒光膜的重復(fù)性，間接增加了檢測成本。

熒光膜透氣性也是決定靈敏度的重要因素之一，Quan Zongyan等[39]以纖維素納米纖維（cellulose nanofibers，CNFs）為骨架，將FITC和原卟啉IX通過均相反應(yīng)分別接枝到CNFs上作為指示劑和參比染料，設(shè)計了一種新型智能納米纖維比率熒光響應(yīng)膜。結(jié)果表明：CNFs中的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)能顯著提高熒光膜的透氣性，氧氣透過率大于2 000 cm3/（m2·24 h），對揮發(fā)性生物胺的LOD低至1×10-6mg/L；此外，熒光膜在蝦和螃蟹腐敗時期的熒光顏色會由紅色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S綠色。盡管該方法利用CNFs和均相化學(xué)反應(yīng)有效平衡了熒光響應(yīng)膜中FITC熒光基團的接枝密度及透氣性，提高了檢測靈敏度，降低了生產(chǎn)成本，展現(xiàn)出良好的新鮮度監(jiān)測能力，但選擇的參比染料屬于一種聚集誘導(dǎo)猝滅材料，自身存在自聚集和熒光猝滅現(xiàn)象，這可能會導(dǎo)致熒光膜的顏色變化階段不明顯，從而影響最終的結(jié)果判斷?；谶@一缺點，Liu Yingnan等[40]基于具有AIE效應(yīng)的紅色熒光碳量子點作為參比染料，基于綠色熒光熒光素作為指示劑，成功制備了一種可用于蝦肉新鮮度監(jiān)測的比率熒光型響應(yīng)膜。該方法將具有AIE效應(yīng)的紅色碳量子點以聚集態(tài)的形式分布在膜上，不僅為熒光分析提供了良好的背景熒光，而且還通過紅色碳量子點的強疏水性間接增加了熒光膜疏水性，有效提高熒光膜檢測靈敏度和實際應(yīng)用能力。

3.1.2 基于1,2-二氫喹啉衍生物（1,2-dihydroquinoxaline derivatives，DQs）構(gòu)建的熒光響應(yīng)膜

DQs是一種AIE熒光分子，該分子的質(zhì)子化形式，即H＋DQ2具有紅色熒光，當(dāng)H＋DQ2接觸到胺蒸汽時，H＋DQ2中的亞胺單元發(fā)生去質(zhì)子化，分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（intramolecular charge transfer，ICT）效應(yīng)減弱，此時具有紅色熒光的H＋DQ2轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂芯G色熒光的DQs母體形式[41]。Alam等[41]利用H＋DQ2對尸胺、腐胺和亞精胺等生物胺類氣體進行檢測，結(jié)果表明，LOD低至6.9×10-7μg/L，足以檢測食品變質(zhì)產(chǎn)生的胺類物質(zhì)。因此，該研究以濾紙作為H＋DQ2載體，開發(fā)了一種便攜式熒光響應(yīng)膜，并成功應(yīng)用于海產(chǎn)品（三文魚刺身、黃鰭鯛及白腳蝦）新鮮度的監(jiān)測。該方法克服了聚集誘導(dǎo)猝滅效應(yīng)，提高了LOD，具有良好的生物胺響應(yīng)性，但制備的熒光膜不具備疏水性能，當(dāng)放置在樣品包裝的頂部空間時，包裝內(nèi)部的高相對濕度可能會削弱熒光膜的顏色變化，影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此，為了提高熒光響應(yīng)膜的疏水性，Zhu Jian等[42]以聚二甲基硅氧烷涂層濾紙作為疏水基底層沉積H＋DQ2指示劑，制備一種H＋DQ2熒光響應(yīng)膜。研究表明，當(dāng)聚二甲基硅氧烷的涂層含量為0.6 g/100 g時，熒光膜疏水性最強，最大水接觸角達到138°，在蝦腐敗變質(zhì)過程中，熒光膜顏色會由無色變?yōu)辄S色。此外，該研究為了減少環(huán)境污染，還將H＋DQ2熒光響應(yīng)膜與聚乳酸托盤結(jié)合，成功設(shè)計出一種可監(jiān)測蝦類腐敗的生物可降解智能包裝。該方法有效解決了傳統(tǒng)沉積熒光膜疏水性能的缺陷，在高蛋白食品的變質(zhì)監(jiān)測中具有實時、準(zhǔn)確的檢測能力，但依然是基于熒光開啟及單一熒光顏色變化的新鮮度檢測模式，檢測精度易受環(huán)境條件和儀器的影響，而且人眼對于單種熒光顏色強度變化的敏感性有限，因此很難從視覺上區(qū)分不同的新鮮度，這可能會影響最終檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3.1.3 其他質(zhì)子轉(zhuǎn)移性熒光膜

