冰鮮雞肉腐敗微生物檢測技術(shù)研究進展

王 影，王 蕊，何鴻舉，馬漢軍

（1.河南科技學(xué)院食品學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.河南雙匯投資發(fā)展股份有限公司，河南 漯河 462000）

近年來，雞肉及雞肉制品頗受人們歡迎，雞肉主要分為熱鮮肉、冰鮮肉和冷凍肉，冰鮮雞肉是宰后將胴體迅速冷卻到0～4 ℃，并且在加工、運輸和銷售過程，溫度始終保持0～4 ℃的生鮮雞肉。冰鮮雞肉以品質(zhì)鮮嫩、高營養(yǎng)等優(yōu)點，成為人們生活中必不可少的肉食選擇，雞肉已然成為餐桌上的主要肉食[1]。由于冰鮮雞肉中蛋白質(zhì)含量、水分活度較高，是微生物生長繁殖的天然培養(yǎng)基，因此在屠宰、分割、預(yù)冷等生產(chǎn)加工環(huán)節(jié)以及車輛運輸和貯藏、銷售過程中極易受到微生物污染[2-3]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，冰鮮雞肉在冷藏條件下（0～4 ℃）不到1 周就會發(fā)生腐敗，主要表現(xiàn)為發(fā)酸、發(fā)黏、有菌斑、外觀明顯變色等[4-6]。腐敗菌在肉品貯藏過程中增殖，產(chǎn)生異味，是影響產(chǎn)品貨架期的主要微生物[7-8]。

本文通過分析冰鮮雞肉中的腐敗微生物，結(jié)合相關(guān)研究確定冰鮮雞肉中優(yōu)勢腐敗菌，并綜述針對腐敗優(yōu)勢菌的傳統(tǒng)檢測方法和現(xiàn)代檢測新技術(shù)的研究進展，為冰鮮雞肉質(zhì)量檢測、貯藏保鮮及高效防腐提供理論基礎(chǔ)。

1 冰鮮雞肉優(yōu)勢腐敗菌

由于不同肉的組織形態(tài)、屠宰加工方式等不同，眾多學(xué)者對不同肉的菌群分布及生長趨勢研究發(fā)現(xiàn)，不同肉中腐敗菌群類別及生長趨勢顯著不同[9-10]。目前很多學(xué)者對冰鮮雞肉腐敗優(yōu)勢菌已有相關(guān)研究，傳統(tǒng)培養(yǎng)方式下優(yōu)勢腐敗菌相差不明顯，并且變化趨勢相一致。孫彥雨[3]結(jié)合聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）和變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）2 種方法形成PCR-DGGE技術(shù)，研究冰鮮雞肉貯藏過程中不同時期的菌相變化，得出乳酸菌、肉桿菌、熱殺索絲菌、腐敗希瓦氏菌等是冰鮮雞肉主要優(yōu)勢菌。梁慧等[11]研究表明，從冷鮮雞肉初始菌中分離出主導(dǎo)菌群為乳酸菌和葡萄球菌，二者所占比例最大，為35%。劉朏[12]采用傳統(tǒng)培養(yǎng)結(jié)合PCR-DGGE，確定冷鮮雞優(yōu)勢菌為腸桿菌、假單胞菌、葡萄球菌、不動桿菌、莫拉克斯和洋蔥伯克霍爾德屬。張秋勤[13]通過結(jié)合傳統(tǒng)培養(yǎng)和PCR-DGGE技術(shù)，確定雞肉的優(yōu)勢腐敗菌為不動桿菌、假單胞菌、肉桿菌和魏斯氏菌屬。通過上述研究結(jié)果可知，導(dǎo)致冰鮮雞肉腐敗的微生物主要為假單胞菌屬、嗜熱環(huán)絲菌、氣單胞菌、乳桿菌屬和腸桿菌科等[14]。鑒于傳統(tǒng)分離技術(shù)和檢測新技術(shù)之間存在差異，綜合2 種檢測方法確定導(dǎo)致冰鮮雞肉腐敗的優(yōu)勢菌為熱殺索絲菌、假單胞菌、腐敗希瓦氏菌、乳酸菌、肉桿菌、不動桿菌屬、莫拉氏菌、氣單胞菌屬及魏斯氏菌屬。根據(jù)《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊》，冰鮮雞肉中的優(yōu)勢腐敗微生物特性如表1所示。

