胃黏膜病變中異常的黏蛋白表達(dá)及糖基化修飾

鄒 龍，楊愛明

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院 1消化內(nèi)科 2病理科，北京 100730

糖基化是蛋白質(zhì)最常見的翻譯后修飾。通過不同的糖基轉(zhuǎn)移酶等催化，蛋白質(zhì)與糖基共價相連，形成不同糖基化修飾的糖蛋白。糖蛋白是細(xì)胞的主要成分，其糖基結(jié)構(gòu)參與細(xì)胞的多種關(guān)鍵生理過程，包括蛋白質(zhì)的折疊、受體激活和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞黏附、免疫監(jiān)視等。如果蛋白質(zhì)糖基化異常，細(xì)胞的生物學(xué)行為可能改變，這與多種疾病甚至腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[1]。

黏蛋白是一類具有相似分子結(jié)構(gòu)的高度糖基化的蛋白質(zhì)家族，其蛋白質(zhì)核心富含脯氨酸(Pro)、絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)。黏蛋白經(jīng)過糖基化修飾形成的聚糖分子可占總體質(zhì)量的50%～90%，并最終決定黏蛋白的生化特性和功能[2]。目前鑒定出的黏蛋白家族有22個成員，分為分泌型黏蛋白和膜結(jié)合型黏蛋白，主要分布于上皮細(xì)胞。分泌型黏蛋白包括MUC2、MUC5B、MUC5AC、MUC 6～8、MUC19，通過層疊作用形成黏液凝膠層，覆蓋于上皮細(xì)胞表面，發(fā)揮保護(hù)上皮的作用；膜結(jié)合型黏蛋白包括MUC1、MUC3A、MUC3B、MUC4、MUC11～13、MUC15～17、MUC20～22等，通常定位于上皮細(xì)胞的頂端，維持上皮細(xì)胞極性，其胞外區(qū)聚糖結(jié)構(gòu)參與構(gòu)成黏液，胞內(nèi)區(qū)參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，影響細(xì)胞的增殖、細(xì)胞與細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)間的相互作用等。

細(xì)胞和組織如果發(fā)生了生理狀態(tài)的改變，會影響?zhàn)さ鞍椎奶腔揎椇捅磉_(dá)。黏蛋白及其聚糖在臨床方面已經(jīng)表現(xiàn)出很高的應(yīng)用價值，比如血清學(xué)標(biāo)志物CA15- 3、CA125所檢測的對象分別為MUC1、MUC16，它們已經(jīng)作為乳腺癌、卵巢癌等惡性腫瘤診斷及預(yù)后的標(biāo)志物。這些診斷標(biāo)志物雖已成熟應(yīng)用，但對疾病早期診斷的敏感性低，疾病特異性也不高。另外，以MUC1等黏蛋白為靶點(diǎn)已經(jīng)開展了多種免疫治療方法的探索，但目前主要應(yīng)用于卵巢癌、結(jié)腸癌、肺癌等惡性腫瘤[3]。監(jiān)測黏蛋白的表達(dá)及糖基化修飾在疾病過程中的變化，對于胃黏膜病變發(fā)現(xiàn)早期診斷標(biāo)志物也有幫助，在疾病的干預(yù)與治療方面也有應(yīng)用前景。

正常胃黏膜的黏蛋白表達(dá)及糖基化修飾

胃黏膜表面覆蓋的黏液可通過物理、化學(xué)機(jī)制保護(hù)上皮細(xì)胞，也能與胃腔內(nèi)病原體相互作用，發(fā)揮生物性保護(hù)功能，并參與調(diào)節(jié)宿主免疫反應(yīng)。構(gòu)成胃黏液的最主要分子為黏蛋白。黏蛋白的分布具有細(xì)胞和組織特異性。正常胃黏液主要由分泌型黏蛋白MUC5AC、MUC6和膜結(jié)合型黏蛋白MUC1的胞外區(qū)參與構(gòu)成，前兩者分別為胃表面上皮細(xì)胞、幽門腺體深部的細(xì)胞分泌，后者廣泛存在于表面上皮細(xì)胞的頂端。MUC1除了富含O-聚糖的胞外結(jié)構(gòu)，還有富含酪氨酸的高度保守的胞內(nèi)區(qū)，通過酪氨酸的磷酸化，與眾多蛋白質(zhì)相互作用，調(diào)節(jié)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[4]。

