花生致敏糖蛋白Ara h1糖鏈決定簇的質(zhì)譜分析

彭藝芳, 王承健, 王晶晶, 李玲梅, 晉萬軍, 強(qiáng)　珊, 師紅丹,張　英, 黃琳娟, 王仲孚

(西部資源生物與現(xiàn)代生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 陜西省生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 西安 710069)

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花生致敏糖蛋白Ara h1糖鏈決定簇的質(zhì)譜分析

彭藝芳, 王承健, 王晶晶, 李玲梅, 晉萬軍, 強(qiáng)珊, 師紅丹,張英, 黃琳娟, 王仲孚

(西部資源生物與現(xiàn)代生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 陜西省生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 西安 710069)

以花生種子總蛋白及其主要致敏糖蛋白Ara h1為研究對(duì)象, 采用“一釜法”對(duì)蛋白上的糖鏈進(jìn)行釋放并同時(shí)進(jìn)行衍生化標(biāo)記, 通過C18固相萃取柱純化, 以電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)、 多級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜(MSn)和親水性液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(HILIC-MS)進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析和定量分析. 結(jié)果表明, 蛋白Ara h1共有10條N-糖鏈, 其中7條為高甘露糖型, 2條為木糖修飾, 另外1條為與過敏原相關(guān)的核心α1,3-Fuc修飾N-糖鏈, 其含量約占總糖鏈的12.45%.

花生過敏; 致敏糖蛋白Ara h1; 糖鏈結(jié)構(gòu); 電噴霧質(zhì)譜; 親水性液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用

食物過敏是一類人體由于攝入某些食物而產(chǎn)生的變態(tài)反應(yīng), 患者可表現(xiàn)出過敏性休克、 蕁麻疹等癥狀, 嚴(yán)重時(shí)甚至危及生命[1,2]. 在發(fā)達(dá)國(guó)家成人食物過敏的患病率約為1%～2%, 而兒童則達(dá)到4%～8%[3,4]. 目前, 世界衛(wèi)生組織和農(nóng)業(yè)組織認(rèn)定的可引起人體過敏的食物有牛奶、 雞蛋、 大豆、 花生、 小麥、 堅(jiān)果類、 魚及貝殼類海產(chǎn)品等8類, 其中90%均能被過敏患者的血清識(shí)別, 而花生過敏則占到食物過敏的10%～47%[5,6]. 迄今, 已經(jīng)被國(guó)際過敏原命名小組(JUIC)確認(rèn)的花生過敏原有11種(Ara h1～Ara h11), 其中Ara h1和Ara h2是主要的過敏原, 可被90%的花生過敏患者血清識(shí)別[7].

研究發(fā)現(xiàn), 糖基化蛋白在過敏反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用, 而且蛋白上含有核心α1,3-Fuc修飾N-糖鏈?zhǔn)沁^敏反應(yīng)中IgE抗體識(shí)別的重要抗原表位[8,9]. 因此, 核心α1,3-Fuc修飾N-糖鏈的定性和定量分析對(duì)食物過敏研究具有重要意義. Ree等[8]和Kolarich[10]等以PNGase F酶解法釋放并分析了過敏蛋白Ara h1上的N-糖鏈結(jié)構(gòu), 但是由于所用的酶具有局限性, 不能完全釋放蛋白上的所有糖鏈, 導(dǎo)致丟失了部分結(jié)構(gòu)信息. 因此, 有必要采用其它方法進(jìn)一步對(duì)Ara h1上的糖鏈結(jié)構(gòu)進(jìn)行全面研究.