除了上述2 類質(zhì)子轉(zhuǎn)移性熒光膜，還有其他類型的質(zhì)子轉(zhuǎn)移性熒光膜用于肉及肉制品新鮮度的檢測。Chen Xirui等[43]以三甲胺作為電子供體，喹喔啉-2(1H)-酮作為電子受體，首先制備一種AIE熒光分子3-(4-(二甲基氨基)苯乙烯基)喹喔啉-2(1H)-酮（3-(4-(dimethylamino)styryl)quinoxalin-2(1H)-one，ASQ），在酸性條件下，由于供體質(zhì)子化能減弱供體-受體之間的相互作用，激活A(yù)SQ的扭曲分子內(nèi)電荷效應(yīng)，酸化ASQ（H＋ASQ）具有豐富的可視化顏色和熒光顏色變化?；谠摤F(xiàn)象，作者將H＋ASQ沉積在濾紙中，成功制備了一種可用于監(jiān)測不同肉類和海鮮產(chǎn)品新鮮度的可視化/熒光雙模式響應(yīng)膜。該方法不僅克服了傳統(tǒng)熒光染料具有的聚集誘導(dǎo)猝滅效應(yīng)，還能通過可視化顏色變化及熒光顏色變化對魚肉新鮮度進行監(jiān)測，同時提高檢測的靈敏度和準(zhǔn)確度?；谏鲜鰴z測原理，該作者還基于質(zhì)子化的3-(4-(二苯基氨基)苯乙烯基)喹喔啉-2(1H)-酮作為生物胺反應(yīng)原件，成功構(gòu)建了一種用于海產(chǎn)品新鮮度監(jiān)測的熒光響應(yīng)膜，當(dāng)海產(chǎn)品腐敗后，熒光膜的可視化顏色從藍色變?yōu)辄S色，熒光顏色從藍色變?yōu)榍{菜色[44]。然而，以上方法均通過傳統(tǒng)的物理沉積法固定熒光材料，存在轉(zhuǎn)移與泄露的可能，對人類身體健康有潛在威脅。

3.2 化學(xué)反應(yīng)性熒光響應(yīng)膜

熒光分子自身的共軛結(jié)構(gòu)及共軛程度決定了相應(yīng)的激發(fā)和發(fā)射特征，熒光分子中一些官能團的變化會導(dǎo)致自身波長發(fā)生紅移或藍移，甚至導(dǎo)致熒光發(fā)生猝滅或熒光增強。生物胺中存在的氨基屬于一種活性基團，因此可以通過使用一些能與生物胺發(fā)生特定化學(xué)反應(yīng)的熒光材料來檢測體系的生物胺含量，從而避免復(fù)雜生物基質(zhì)的干擾，提高檢測的選擇性和靈敏度。

3.2.1 席夫堿反應(yīng)

席夫堿反應(yīng)主要是指醛和胺脫水形成亞胺鍵的縮合反應(yīng)。碳量子點（carbon dots，CDs）是一種尺寸小于10 nm的準(zhǔn)球形碳納米材料，因其官能團豐富、制備簡便、生物相容性好、熒光可調(diào)等優(yōu)勢而被廣泛應(yīng)用于食品安全檢測領(lǐng)域[45-46]。Qin Yujuan等[47]以表面含有豐富醛基的藍色熒光CDs作為指示劑，以紅色熒光染料1-氨基蒽醌（1-aminoanthraquinone，ANQ）為參比染料，制備一種可用于評估魚樣中組胺含量的比率熒光便攜式傳感平臺。結(jié)果表明，隨著魚樣貯存時間延長，樣品中組胺含量增加，CDs表面的醛基能與組胺上的氨基形成希夫堿，減弱CDs與ANQ之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移過程，CDs藍色熒光增強，熒光膜顏色從紅色逐漸變?yōu)樗{色。該方法通過CDs和組胺之間特定的希夫堿反應(yīng)開發(fā)了一種可激活的比率熒光探針，不僅有效避免了復(fù)雜生物基質(zhì)對檢測結(jié)果產(chǎn)生的干擾，實現(xiàn)了在食品腐壞初期生物胺含量較低時仍具有高選擇性和靈敏度的組胺檢測能力，而且與基于單種熒光顏色的新鮮度檢測模式相比，具有更好的可視化能力；但該方法對實際樣品具有破壞性，而且檢測過程相對繁瑣，達不到對組胺的現(xiàn)場快速監(jiān)測。