表1 冰鮮雞肉中優(yōu)勢腐敗菌及其特征Table 1 Characteristics of dominant spoilage bacteria in chilled chicken

2 傳統(tǒng)微生物檢測方法

傳統(tǒng)微生物檢測依據(jù)國標(biāo)4789系列標(biāo)準(zhǔn)，如GB 4789.2—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗菌落總數(shù)測定》、GB 4789.35—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 乳酸菌檢驗》、GB 4789.15—2012《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 霉菌和酵母菌計數(shù)》、GB 4789.28—2013《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求》、GB 4789.4—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 沙門氏菌檢驗》、GB 4789.14—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 蠟樣芽孢桿菌檢驗》及GB 4789.13—2012《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 產(chǎn)氣夾膜梭菌檢驗》。

傳統(tǒng)微生物檢測主要是為微生物提供適宜的生長環(huán)境，如需氧或兼性厭氧條件下pH 6.0～7.5、35～37 ℃培養(yǎng)18～48 h，以及所必需的營養(yǎng)物質(zhì)，如水分、碳源、氮源等。傳統(tǒng)培養(yǎng)包含前增菌培養(yǎng)和分離培養(yǎng)2 個步驟，根據(jù)微生物種類，選擇不同培養(yǎng)基進行接種、培養(yǎng)，根據(jù)菌落形態(tài)特征、革蘭氏染色結(jié)果等再進行下一步的分離和鑒定[15]。傳統(tǒng)檢測作為經(jīng)典方法，檢測結(jié)果準(zhǔn)確、直觀、成本低、所需設(shè)備少，為肉制品加工企業(yè)檢測首選。但是傳統(tǒng)檢測方法中存在一些不確定因素，如環(huán)境中的微生物對制備的培養(yǎng)基及整個檢測過程都有污染風(fēng)險，進而影響結(jié)果；在培養(yǎng)、分離、鑒定過程中，致病菌可能污染空氣環(huán)境，導(dǎo)致檢驗人員受到影響，造成一定的生物危害。傳統(tǒng)檢測方法操作繁瑣，需提前配制藥品，使用的稀釋管、槍頭等用品需要高壓滅菌，樣品處理、稀釋、培養(yǎng)、計數(shù)等一般需要48 h以上，才能得到分離純化的單個菌落，再進行鑒定，耗時耗力。而且傳統(tǒng)方法鑒定過程不確定因素較多，易被污染，結(jié)果準(zhǔn)確率低，能夠分離和鑒別的菌株種類有限，不能夠充分反映所檢測樣品中微生物的真實性[16]。要想得到準(zhǔn)確檢測結(jié)果的同時縮短檢測時間、降低檢測成本，就需要充分結(jié)合傳統(tǒng)分離和現(xiàn)代檢測2 種方法，這也是未來食品檢測發(fā)展的需要。

3 現(xiàn)代檢測新技術(shù)

3.1 分子檢測技術(shù)

3.1.1 分子印跡技術(shù)

分子印跡技術(shù)即利用分子印跡聚合物（molecularly imprinted polymers，MIPs），模擬酶與底物或者抗體與抗原之間的相互作用，對印跡分子進行專一識別的技術(shù)[17-18]?；诜肿佑≯E技術(shù)制備而成的高分子聚合物可通過三維空間結(jié)構(gòu)和分子間作用力實現(xiàn)與模板分子或類似物的特異性識別，該技術(shù)具有專一性、結(jié)果準(zhǔn)確度高、檢測過程快速、整體實用性高等優(yōu)點，在活性成分分離、模擬酶催化危害物降解等方面進行了廣泛研究[19-20]。