近年來, 我們[11]建立了一種可以定量釋放植物糖蛋白上所有N-糖鏈的方法, 再加之生物質(zhì)譜技術(shù)(Bio-MS)的快速發(fā)展, 為蛋白質(zhì)組學(xué)和糖組學(xué)研究提供了重要手段[12,13]. 基于此, 為了進(jìn)一步研究過敏蛋白Ara h1上的糖鏈結(jié)構(gòu), 本文以花生種子總蛋白和過敏蛋白Ara h1為對(duì)象, 采用本課題組[14]發(fā)展的可進(jìn)行糖蛋白N-糖鏈的非還原性釋放及同時(shí)標(biāo)記1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)的“一釜法”, 替代傳統(tǒng)的酶法釋放糖蛋白上的糖鏈, 并通過電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)、 多級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜(MSn)和親水液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(HILIC-MS)等方法對(duì)糖鏈進(jìn)行定性和定量分析, 為花生過敏原糖鏈決定簇的致敏性研究提供了參考.

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1試劑與儀器

河南新花生(白沙)購(gòu)自超市; 糖苷酶F(PNGase F)和糖苷酶A(PNGase A)購(gòu)自Sigma-Aldrich公司; 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)購(gòu)自阿拉丁公司; 標(biāo)準(zhǔn)蛋白Markers購(gòu)自美國(guó)Fermentas公司; 透析袋(截留分子量8000～14000); 十二烷基磺酸鈉(SDS)、 乙基苯基聚乙二醇(NP-40)、 二硫蘇糖醇(DTT)、 硫酸銨、 甲醇、 乙腈、 丙酮和二氯甲烷等均為分析純.

DD-5M型低溫離心機(jī)(湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司); 超低溫HetoPowerDry LL3000型真空冷凍干燥儀(丹麥Heto-Holten公司); DYY-6C型電泳儀(北京六一儀器廠); 石墨碳柱(150 mg/4 mL, 美國(guó)Alltech Associates公司); C18柱(100 mg/mL, 美國(guó)Waters公司); LTQ-XL電噴霧電離質(zhì)譜儀(美國(guó)Thermo Scientific公司).

1.2實(shí)驗(yàn)過程

1.2.1花生總蛋白的提取新鮮花生去除紅衣, 用粉碎機(jī)粉碎. 將花生粉末與丙酮按照1 g/10 mL比例混合, 于4 ℃下攪拌2 h脫脂, 然后在4 ℃下離心30 min(8000 r/min), 棄去上層清液, 將所得沉淀反復(fù)脫脂2次, 風(fēng)干后得到脫脂花生粉. 將脫脂花生粉與Tris-HCl緩沖液(50 mmol/L, pH=8.0)按照1 g/10 mL比例混合, 于4 ℃下攪拌12 h, 然后在4 ℃下離心30 min(10000 r/min), 取上層清液. 向沉淀中加入Tris-HCl緩沖液(50 mmol/L, pH=8.0)重復(fù)浸提2次, 將所得上層清液合并, 取部分冷凍干燥, 即得花生總蛋白, 于-20 ℃保存.

1.2.2Ara h1的分離純化將上述所得上層清液邊攪拌邊緩慢加入一定量的硫酸銨粉末, 使其充分溶解并使其飽和度分別達(dá)到10%和100%, 然后于4 ℃下離心10 min(11500 r/min). 將100%飽和度所得沉淀溶解后裝入透析袋, 在4 ℃下透析2 d(每天換水3次). 對(duì)透析后的溶液進(jìn)行冷凍干燥, 得到花生粗蛋白粉末, 于-20 ℃保存.

稱取花生粗蛋白粉末100 mg, 溶于1.5 mL Tris-HCl緩沖液(50 mmol/L, pH=8.0)中, 振蕩, 離心, 上樣至用Tris-HCl緩沖液(50 mmol/L, pH=8.0)洗脫平衡后的DEAE-sepharose fast flow陰離子交換柱, 采用含有0～0.4 mol/L NaCl的Tris-HCl緩沖液進(jìn)行梯度洗脫, 流速約為1 mL/min, 5 mL/管, 收集洗脫液, 在280 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值. 根據(jù)吸光值, 分管收集樣品, 透析, 冷凍干燥, 得到純度較高的過敏蛋白Ara h1[15].