基于黏蛋白的蛋白質(zhì)核心的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，其糖基化修飾主要為黏蛋白型O-糖基化，即糖基與Ser或Thr殘基羥基的氧原子相連。這種糖鏈結(jié)構(gòu)簡單，但連接形式繁多。黏蛋白型O-糖基化的第1步均由N-乙酰氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶催化，將乙酰氨基半乳糖殘基供給Ser或Thr的羥基，形成Tn抗原。隨后多見的反應(yīng)模式為Tn抗原由半乳糖轉(zhuǎn)移酶催化，合成T抗原，又稱Core1。再由乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶催化形成Core2，并進(jìn)一步分支、延伸形成聚糖的主鏈和末端結(jié)構(gòu)。正常胃上皮細(xì)胞中，Core2是黏蛋白糖鏈的主要核心結(jié)構(gòu)，Tn、T抗原通常不會單獨(dú)表達(dá)[5- 6]。黏蛋白糖鏈末端主要為ABH血型抗原、Lewis血型抗原。MUC5AC、MUC1糖鏈末端主要是Lea、 Leb血型抗原，由巖藻糖轉(zhuǎn)移酶參與合成[4]。MUC6糖鏈末端主要為Lex、 Ley血型抗原，另外還有α- 1，4-N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶參與催化合成含有α-GlcNAc的糖鏈末端[2]。

催化黏蛋白型O-聚糖形成的糖基轉(zhuǎn)移酶在不同物種、個體、組織、生理狀態(tài)有特異性表達(dá)模式，可識別特定氨基酸序列，調(diào)節(jié)O-糖基化的位點(diǎn)和密度，從而決定不同組織和器官的糖基化模式[7]。唾液酸轉(zhuǎn)移酶在正常胃上皮細(xì)胞中較少表達(dá)，多在病理狀態(tài)下出現(xiàn)，參與Lea、Lex抗原和Tn、T抗原的唾液酸化，分別合成唾液酸-Lea(sialy-Lea，SLea)、唾液酸-Lex(sialy-Lex，SLex)抗原和唾液酸-Tn(sialyl-Tn，STn)、唾液酸-T(sialyl-T，ST)抗原。STn、ST抗原的合成會導(dǎo)致糖鏈的提前終止，形成不成熟的截短聚糖，影響?zhàn)さ鞍讟?gòu)型及功能。

幽門螺桿菌感染后的黏蛋白及其糖基化修飾改變

幽門螺桿菌(Helicobacterpylori，Hp)感染影響全球超過50%的成年人口，我國的感染率甚至超過70%[8]。約90%的胃部惡性腫瘤與Hp感染相關(guān)，1%～3%感染者可能發(fā)生胃癌或黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤[9- 10]。因而，Hp被WHO認(rèn)定為Ⅰ類致癌物。黏蛋白作為胃黏膜的屏障，在Hp感染及致病過程中發(fā)揮重要作用。