Hu Tianliang等[21]基于該原理以大腸桿菌O157:H7為檢測模板，建立大腸桿菌O157:H7的電化學(xué)發(fā)光檢測方法。在最優(yōu)條件下，檢測范圍為10～107CFU/mL，檢出限為8 CFU/mL。Idil等[22]以大腸桿菌為模板，通過微接觸紫外引發(fā)印跡聚合方法，制備大腸桿菌MIPs金電極傳感器的同時建立電容式電化學(xué)檢測方法。大腸桿菌的檢測范圍為102～107CFU/mL，檢出限為70 CFU/mL。Wu Jikui等[23]以大腸桿菌為模板，吡咯為單體，采用電化學(xué)聚合方法制備玻璃電極MIPs電化學(xué)傳感器，并建立了阻抗型電化學(xué)檢測方法，該方法可在1 h內(nèi)實現(xiàn)對大腸桿菌O157:H7的檢測，檢測定量限為103CFU/mL，回收率為96.0%～107.9%。Fu Kaiyue等[24]采用微接觸印跡法在玻璃板上制備副溶血弧菌MIPs膜，該印跡膜對副溶血弧菌具有較好的選擇吸附性，捕獲率達62.9%。

3.1.2 PCR檢測技術(shù)

PCR技術(shù)的基本原理與DNA復(fù)制過程高度相似，是特定DNA分子片段的生物學(xué)技術(shù)。其特異性來源于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物[25-27]?？梢酝ㄟ^破碎細(xì)胞、提取核酸、PCR擴增、凝膠電泳純化、核酸測序及數(shù)據(jù)庫比對分析等過程進行鑒定。PCR技術(shù)具有樣品前處理操作簡單、檢測周期短、靈敏度高等優(yōu)點[28]。

DGGE被稱為DNA指紋圖譜技術(shù)，采用PCR-DGGE技術(shù)研究雞肉中微生物，在準(zhǔn)確分析微生物菌群及其生長多樣性的同時，還能體現(xiàn)微生物在不同生長時期的詳細(xì)變化[3]。實時熒光定量PCR技術(shù)通過擴增反應(yīng)，在監(jiān)測熒光信號的基礎(chǔ)上，繪制擴增曲線進行深入分析，在實際檢測過程中具有極高的精準(zhǔn)性和準(zhǔn)確度[29-31]。

Li等[32]運用PCR-DGGE技術(shù)研究冷藏豬肉，分離出假單胞菌、熱殺索絲菌和乳酸菌是主要腐敗菌。孫彥雨[3]通過PCR-DGGE技術(shù)和傳統(tǒng)技術(shù)的融合，確定乳酸菌、肉桿菌、熱殺索絲菌和腐敗希瓦氏菌等是冰鮮雞肉主要優(yōu)勢菌。李鳳珠等[33]采用TaqMan探針和SYBR Green染料2 種方法，實現(xiàn)對金黃色葡萄球菌的快速定量檢測，對目前已知變種菌株和相關(guān)菌株的檢測特異性接近100%。楊曼瓊[34]通過熒光定量PCR等技術(shù)實現(xiàn)假單胞菌的快速有效檢測。

3.1.3 等溫擴增技術(shù)

等溫擴增技術(shù)是指可以在恒定的溫度下對特定核酸片段進行擴增的技術(shù)，本文介紹環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)和交叉引物擴增技術(shù)[35]。