1.2.3蛋白Ara h1的純度鑒定及膠條蛋白的回收采用濃度為12%的分離膠, 3%的濃縮膠, 對(duì)花生總蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE分析; 然后用考馬斯亮藍(lán)G-250染色, 再用脫色液進(jìn)行脫色; 最后使用凝膠成像儀分析膠片. 收集電泳所得膠片, 將目的條帶用刀片切下回收, 加入乙腈(體積分?jǐn)?shù)50%)進(jìn)行脫色, 然后研磨, 干燥, 得到含目的蛋白的凝膠粉末, 于-20 ℃保存.

1.2.4花生總蛋白糖鏈的PNGase F酶解法釋放和純化稱取10 mg花生總蛋白, 加入700 μL水和80 μL蛋白變性液(含有4.96 mg DTT和4 mg SDS), 于100 ℃干熱變性10 min, 冷卻至室溫. 加入80 μL磷酸鈉緩沖液(1 mol/L, pH=7.5)和80 μLNP-40溶液(體積分?jǐn)?shù)10%), 再加入2 μL PNGase F, 于37 ℃反應(yīng)24 h. 反應(yīng)結(jié)束后樣品用C18小柱和石墨碳柱純化, 純化方法參照文獻(xiàn)[16,17], 純化后得到花生總蛋白糖鏈樣品, 干燥濃縮后于-20 ℃保存, 用于PMP衍生化和ESI-MS分析.

1.2.5花生總蛋白糖鏈PNGase A酶解法釋放和純化稱取10 mg花生總蛋白, 將其溶于2.5 mL含有6 mg胃蛋白酶的鹽酸緩沖液(pH=2)中, 于37 ℃反應(yīng)16 h, 反應(yīng)結(jié)束后于100 ℃干熱5 min. 將樣品用氮?dú)獯蹈? 加入2 mL檸檬酸緩沖液(0.1 mol/L, pH=5)和2.5 μL PNGase A, 于37 ℃反應(yīng)48 h. 反應(yīng)結(jié)束后參照文獻(xiàn)[18]用C18小柱和石墨碳柱純化, 純化后得到花生總蛋白糖鏈樣品, 干燥濃縮后于-20 ℃保存, 用于PMP衍生化和ESI-MS分析.

1.2.6還原性糖鏈的PMP衍生化將酶解后的糖鏈樣品旋轉(zhuǎn)蒸干, 加入1 mL 0.3 mol/L NaOH溶液和1 mL(0.5 mol/L) PMP-甲醇溶液, 于70 ℃反應(yīng)30 min. 反應(yīng)結(jié)束后, 參照文獻(xiàn)[19]方法用C18小柱純化, 純化后得到糖鏈樣品, 干燥濃縮后于-20 ℃保存, 用于ESI-MS分析.

1.2.7花生總蛋白和蛋白Ara h1糖鏈的“一釜法”釋放稱取花生總蛋白10 mg, 加入含有0.7 mol/L PMP的NaOH溶液8 mL, 充分搖勻后, 于75 ℃反應(yīng)32 h. 另外稱取10 mg總蛋白進(jìn)行凝膠電泳, 切膠回收所有過敏蛋白Ara h1條帶, 向凝膠粉末中加入上述PMP-NaOH溶液, 于75 ℃反應(yīng)32 h. 反應(yīng)結(jié)束后, 參照文獻(xiàn)[14]方法用C18小柱純化糖鏈, 得到衍生化的總蛋白和Ara h1糖鏈樣品, 干燥濃縮后于-20 ℃保存, 用于ESI-MS分析.

1.2.8糖鏈樣品的全甲基化首先向干燥的糖鏈樣品中加入500 μL DMSO, 迅速封口后超聲5 min, 使樣品充分溶解, 然后加入1/2體積的干燥NaOH粉末, 封口后超聲1 h. 反應(yīng)結(jié)束后, 用滴管緩慢滴加500 μL CH3I, 室溫下避光振蕩2 h. 待反應(yīng)完成后, 參照文獻(xiàn)[20]方法, 萃取糖鏈樣品得到全甲基化的糖鏈, 用于MSn檢測(cè)分析.