Hp的外膜蛋白具有凝集素樣的結(jié)合特性，可識別聚糖，是介導(dǎo)Hp在胃內(nèi)定植以及Hp與上皮細(xì)胞黏附的重要分子。目前研究最多的是血型抗原黏附素(blood group antigen binding adhesin，BabA)和唾液酸黏附素(sialic acid-binding adhesin，SabA)。BabA優(yōu)先與Leb血型抗原結(jié)合；SabA主要與唾液酸化的抗原SLea和SLex結(jié)合，是致病Hp在胃內(nèi)最常見的黏附方式[11]。它們的結(jié)合強(qiáng)度受pH值的影響，在中性環(huán)境中結(jié)合強(qiáng)度最高。正常狀態(tài)下，主要為MUC5AC攜帶Leb抗原，而很少有唾液酸化的聚糖存在。因此，表達(dá)BabA的Hp多與MUC5AC共定位于接近上皮細(xì)胞表面的黏液層。這是Hp一種自我保護(hù)機(jī)制，使細(xì)菌免受胃腔內(nèi)機(jī)械、化學(xué)因素的影響。Hp與MUC5AC結(jié)合會使Hp隨著胃的蠕動排出胃腔，減少胃內(nèi)細(xì)菌密度，也減少Hp與上皮細(xì)胞表面MUC1或糖脂的結(jié)合[11]。當(dāng)黏膜處于炎癥狀態(tài)，上皮細(xì)胞表達(dá)白細(xì)胞介素(interleukin，IL)- 1β、IL- 2、IL- 6、IL- 8、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α等促炎性細(xì)胞因子增多。這些促炎性細(xì)胞因子會激活解聚素金屬蛋白酶17(a disintegrin and metalloproteinase，ADAM17)、TNF-α轉(zhuǎn)化酶(TNF-α convertase，TACE)等蛋白酶，誘導(dǎo)MUC1分子的胞外糖鏈結(jié)構(gòu)解離，使與其結(jié)合的細(xì)菌被排出[4，12]。Hp慢性感染時，上皮細(xì)胞唾液酸合成酶表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致黏蛋白唾液酸化，不成熟截短聚糖表達(dá)增多，糖基化的總量下調(diào)。再加上MUC1這種胞外結(jié)構(gòu)的改變，黏蛋白對黏膜的保護(hù)作用會受到影響，使上皮細(xì)胞對外界刺激更敏感，導(dǎo)致炎癥狀態(tài)的持續(xù)。

Hp與黏蛋白型O-聚糖相互作用，會對細(xì)菌的生長和致病產(chǎn)生影響。健康胃黏膜產(chǎn)生的黏蛋白可抑制Hp生長。這一方面是由于BabA與Leb抗原結(jié)合會抑制Hp生長[7]；另一方面，MUC6糖鏈末端分子α-GlcNAc可抑制Hp細(xì)胞壁的重要組成成分膽甾醇-α-D-吡喃葡萄糖苷的合成，從而通過抗生素樣作用抑制Hp的生長，避免Hp分布于胃黏膜深部腺體[13]。另外，Hp外膜蛋白的表達(dá)具有動態(tài)性，這是細(xì)菌對宿主的一種適應(yīng)能力，在Hp相關(guān)疾病的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用。BabA與Leb抗原相結(jié)合會使細(xì)菌BabA表達(dá)減少而優(yōu)先表達(dá)SabA，促進(jìn)Hp與炎性胃黏膜的黏附[14- 15]。毒力因子cagA、ureA表達(dá)與BabA、SabA水平呈線性正相關(guān)[13]，這類細(xì)菌具有更強(qiáng)的致病性，與胃體萎縮、腸上皮化生、癌變等多種胃黏膜疾病相關(guān)[7]。

Hp會影響宿主黏蛋白的分泌、表達(dá)以及黏蛋白的糖基化。Hp感染使MUC5AC的分泌速度明顯減慢，并抑制黏蛋白的合成，導(dǎo)致表達(dá)MUC5AC、MUC1的上皮細(xì)胞明顯減少[16- 17]。在Hp感染狀態(tài)下，MUC6在胃表面上皮細(xì)胞中出現(xiàn)異常表達(dá)及定位[17]，但整體表達(dá)量沒有差異性變化[16]。

胃黏膜癌前狀態(tài)黏蛋白及其糖基化修飾改變

Correa級聯(lián)反應(yīng)是目前公認(rèn)的一種腸型胃癌的發(fā)病模型：由于Hp感染等因素引起胃黏膜慢性炎癥，導(dǎo)致多灶性腺體萎縮，并隨著萎縮的進(jìn)展，上皮細(xì)胞出現(xiàn)腸上皮化生、異型增生，最終發(fā)生癌變。據(jù)估計(jì)，慢性萎縮性胃炎者胃癌發(fā)生率為(0.53～15.24)/1000人年，腸上皮化生者胃癌發(fā)生率為(0.38～17.08)/1000人年[18]。低級別異型增生和高級別異型增生診斷后5年內(nèi)胃癌年發(fā)生率分別為0.6%和6.0%[19]。這些癌前狀態(tài)下，黏蛋白及其糖基化修飾也發(fā)生變化。