Jiang Lirong等[48]首先合成了一種對尸胺具有響應(yīng)性的比率熒光探針2-(10-丁基-2-甲氧基-10(H)-吩噻嗪-3-基)亞甲基丙二腈（2-(10-butyl-2-methoxy-10(H)-phenothiazin-3-yl)methylene malononitrile，PTCN），當(dāng)探針溶液中存在尸胺時，PTCN的強吸電子性的芳基丙二腈部分能通過逆向諾文葛爾反應(yīng)與尸胺反應(yīng)，導(dǎo)致探針熒光增強，結(jié)果表明，該探針對尸胺的LOD低于46 nmol/L，整個響應(yīng)時間只需15 s，滿足現(xiàn)場快速檢測的要求?；谠摤F(xiàn)象，作者將濾紙條在PTCN溶液中浸透，制成一種能用于檢測魚類腐敗過程中尸胺含量的智能傳感標(biāo)簽，在魚肉變質(zhì)之后，標(biāo)簽的熒光由紅色變?yōu)榫G色，從而反映出魚肉的新鮮度。

3.2.2 生色團反應(yīng)

生色團反應(yīng)是指生色團與某種特定分子發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，改變生色團的結(jié)構(gòu)和共軛程度后實現(xiàn)熒光變化的反應(yīng)過程，近年來因具有背景干擾低、信噪比高、比色信號與熒光信號變化同步等突出優(yōu)點受到越來越多的關(guān)注[49-50]。Li Lanqing等[51]基于吡啶基功能化的吡咯-氮雜-氟硼二吡咯（pyridyl functionalized pyrrolopyrroleaza-BODIPY，PPAB-Py）與胺之間的新型級聯(lián)生色團反應(yīng)，開發(fā)出一種高選擇性、高靈敏度的脂肪族伯胺識別探針。研究發(fā)現(xiàn)，因生物胺的親核性和堿性，胺能同時攻擊PPAB中的亞胺和硼-氮鍵，將PPAB-Py納米聚集體分裂成多個不同的共軛小分子，導(dǎo)致探針顯示出良好的比色和熒光響應(yīng)?；谠摤F(xiàn)象，作者基于PPAB-Py制備了一種能用于蝦新鮮度監(jiān)測的熒光膜，腐敗時期熒光膜的可視化顏色從綠色變?yōu)辄S色，熒光顏色從深色變?yōu)榱咙S色。此外，Li Lanqing等[52]還基于PPAB與生物胺之間的生色團反應(yīng)，成功制備了一種能用于檢測腐胺和尸胺以及監(jiān)測生肉和魚肉腐敗變質(zhì)的熒光標(biāo)簽。Wang Lingyun等[53]利用多胺特有的多氨基特性，基于內(nèi)酰胺融合的氮雜-氟硼二吡咯開發(fā)了一種高效的多胺熒光響應(yīng)膜，用于魚類新鮮度的監(jiān)測。結(jié)果表明，在28 ℃條件下貯存24 h的魚片或整條魚，熒光膜可視化顏色（由紫色變?yōu)榈S色）和熒光顏色（無色變?yōu)榉奂t色）均發(fā)生了類似的顏色變化。以上方法均基于特定的生色團反應(yīng)，有效克服了傳統(tǒng)響應(yīng)型熒光探針存在假陽性反應(yīng)、檢測方式單一的缺點，且在食品腐敗監(jiān)測中表現(xiàn)出良好的應(yīng)用能力，但同時由于生色團反應(yīng)會導(dǎo)致熒光材料被共軛分解為多個熒光小分子，因此熒光膜不具有檢測的可逆性與重復(fù)性。