1.2.9質(zhì)譜分析條件一級(jí)質(zhì)譜參數(shù):離子源電噴霧(ESI)電壓4000 V, 輔助氣體壓力0.507 MPa, 鞘氣壓力3.04 MPa, 毛細(xì)管電壓350 V, 毛細(xì)管溫度275 ℃, 毛細(xì)管透鏡電壓250 V, 上樣量2 μL, 流速200 μL/min, 流動(dòng)相為V(水)∶V(甲醇)=1∶1, 正離子模式掃描, 掃描范圍m/z900～2000. 二級(jí)質(zhì)譜參數(shù):離子源電噴霧(ESI)電壓4000 V, 輔助氣體壓力0.507 MPa, 鞘氣壓力2.03 MPa, 毛細(xì)管電壓37 V, 毛細(xì)管溫度300 ℃, 毛細(xì)管透鏡電壓250 V, 上樣量2 μL, 流速20 μL/min, 流動(dòng)相為V(水)∶V(甲醇)=1∶1, 碰撞氣體為氦氣, 狹縫寬度m/z3.0, 歸一化碰撞能量為50%. 掃描數(shù)據(jù)由Xcalibur軟件采集. 通過GlycoWorkbench軟件進(jìn)一步對(duì)多級(jí)裂解所得碎片進(jìn)行分析確認(rèn). HILIC-MS分析條件參考文獻(xiàn)[21].

2　結(jié)果與討論

2.1花生總蛋白的SDS-PAGE分離及Ara h1純度的鑒定

Fig.1　Purity evaluation for the purified Ara h1 by SDS-PAGE Lane 1 is the total protein, lane 2 is the purified Ara h1.

對(duì)花生總蛋白和純化所得過敏蛋白Ara h1進(jìn)行SDS-PAGE分析, 結(jié)果如圖1所示. 泳道1為總蛋白, 泳道2為蛋白Ara h1. 結(jié)果表明, 經(jīng)過脫脂、 浸提等步驟后得到的總蛋白共有10條帶, 結(jié)合文獻(xiàn)[15,22]報(bào)道可知, 最上面一條分子量約為63500的條帶為過敏蛋白Ara h1, 其余各條帶可能是過敏蛋白Ara h3和Ara h2的不同亞基. 經(jīng)過陰離子柱層析純化后, 得到的蛋白幾乎只含有蛋白Ara h1這一條帶(圖1泳道2), 證明純化后所得蛋白純度較高, 可用于進(jìn)一步的糖鏈分析研究.

2.2花生總蛋白及Ara h1糖鏈的質(zhì)譜分析

為了確定花生種子總蛋白上的糖鏈種類, 首先以不同的方法釋放總蛋白上的糖鏈, 質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果如圖S1(A)～(C)所示(見本文支持信息). 由圖S1(A)可知, 采用PNGase F酶解法得到的總蛋白糖鏈共有9種, 其中,m/z1045.37和1126.08均為[M+H+K]2+型雙電荷離子峰, 其余均為單電荷[M+Na]+型離子峰. 由圖S1(B)和(C)可知, 運(yùn)用化學(xué)法和PNGase A酶解法所釋放的花生總蛋白糖鏈數(shù)目一致, 均為10條, 其中,m/z1045.25和1126.15為[M+H+K]2+型離子峰,m/z1373.42為[M+H]+型離子峰, 其余都為[M+Na]+型離子峰. 通過比較這3種方法所得總蛋白糖鏈后發(fā)現(xiàn), PNGase F酶法比其它2種方法少了1條m/z1541.33的糖鏈, 通過GlycoWorkbench軟件預(yù)測(cè)可知該糖鏈含有1個(gè)Fuc殘基, 而其余各條糖鏈均相同. PNGase F酶解法沒有釋放核心α1,3-Fuc修飾N-糖鏈的活性, 而PNGase A酶解法與化學(xué)法對(duì)N-糖鏈的釋放則沒有這種選擇性, 因此可以推測(cè),m/z1541.33很可能是1條核心α1,3-Fuc修飾的N-糖鏈. 但是, 此結(jié)構(gòu)尚需其它分析手段進(jìn)行分析和驗(yàn)證.