環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)是一種在恒溫條件下進行核酸擴增、能在體外迅速完成對靶序列上億次擴增的痕量檢測技術(shù)[36]。環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)檢測方式多樣，關(guān)鍵在于找到合適的靶基因并設(shè)計相應(yīng)的特異性引物，從而實現(xiàn)定性檢測。Ledlod等[37]通過結(jié)合環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)和雙向側(cè)流試紙方法，可快速檢測肉及肉制品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌，檢出限達20 CFU/g。Chen Xingxing等[38]開發(fā)了基于等溫擴增技術(shù)的豬肉制品金黃色葡萄球菌快檢方法，檢出限達50 CFU/mL。張晉豪等[39]以冷鮮雞新鮮度與假單胞菌數(shù)量的高度正相關(guān)性為基礎(chǔ)，建立的檢測方法對假單胞菌特異性、擴增性顯著提高，在最優(yōu)條件下靈敏度為3.05×102CFU/mL。

交叉引物恒溫擴增（cross priming amplification，CPA）技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)高效擴增目標(biāo)核酸，但是需要在恒定的溫度條件下，通過特殊設(shè)計的引物和探針才能實現(xiàn)[40]。CPA技術(shù)具有特異性高、操作過程簡單、恒溫擴增過程迅速、不易被污染、成本低等優(yōu)點[41]。向勇[42]根據(jù)銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）的特異性基因建立的PA-CPA方法操作簡便、特異性強、準(zhǔn)確度高，在62 ℃恒溫擴增45 min，靈敏度是常規(guī)PCR的100 倍，而且重復(fù)性和穩(wěn)定性良好，可用于銅綠假單胞菌的快速檢測。

3.1.4 高通量測序技術(shù)

高通量測序技術(shù)又稱為下一代測序技術(shù)或大規(guī)模平行測序技術(shù)[43-44]，可同時測序大量核酸分子，該技術(shù)在檢測普通微生物的同時還能檢測到那些不易培養(yǎng)、豐度低以及難以分離的微生物[45-46]，與傳統(tǒng)微生物學(xué)方法相比，能夠更好地解釋微生物基因的組成和多樣性，具有檢測快速、通量高、靈敏度高、能夠?qū)崿F(xiàn)樣品間平行分析等優(yōu)點[47]。隨著測序技術(shù)的發(fā)展和成本的下降，高通量測序技術(shù)在肉及肉制品腐敗微生物檢測及菌群多樣性方面有著廣泛應(yīng)用[48]。

Xi La等[49]利用Illunima MiSeq高通量測序技術(shù)分析麥曲樣品中真菌的群落結(jié)構(gòu)和多樣性，麥曲中的主要菌門為子囊菌門，平均相對含量達到90.21%。Dong Yun等[50]通過MiSeq高通量測序，分離出臘肉中的主要細(xì)菌門為硬壁菌門和變形菌門，平均相對含量分別為54.05%和44.28%。田建軍等[51]采用Illumina MiSeq技術(shù)分析風(fēng)干肉制品中細(xì)菌16S rRNA V4區(qū)基因序列，在自然發(fā)酵和人工調(diào)控肉制品中分別鑒定出241 個和102 個細(xì)菌屬，細(xì)菌多樣性在屬水平上差異顯著（P＜0.05）。

3.2 光譜檢測技術(shù)

3.2.1 高光譜成像技術(shù)

高光譜成像技術(shù)是通過融合光譜和圖像2 種技術(shù)，可以對樣品快速、無損、高效檢測的光電分析技術(shù)，檢測過程中能夠同時得到樣品的光譜和圖像信息[52]。光譜波段涵蓋范圍廣，分辨率達到納米級別，是一種融合光學(xué)、計算機、信號處理學(xué)的無損、快速、準(zhǔn)確、高效的現(xiàn)代化技術(shù)[53-54]。