3.2.3 其他化學(xué)反應(yīng)性熒光響應(yīng)膜

Abbasi-Moayed等[54]以表面羧基功能化的黃色熒光CdTe QDs作為生物胺響應(yīng)原件，以具有紅色熒光的CDs作為參比染料，以瓊脂糖水凝膠為載體，構(gòu)建一種可監(jiān)測雞肉和羊肉中精胺和亞精胺含量的比率型熒光響應(yīng)膜。在樣品新鮮階段，熒光膜為綠色，隨著貯藏時間的延長，QDs表面的羧基基團能與精胺和亞精胺多胺結(jié)構(gòu)中的氨基之間形成多個氫鍵或發(fā)生強靜電相互作用，誘導(dǎo)QDs發(fā)生聚集，導(dǎo)致其發(fā)射光譜猝滅或紅移，熒光膜顏色變成粉紅色。該方法合成路線簡單，檢測靈敏度高，可以作為一種直觀、高效的方法用于肉類的質(zhì)量和新鮮度監(jiān)測，滿足肉類供應(yīng)商和消費者的需求。

Zeng Lintao等[55]將雙氰胺基與香豆素骨架相結(jié)合，合成一種新型香豆素衍生物熒光材料雙氰乙烯基香豆素（dicyanovinyl coumarin，CMDC），CMDC中缺電子的雙氰胺部分能與尸胺進行氮雜-邁克爾加成后轉(zhuǎn)化為亞胺基，削弱CMDC中的ICT效應(yīng)，實現(xiàn)熒光由紅到綠的低色差變化。將該熒光材料加載到濾紙條用于牛肉新鮮度監(jiān)測，在牛肉腐敗變質(zhì)過程中，熒光膜顏色由紅色變?yōu)榫G色，變色結(jié)果與總揮發(fā)性鹽基氮含量變化趨勢一致，具有良好的準(zhǔn)確性。此外，該研究還使用細胞活力檢測試劑盒測定CMDC熒光膜的細胞毒性，細胞存活率高達96%，表明該熒光膜具有優(yōu)良的食品安全性，可以應(yīng)用于新型食品包裝，從而為消費者提供一種非接觸式的便攜式新鮮度監(jiān)測工具。

3.3 基于AIE原理的熒光響應(yīng)膜

AIE材料是指一種因分子內(nèi)運動受限能在聚合態(tài)或固態(tài)時發(fā)出強烈熒光，而在單分子態(tài)時發(fā)出弱熒光或無熒光的有機發(fā)光材料[56]。近年來，因能克服傳統(tǒng)熒光材料的聚集誘導(dǎo)猝滅現(xiàn)象，顯著提高檢測靈敏度，被廣泛應(yīng)用到生物成像、傳感及光電等領(lǐng)域。

聚苯胺（polymer polyaniline，PANI）是一種刺激響應(yīng)性聚合物，由于聚合物主鏈質(zhì)子化程度的變化，其自身顏色會隨著pH值的變化而變化，近年來被越來越多的研究者用做食品新鮮度指示劑[57-59]。Liu Xiuying等[60]將典型AIE分子四苯乙烯（tetraphenylethylene，TPE）與PANI混合制備的PANI/TPE聚合物作為新鮮度指示劑，設(shè)計出一種能監(jiān)測魚肉新鮮度的比色/熒光雙模式熒光響應(yīng)膜。檢測時，由于魚體在腐敗過程中釋放出的揮發(fā)性堿性生物胺會使pH值刺激響應(yīng)性聚合物PANI的碳骨架發(fā)生變化而產(chǎn)生響應(yīng)，激發(fā)TPE的AIE效應(yīng)，因此熒光膜的熒光顏色從黑色變?yōu)樗{色，可視化顏色從綠色變?yōu)榭兹杆{，從而實現(xiàn)雙模式監(jiān)測。該方法成功將2 種信號（比色和熒光信號）組合在一種方法中，利用2 種信號結(jié)果之間的相互驗證，大大提高了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度，然而該方法中的熒光信號屬于單一的熒光變化?；谶@一缺點，Liu Xiuying等[61]以羅丹明B為參比染料，以聚甲基丙烯酸和四苯乙烯的復(fù)合材料為響應(yīng)元件構(gòu)建了一種兼具揮發(fā)性胺敏感性和AIE特性的熒光響應(yīng)性智能新鮮度指示標(biāo)簽，并成功應(yīng)用于三文魚新鮮度檢測中。在室溫環(huán)境貯藏下，隨著三文魚腐敗程度的加劇，指示標(biāo)簽的熒光顏色呈現(xiàn)粉紅色-藍紫色-深藍色的轉(zhuǎn)變。該方法與傳統(tǒng)單一顏色變化的熒光響應(yīng)膜相比，熒光顏色變化明顯，可以通過2 種熒光強度的自校準(zhǔn)，最大限度減少背景熒光對檢測結(jié)果的影響，實現(xiàn)對生物胺更靈敏、更準(zhǔn)確的檢測。