圖S1(D)為化學(xué)法釋放的切膠所得過敏蛋白Ara h1的糖鏈質(zhì)譜圖. 通過對(duì)比發(fā)現(xiàn), 運(yùn)用化學(xué)法釋放的過敏蛋白Ara h1糖鏈的種類與化學(xué)法釋放的總蛋白糖鏈一致, 均為10條. 這說明過敏蛋白Ara h1是花生中主要的糖蛋白, 而且很可能帶有核心α1,3-Fuc修飾N-糖鏈.

2.3花生總蛋白及Ara h1糖鏈的HILIC-MS和MSn分析

由于相同分子量的糖鏈可能會(huì)存在同分異構(gòu)體, 為了進(jìn)一步分析糖鏈結(jié)構(gòu), 對(duì)所得糖鏈進(jìn)行了在線HILIC-MS和MS/MS分析, 所得萃取離子流色譜圖(EIC)如圖S2所示(見本文支持信息), MS/MS分析結(jié)果如圖S3所示(見本文支持信息).

圖S2(A1～A10)～(C1～C10)為不同方法釋放所得總蛋白N-糖鏈的EIC圖譜, 通過比較發(fā)現(xiàn), 酶法與化學(xué)法所得同一種糖鏈的出峰時(shí)間基本一致, 而且所有糖鏈均未發(fā)現(xiàn)同分異構(gòu)體的存在. 圖S2(D1～D10)為化學(xué)法釋放的過敏蛋白Ara h1糖鏈的EIC圖譜, 其數(shù)目、 種類及出峰時(shí)間均與總蛋白基本一致.

圖S2(B1～B10)～(D1～D10)顯示提取的m/z1557.25的離子流中出現(xiàn)了2個(gè)峰, 經(jīng)過分析后發(fā)現(xiàn)出峰時(shí)間在54 min后的峰為m/z1541.33所對(duì)應(yīng)糖鏈的[M+K]+型離子峰, 而不是m/z1557.25所對(duì)應(yīng)糖鏈的同分異構(gòu)體. 此外, 在PNGase F酶解法釋放的糖鏈中未提取到m/z1541.33的離子峰, 而其它2種方法在對(duì)應(yīng)的時(shí)間上都有顯著的離子信號(hào), 而且均為單一色譜峰.

通過MS/MS分析得到了各種糖鏈的序列結(jié)構(gòu)信息(見圖S3). 通過分析m/z1541.25這條糖鏈的MS/MS譜圖, 發(fā)現(xiàn)2個(gè)m/z分別為1395.33和712.17的特征峰, 通過計(jì)算該糖鏈殘基的分子量可知, 當(dāng)糖鏈脫掉1個(gè)分子量為146的殘基和132的殘基時(shí), 可以產(chǎn)生這2個(gè)特征峰, 同時(shí)結(jié)合文獻(xiàn)[8]報(bào)道的植物中所含該分子量的殘基為Fuc和Xyl, 確定m/z1541.25是1條同時(shí)含有Xyl與核心Fuc殘基的糖鏈. 因此, 結(jié)合上述MS與在線HILIC-MS分析結(jié)果可以確定, 花生總蛋白與Ara h1均含有1條同時(shí)被Xyl與核心α1,3-Fuc修飾的N-糖鏈. 此外, 還新發(fā)現(xiàn)了m/z1045.25, 1126.10, 1263.17和1911.67其它4條糖鏈的存在.

2.4過敏蛋白糖鏈結(jié)構(gòu)的全甲基化及MSn分析

甲基化屬于一種常見的糖鏈衍生化分析方法, 經(jīng)過甲基化后的糖鏈?zhǔn)杷栽鰪?qiáng); 且未經(jīng)過甲基化處理時(shí), 糖鏈發(fā)生穿環(huán)裂解后在不同部位發(fā)生斷裂, 產(chǎn)生的裂解碎片不具有唯一性, 無法準(zhǔn)確判定糖鏈的連接方式. 經(jīng)甲基化處理后, 采用MSn分析時(shí)會(huì)產(chǎn)生一系列特征性的碎片離子峰, 從而可精確判定糖鏈的連接方式. 因此, 為了進(jìn)一步分析各種糖鏈的連接方式, 并對(duì)其序列結(jié)構(gòu)進(jìn)行驗(yàn)證, 本文對(duì)各種糖鏈進(jìn)行全甲基化衍生, 然后進(jìn)行了MSn分析.