免疫組織化學(xué)半定量分析發(fā)現(xiàn)，萎縮性胃炎黏膜MUC5AC、MUC6表達(dá)均下調(diào)[20]。在正常胃黏膜中MUC6與α-GlcNAc共表達(dá)；而在慢性萎縮性胃炎患者的幽門腺中，α-GlcNAc表達(dá)量相對于MUC6顯著降低，Ki- 67指數(shù)相對更高[21]。

根據(jù)組織形態(tài)學(xué)和黏蛋白表達(dá)特征，腸上皮化生分為完全型腸上皮化生(Ⅰ型)和不完全型腸上皮化生(Ⅱ、Ⅲ型)。不同的腸上皮化生類型有不同的預(yù)后表現(xiàn)，Ⅰ型腸上皮化生黏膜癌變的風(fēng)險并未增加，而Ⅱ型、Ⅲ型腸上皮化生癌變相對危險度分別提高至2.14和4.58[22]。黏蛋白表達(dá)及糖基化修飾的差異是不同腸上皮化生類型的主要鑒別點(diǎn)之一。完全型腸上皮化生同時具有杯狀細(xì)胞、吸收細(xì)胞和潘氏細(xì)胞，其中杯狀細(xì)胞合成和分泌MUC2，而MUC1、MUC5AC和MUC6在化生細(xì)胞中的表達(dá)完全缺失。不完全型腸上皮化生有杯狀細(xì)胞和柱狀細(xì)胞，其中杯狀細(xì)胞表達(dá)和分泌腸型黏蛋白MUC2，多數(shù)情況下胃型黏蛋白MUC1、MUC5AC、MUC6也在杯狀細(xì)胞和柱狀細(xì)胞中均有表達(dá)[23- 24]。Ⅱ型腸上皮化生表達(dá)中性或唾液酸化的黏蛋白，Ⅲ型腸上皮化生為硫酸化的黏蛋白。腸上皮化生的上皮細(xì)胞中，Tn和STn的表達(dá)增加。STn主要分布于杯狀細(xì)胞，以MUC2為載體；Tn則主要分布于柱狀上皮[5]。

異型增生的上皮細(xì)胞免疫組織化學(xué)特征與不完全型腸上皮化生相似，同時具有胃型、腸型黏蛋白表達(dá)，伴有STn抗原表達(dá)的異常升高[25]。MUC5AC表達(dá)量在出現(xiàn)高級別異型增生時，較低級別異型增生增多，而MUC6表達(dá)進(jìn)一步下降，其糖鏈末端α-GlcNAc分子減少更明顯，Ki- 67也更高[25- 26]。

胃癌的黏蛋白及其糖基化修飾改變

根據(jù)我國腫瘤登記數(shù)據(jù)，2015年全國胃癌新發(fā)病例40.3萬例，累積發(fā)病率為2.29%，居癌癥發(fā)病譜第2位；死亡病例29.09萬例，累積死亡率為1.5%，居癌癥死亡順位第3位。中國人群胃癌世界人口標(biāo)化發(fā)病率和死亡率為全球人群世界人口標(biāo)化發(fā)病率和死亡率的2倍[27]。減輕胃癌的疾病負(fù)擔(dān)，仍是我國衛(wèi)生健康行業(yè)需要重點(diǎn)努力的方向。腫瘤的生長是由于細(xì)胞異常分裂，逃避死亡信號和免疫監(jiān)視，并且遷移至其他部位形成的。黏蛋白及其糖基化修飾的改變在腫瘤發(fā)生的每個過程中都發(fā)揮重要作用，參與癌細(xì)胞中信號傳導(dǎo)、腫瘤細(xì)胞的解離和侵襲、細(xì)胞-基質(zhì)相互作用、免疫調(diào)節(jié)和轉(zhuǎn)移等細(xì)胞生物學(xué)過程[28]。