3.4 其他熒光響應(yīng)膜

基于熒光響應(yīng)膜響應(yīng)方式的多樣性，除了以上報道外，還有研究者基于熒光分子與生物胺之間的氫鍵和靜電相互作用、超分子主客體相互作用或熒光材料之間發(fā)生的能量轉(zhuǎn)移等原理構(gòu)建了能對肉及肉制品新鮮度進行監(jiān)測的不同類型熒光響應(yīng)膜。

Qi Xiaoni等[62]以明膠作為成膜骨架，利用雙吩嗪衍生物作為生物胺響應(yīng)功能單元，制備一種可用于評價蝦新鮮度的新型熒光響應(yīng)膜。與傳統(tǒng)的物理吸附法相比，該熒光膜可以通過雙吩嗪衍生物與明膠之間的弱相互作用（氫鍵和靜電相互作用）形成一種動態(tài)三維網(wǎng)絡(luò)骨架，從而避免熒光材料在熒光膜中發(fā)生解吸后帶來的潛在風(fēng)險，進一步保證食品的安全性，提高靈敏度。結(jié)果顯示，熒光響應(yīng)膜對生物胺的LOD低至0.1×10-6mg/L，在蝦肉腐敗后，由于酸堿相互作用引起的分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（intramolecular charge transfer，ICT）效應(yīng)，熒光顏色由黃色變?yōu)樗{色，在新鮮度監(jiān)測方面具有很大的應(yīng)用潛力。Qi Xiaoni等[63]利用吩嗪衍生物（phenazine derivatives，PY）和萘二酰胺（naphthalene diamide，NDI）能在氫鍵誘導(dǎo)下自組裝的特性，構(gòu)建了一種基于超分子主客體相互作用的生物胺熒光響應(yīng)膜，并用于豬肉新鮮度的監(jiān)測。結(jié)果表明，PY和NDI能自組裝成組織良好的棒狀結(jié)構(gòu)，具有較強的AIE效應(yīng)，顯示出綠色熒光，隨著豬肉包裝容器內(nèi)揮發(fā)性生物胺的增加，分子間氫鍵相互作用和π-π堆積消失，引起ICT效應(yīng)或光致空穴轉(zhuǎn)移，熒光膜顏色由深綠色（新鮮）變?yōu)闇\綠色（腐?。?，展現(xiàn)出良好的實際應(yīng)用能力。以上2 種熒光膜都屬于單信號、單顏色響應(yīng)的新鮮度檢測模式，容易受到測試環(huán)境因素的干擾，影響檢測靈敏度。

Guo Lei等[64]創(chuàng)新性地將鑭系絡(luò)合物Eu3＋和Tb3＋作為生物胺響應(yīng)原件，通過在納米黏土中摻雜鑭系絡(luò)合物，開發(fā)了一種能測定組胺含量并用于魚肉新鮮度監(jiān)測的熒光響應(yīng)膜。結(jié)果表明，該熒光膜選擇性好、靈敏度高，對組胺的LOD低至0.137 mg/L，在魚肉腐敗過程中，組胺誘導(dǎo)Tb3＋向Eu3＋發(fā)生能量轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致Tb3＋發(fā)射強度顯著降低，Eu3＋發(fā)射強度顯著增加，熒光膜顏色從黃色變到橙色再變到玫瑰紅。該方法避免了傳統(tǒng)熒光探針制備過程耗時費力的過程，降低了檢測成本，提高了檢測效率。

除了上述舉例外，本文對近5年來熒光響應(yīng)膜在肉及肉制品新鮮度檢測中的相關(guān)報道及發(fā)展優(yōu)化進程進行了簡要總結(jié)，分別詳見表2和圖2。

表2 近5年熒光響應(yīng)膜在肉及肉制品新鮮度檢測中的應(yīng)用Table 2 Application of fluorescence responsive membrane in meat and meat product freshness detection in recent five years

圖2 熒光響應(yīng)膜在肉及肉制品新鮮度檢測中的發(fā)展優(yōu)化進程Fig.2 Course of development and optimization of fluorescence responsive membrane for freshness detection of meat and meat products