王慧等[55]通過高光譜數(shù)據(jù)分析所建立雞肉嫩度預(yù)測模型的相關(guān)系數(shù)為0.94。何鴻舉等[56]利用900～1 700 nm近紅外高光譜成像系統(tǒng)對冷鮮雞胸肉的乳酸菌含量進行檢測，通過連續(xù)投影算法（successive projections algorithm，SPA），根據(jù)篩選出的最優(yōu)波長，建立的SPAPLS模型預(yù)測相關(guān)系數(shù)達到0.949，驗證集均方根誤差為0.439（lg（CFU/g））。Feng Yaoze等[57]對雞肉中的腸桿菌科進行研究，通過使用近紅外高光譜成像建立的雞肉中腸桿菌科預(yù)測模型相關(guān)系數(shù)為0.93。何鴻舉等[58]基于近紅外高光譜成像技術(shù)，通過使用基線校正（baseline correction，BC）、偏最小二乘（partial least squares，PLS）算法等，研究熱殺索絲菌含量在雞胸肉冷藏過程中的變化，通過BC預(yù)處理，構(gòu)建的全波段PLS熱殺索絲菌預(yù)測模型相關(guān)系數(shù)接近1.0。

3.2.2 近紅外光譜技術(shù)

近紅外光譜是對波長760～2 600 nm、可見光譜區(qū)及中紅外光譜區(qū)間電磁波的描述[59]。近紅外光譜技術(shù)是一種能夠?qū)崿F(xiàn)預(yù)測樣品化學(xué)組成及其含量的無損檢測技術(shù)，并且可以關(guān)聯(lián)樣品本身的性質(zhì)特征，來建立校正模型。近紅外光譜源于分子振動，可反映分子化學(xué)鍵基頻振動的倍頻和合頻吸收，結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法PLS[60]用于食品質(zhì)量檢測，能夠?qū)崿F(xiàn)快速、無損、多組分同時檢測，廣泛應(yīng)用于鮮豬肉、鮮雞肉等肉類及肉制品的檢測中[61]。

Alexandrakis等[62]利用近紅外光譜技術(shù)定性檢測雞胸肉中李斯特菌、熒光假單胞菌、惡臭假單胞菌和大腸桿菌。張雷蕾[63]通過近紅外高光譜成像技術(shù)，建立冷卻豬肉中假單胞菌的預(yù)測模型，相關(guān)系數(shù)為0.948。王名星[64]運用嗅覺可視化及近紅外光譜技術(shù)，通過多傳感器信息融合技術(shù)分離鑒定雞肉中假單胞菌，建立的反向傳播人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型識別效果顯著提升。

3.2.3 拉曼光譜技術(shù)

拉曼光譜技術(shù)是一種分子水平的光譜分析技術(shù)。樣品被激光照射后，大部分光以與入射光相同的頻率發(fā)生散射（瑞利散射），但是仍有少量入射光以不同于入射光的頻率發(fā)生散射，即拉曼散射[65]。拉曼光譜技術(shù)具有樣品前處理簡單無損、檢測過程快速、全程操作簡便等特點。但是拉曼光譜易受干擾，導(dǎo)致信號較弱，實現(xiàn)痕量物質(zhì)的快速檢測可通過表面增強拉曼，即通過貴金屬表面糙化處理進而增強拉曼信號[66]。

Ma Xiaoyuan等[67]在多刺納米金粒子上修飾巰基化適配體作為表面增強拉曼納米探針，檢測豬肉中沙門氏菌，最優(yōu)條件下檢測限可達4 CFU/mL。Zhang Hui等[68]用適配體固定化磁性納米金粒子捕獲豬肉中金黃色葡萄球菌，優(yōu)化后表面增強拉曼法檢出限為35 CFU/mL，加標(biāo)回收率為94.12%～102.75%。Argyri等[69]使用拉曼光譜結(jié)合偏最小二乘回歸分析透氧和氣調(diào)2 種包裝的牛肉餡5 ℃貯藏期間的腐敗情況，精確檢測出菌落總數(shù)、乳酸菌數(shù)和腸桿菌數(shù)。楊鴻博[70]采用拉曼光譜技術(shù)預(yù)測貯藏21 d的牛肉中菌落總數(shù)和乳酸菌數(shù)的能力相關(guān)系數(shù)為0.75～0.99，驗證集均方根誤差為0.38～0.61。