胃癌有多種病理分型方式，臨床多用的是Lauren分型，將胃癌分為腸型和彌漫型。腸型胃癌是最多見的病理類型，多認(rèn)為由腸上皮化生進(jìn)展而來。腸型胃癌細(xì)胞中，Core2的表達(dá)量減少，MUC6糖鏈末端的α-GlcNAc表達(dá)也減少，而T抗原、硫酸化聚糖和STn、ST等不成熟的唾液酸化聚糖表達(dá)量較正常上皮細(xì)胞增多[6]。α-GlcNAc缺乏與更深的腫瘤浸潤、脈管浸潤相關(guān)[29]，STn表達(dá)的增多也是不良預(yù)后的獨(dú)立危險因素[30]。Ozaki等[31]也發(fā)現(xiàn)MUC1異常表達(dá)STn與胃癌更強(qiáng)的轉(zhuǎn)移能力相關(guān)，其機(jī)制可能為STn增多使腫瘤細(xì)胞與基質(zhì)蛋白的黏附減少[4]。腸型胃癌組織中，MUC2的表達(dá)異常升高，也是攜帶STn最主要的黏蛋白，轉(zhuǎn)移至淋巴管內(nèi)的腫瘤細(xì)胞也可見攜帶STn的MUC2聚集。腸型胃癌組織MUC1、MUC3、MUC4、MUC5B的表達(dá)量增多，而MUC5AC、MUC6表達(dá)下降[26]。MUC1的過表達(dá)與胃癌發(fā)生脈管浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和同步肝轉(zhuǎn)移相關(guān)[32]，MUC4在胃癌中表達(dá)升高是腫瘤不良生存預(yù)后的危險因素[33]。若背景黏膜MUC6表達(dá)缺失，則Ki- 67陽性細(xì)胞分布更多且也更廣，提示預(yù)后可能更差[34]。MUC1等膜結(jié)合型黏蛋白截短聚糖表達(dá)的增多會暴露抗原決定簇，與β-catenin形成胞內(nèi)復(fù)合物，調(diào)節(jié)Wnt信號通路，激活細(xì)胞核內(nèi)cyclin-D1的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡并形成腫瘤[3]。并且，MUC1等膜結(jié)合型黏蛋白異常表達(dá)的唾液酸化聚糖會與免疫細(xì)胞表面表達(dá)的凝集素siglec結(jié)合，抑制NK細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、Th1細(xì)胞的活化，促進(jìn)免疫細(xì)胞分泌IL- 10、轉(zhuǎn)化生長因子-β等細(xì)胞因子，發(fā)揮免疫逃避及免疫抑制特性[4]。

結(jié) 論

胃黏膜從正常狀態(tài)逐步發(fā)展為胃癌的過程中，上皮細(xì)胞黏蛋白及其糖基化修飾發(fā)生了異常的動態(tài)改變。MUC5AC表達(dá)的下調(diào)和黏蛋白唾液酸化聚糖表達(dá)的增多貫穿于整個疾病發(fā)展過程中，削弱了黏蛋白的保護(hù)作用。從萎縮性胃炎階段開始，MUC6表達(dá)量下調(diào)，其重要的糖鏈末端分子α-GlcNAc水平也出現(xiàn)更高程度的降低。處于這種異常黏蛋白表達(dá)及糖基化狀態(tài)的病變則預(yù)后更差。當(dāng)上皮細(xì)胞發(fā)生腸上皮化生，MUC2即異常表達(dá)于胃部。若腸上皮化生狀態(tài)下，硫酸化聚糖表達(dá)異常增多，則預(yù)示更高的癌變風(fēng)險。MUC1等膜結(jié)合型黏蛋白在胃癌中表達(dá)升高，其糖基化修飾也以截短的唾液酸化聚糖為主。這除了減弱對上皮細(xì)胞的保護(hù)，還會抑制細(xì)胞凋亡和宿主免疫，提示更差的預(yù)后，但也可作為干預(yù)的靶點(diǎn)。黏蛋白表達(dá)及糖基化修飾的改變反映了疾病狀態(tài)，反過來也會改變疾病進(jìn)程。了解這些分子改變有利于認(rèn)識胃上皮病變過程，對分子結(jié)構(gòu)的鑒定有助于尋找潛在的診斷、預(yù)后標(biāo)志物，甚至治療靶點(diǎn)。但由于糖蛋白結(jié)構(gòu)及合成過程的復(fù)雜性和異質(zhì)性，實(shí)現(xiàn)其在疾病診斷和治療中的應(yīng)用依然任重而道遠(yuǎn)。