如圖S4(見本文支持信息)所示, 糖鏈H3N2FucXyl(PMP)2(m/z1541.25)經(jīng)過全甲基化衍生后, 變?yōu)閙/z1863.50, 以MSn進(jìn)行分析時(shí)產(chǎn)生一系列碎片離子峰. 所選擇的MSn裂解路徑如下:MS2(m/z1054.33)→MS3(m/z880.17)→MS4(m/z635.25)→MS5(m/z417.17)→MS6(m/z199.92). 通過計(jì)算譜圖中的離子碎片峰分子量, 結(jié)合GlycoWorkbench軟件對(duì)這些碎片離子峰進(jìn)行歸屬, 發(fā)現(xiàn)當(dāng)N-乙酰葡糖胺的2,4位糖苷鍵發(fā)生穿環(huán)裂解斷裂后, 連接在該糖殘基3位C上的Fuc會(huì)脫落, 此時(shí)形成的碎片分子量為1302.17. 若是1,6連接的Fuc, 則不會(huì)形成這樣的碎片, 因此可以確定Fuc的連接方式為α1,3. 另外, 發(fā)現(xiàn)當(dāng)與木糖相連的甘露糖0,4位糖苷鍵發(fā)生穿環(huán)裂解后會(huì)形成分子量為1585.42的離子峰, 再結(jié)合文獻(xiàn)[8,10]對(duì)花生過敏蛋白Ara h1糖鏈的結(jié)構(gòu)研究結(jié)果, 可以確定出Xyl的連接方式為β1,2. 這表明該糖鏈為同時(shí)帶有β1,2-Xyl修飾與核心α1,3-Fuc修飾N-糖鏈. 其它糖鏈的分析結(jié)果均與此類似. 由此可以進(jìn)一步確定, 花生總蛋白與Ara h1均含有同時(shí)被β1,2-Xyl與核心α1,3-Fuc修飾N-糖鏈.

2.5花生總蛋白及Ara h1糖鏈的定量分析

基于質(zhì)譜和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析所得數(shù)據(jù), 對(duì)花生過敏蛋白Ara h1糖鏈的單糖組成、 分子量、 離子型、 糖結(jié)構(gòu)、 出峰時(shí)間、 糖型及釋放方法等數(shù)據(jù)進(jìn)行歸納總結(jié), 結(jié)果如表1所示.

根據(jù)各種糖鏈的EIC色譜峰面積可計(jì)算出每條糖鏈在總糖鏈中所占比例, 結(jié)果示于圖2. 可見, “一釜法”與PNGase A酶解法釋放的部分糖鏈在豐度分布上存在一定差異, 尤其是“一釜法”對(duì)核心α1,3-Fuc修飾N-糖鏈的釋放效率明顯高于PNGase A酶法. 另外, 發(fā)現(xiàn)總蛋白中的糖鏈含量與過敏蛋白Ara h1的糖鏈在豐度分布上幾乎一致, 表明在花生蛋白中Ara h1是主要的過敏原糖蛋白.

另外, 對(duì)不同糖鏈的糖型及其所占比例進(jìn)行了分析, 統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖3所示. 可見, 過敏蛋白Ara h1的糖鏈可分為核心五糖結(jié)構(gòu)、 雜合型、 復(fù)雜型和高甘露糖型4種類型. 其中, 五糖核心型糖鏈有1條, 占總糖鏈的3.58%; 復(fù)雜型糖鏈有2條, 占22.07%; 雜合型糖鏈有1條, 占29.10%; 高甘露糖型糖鏈有6條, 占45.25%. 在所有類型糖鏈中高甘露糖型所占比例最高. 值得注意的是, 致敏蛋白Ara h1中核心α1,3-Fuc修飾N-糖鏈占到了總糖鏈的12.45%, 說明致敏蛋白Ara h1具有過敏相關(guān)糖鏈決定簇結(jié)構(gòu).