熒光顏色變化是熒光膜對檢測結(jié)果的一種重要表現(xiàn)形式，基于單熒光顏色變化的熒光膜是熒光膜構(gòu)建中較為簡單的一種形式[73-74]，但由于該方法的檢測結(jié)果受自身主觀意識影響較大，近年來，研究重點聚焦于比率熒光響應(yīng)膜，比率熒光膜中存在的參比染料具有自校正效果，其抗干擾能力強，可以顯著提高檢測精度。隨著科學(xué)技術(shù)的繼續(xù)發(fā)展，因比色（可視化）信號簡單、低成本和可通過肉眼直接讀取檢測結(jié)果的優(yōu)點，近年來基于比色和熒光2 種信號構(gòu)建的雙信號熒光響應(yīng)膜也被用于肉及肉制品中生物胺的新鮮度檢測中。其原因主要有2 個：1）將比色/熒光2 種信號并行組合在同一熒光膜中，可以通過2 個信號的相互驗證，得到比單熒光模式方法更令人信服的結(jié)果，且由于減少了一些會同時降低2 個輸出信號精度干擾的負(fù)面影響，熒光膜的穩(wěn)定性更高；2）由于2 種信號材料的多樣性，比色熒光雙信號響應(yīng)膜在實際應(yīng)用中表現(xiàn)出較強的靈活性，而且對資源受限地區(qū)的現(xiàn)場篩選也具有較高的接受度。因此，未來在生物胺的新鮮度檢測熒光響應(yīng)膜的構(gòu)建中還是會更多以比色/熒光雙信號響應(yīng)膜為研究熱點。

4 結(jié) 語

肉及肉制品因自身的營養(yǎng)特性，容易滋生微生物而導(dǎo)致腐敗變質(zhì)，這一過程會產(chǎn)生大量生物胺。生物胺的過量攝入對人體生命安全存在潛在威脅，而且生物胺也是肉及肉制品新鮮度評估的重要指標(biāo)，故其檢測技術(shù)一直廣泛受到國內(nèi)外研究者的關(guān)注。熒光響應(yīng)膜是一種新興的固體光學(xué)傳感器，相比于傳統(tǒng)肉眼可視化響應(yīng)膜，在響應(yīng)時間、信號強度、顏色多樣性、檢測靈敏度等方面具有明顯優(yōu)勢，在肉及肉制品新鮮度檢測中具有廣闊的發(fā)展前景。簡單的質(zhì)子轉(zhuǎn)移性與AIE熒光膜穩(wěn)定性和抗干擾性較差，不適用于復(fù)雜的食品環(huán)境基質(zhì)，化學(xué)響應(yīng)性熒光膜具有很強的特異性識別功能，在成分較復(fù)雜的食品中，能夠避免復(fù)雜生物基質(zhì)的干擾，提高檢測的選擇性和靈敏度，然而，化學(xué)響應(yīng)膜的檢測可逆性與重復(fù)性較差，間接增加了檢測成本。AIE響應(yīng)膜能有效克服其他2 種熒光響應(yīng)膜中傳統(tǒng)熒光染料存在的聚集誘導(dǎo)猝滅現(xiàn)象，增加熒光膜的工作效率，顯著提高檢測靈敏度。

為使熒光響應(yīng)膜更好地應(yīng)用于肉類新鮮度檢測中，首先應(yīng)繼續(xù)開發(fā)更穩(wěn)定、安全的固定載體或熒光材料的負(fù)載方法，或者尋求一種低毒、無毒的熒光材料，從而提高檢測安全性。此外，在今后的研究中，可以基于熒光信號構(gòu)建多種雙信號熒光響應(yīng)膜（如熒光/比色、熒光/拉曼光、熒光/光熱等），且同時開發(fā)一些便攜式雙信號讀取設(shè)備，在提高檢測精度的同時，也降低在實際應(yīng)用中現(xiàn)場實時監(jiān)測的難度。另外，需要注重對可生物降解熒光膜的開發(fā)，使熒光膜在充分發(fā)揮自身檢測性能且保證食品安全質(zhì)量的同時還能最大限度降低對環(huán)境的污染。最后，將熒光響應(yīng)膜與其他多種殺菌技術(shù)相結(jié)合，實現(xiàn)熒光響應(yīng)膜同時具備維持和監(jiān)測肉及肉制品新鮮度的雙重功能，為食品質(zhì)量安全提供更強有力的保障。