3.3 免疫分析法

3.3.1 酶聯(lián)免疫法

酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）是在保持抗體（抗原）活性的基礎(chǔ)上連接到固相載體或酶上制成的功能化載體或酶標(biāo)抗體（酶標(biāo)抗原）[71]。通過建立功能化載體以催化底物檢測體系，逐步實現(xiàn)利用顏色變化判斷致病菌的種類及數(shù)量。該方法還可以檢測抗體、其他大分子及小分子物質(zhì)[72]。但是存在試劑盒需低溫存放、昂貴、壽命短、檢測中酶的活性易受環(huán)境影響、重復(fù)性和準(zhǔn)確性差等問題。

謝琿等[73]建立黃曲霉毒素B1（aflation B1，AFB1）間接競爭ELISA檢測法，檢測限為1.04 μg/L，通過該方法與進口試劑盒檢測結(jié)果相比，具有較好的重復(fù)性，可以用于快速篩檢飼料中AFB1。姚永忠等[74]在食品質(zhì)量安全檢測工作中，采用生物素-親和素斑點-ELISA法檢測李氏桿菌，檢測靈敏度達到104個/mL，并且整體檢測過程易于操作，不易受環(huán)境污染，檢測結(jié)果準(zhǔn)確度高。

3.3.2 膠體金免疫層析法

膠體金免疫層析法是將已知的抗原或抗體固定在具有特異性的載體上，利用抗原-抗體之間的顯色反應(yīng)，通過標(biāo)記、免疫反應(yīng)及色層分析法等形成的新型免疫檢測技術(shù)[75]。其優(yōu)勢為檢測結(jié)果直觀、樣品前處理方便、抗原-抗體特異性強、儀器和試劑價格較低等[76]。Song Chunmei等[77]開發(fā)的膠體金免疫層析試紙條，可用于檢測肉凍等食品中志賀氏菌和大腸桿菌O157:H7，具有檢測快速、結(jié)果準(zhǔn)確度高、價格低廉的優(yōu)點。

檢測新技術(shù)應(yīng)用優(yōu)缺點詳見表2。

表2 檢測新技術(shù)在腐敗菌中的應(yīng)用Table 2 Application of new technologies in detecting spoilage bacteria

4 結(jié) 語

本文綜述冰鮮雞肉中的腐敗微生物，確定冰鮮雞肉中優(yōu)勢腐敗菌，分析不同類型檢測新技術(shù)的研究進展及應(yīng)用情況，均能夠?qū)崿F(xiàn)快速、無損、高效檢測，但是新技術(shù)仍有諸多不足。PCR檢測技術(shù)樣品前處理復(fù)雜，檢測過程易受環(huán)境和操作污染，所需試劑較貴、對檢測人員要求較高；高光譜技術(shù)采集信息更全面的同時數(shù)據(jù)量大、干擾信息多、數(shù)據(jù)分析較繁瑣；近紅外光譜技術(shù)檢測過程中易出現(xiàn)光譜帶寬大、強度低、特征峰重疊、檢測易受干擾等情況。在我國，新技術(shù)、儀器商品化程度低，多數(shù)處于實驗室研究階段，不能滿足實際生產(chǎn)檢測需求。目前許多食品生產(chǎn)企業(yè)在實際生產(chǎn)中腐敗菌、致病菌等微生物的分離檢測仍以傳統(tǒng)方法為主，新技術(shù)使用率較低。

未來我國微生物檢測發(fā)展方向應(yīng)為操作簡便化、儀器產(chǎn)品化，通過各類學(xué)科技術(shù)的交叉與引進，形成現(xiàn)代化食品微生物檢測技術(shù)體系，滿足社會、企業(yè)等實際生產(chǎn)需要，不斷提高新技術(shù)的整體適用性，推動微生物檢測的發(fā)展，并廣泛應(yīng)用到食品衛(wèi)生檢測的各個領(lǐng)域。