Table 1　Compositions, proposed structures, release methods and types of N-glycans from Ara h1

a. [M+H]+;b. [M+Na]+;c. [M+K]+;d. [M+H+K]2+. H:Hexose; N:N-acetyl hexosamine; F:fucose; X:xylose.

Fig.2　Quantitative analysis of the N-glycans released by three different methodsa.; b.; c.; d.; e.; f.; g.; h.; i.; j..

Fig.3　Quantitative analysis of the N-glycans released from Ara h1

3　結(jié)　　論

通過MS, HILIC-MS及MSn分析, 發(fā)現(xiàn)花生總蛋白與致敏蛋白Ara h1均含有典型的核心α1,3-Fuc修飾及β1,2-Xyl修飾的糖鏈, 其PMP標(biāo)記物在MS分析中的質(zhì)荷比為1541.33, 無同分異構(gòu)體存在, 其單糖組成為H3N2FucXyl, 含量約占總糖鏈的12.45%. 此外, 還發(fā)現(xiàn)了3條高甘露糖型糖鏈H7N2, H8N2和H9N2, 以及1條五糖核心型糖鏈H3N2. 研究結(jié)果表明, 本實(shí)驗(yàn)室發(fā)展的化學(xué)法可以完全釋放含有核心α1,3-Fuc修飾的糖鏈, 且釋放效率較高, 因此在研究過敏蛋白糖鏈結(jié)構(gòu)上值得推廣.

支持信息見http://www.cjcu.jlu.edu.cn/CN/10.7503/cjcu20160147.

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(Ed.:P, H, F, K)

? Supported by the National Natural Science Foundation of China(Nos.21375103, 31370804).

Analysis of Antigenic Determinant Glycans of Peanut Allergy Glycoprotein Ara h1 by Mass Spectrometry?

PENG Yifang, WANG Chengjian, WANG Jingjing, LI Lingmei, JIN Wanjun, QIANG Shan,SHI Hongdan, ZHANG Ying, HUANG Linjuan, WANG Zhongfu*

(Key Laboratory of Resource Biology and Biotechnology in Western China, Ministry of Education,ProvincialKeyLaboratoryofBiotechnology,CollegeofLifeSciences,NorthwestUniversity,Xi'an710069,China)

Peanut seed total protein and glycoprotein Ara h1, which can cause allergic reactions, were chosen as the target materials in this study. Firstly, the glycans were released and labeled with 1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone(PMP) by recently developed “one-pot” method. Subsequently, the glycans were fractionated and enriched through C18 solid phase extraction column. Finally, the obtained glycans were analysed by electrospray ionization mass spectrometry(ESI-MS), MSnand Hydrophilic interaction liquid chsomatography-mass spectrometry(HILIC-MS). The results indicated that Ara h1 has tenN-glycans, including seven high-mannose type, two ones with xylose modification, and one allergenic coreα1,3-fucosylatedN-glycan, the content of which is 12.45% of total glycans.

Peanut allergy; Allergenic glycoprotein Ara h1; Glycan structure; Electrospray ionization mass spectrometry(ESI-MS); Hydrophilic interaction liquid chsomatography-mass spectrometry(HILIC-MS)

10.7503/cjcu20160147

2016-03-14. 網(wǎng)絡(luò)出版日期:2016-08-26.

國(guó)家自然科學(xué)基金(批準(zhǔn)號(hào):21375103, 31370804)資助.

O657.6; O629.12

A

聯(lián)系人簡(jiǎn)介:王仲孚, 男, 博士, 教授, 博士生導(dǎo)師, 主要從事糖生物學(xué)與糖工程研究. E-mail:wangzhf@nwu.edu.cn