舌癌臨床樣本N-連接糖鏈的表達分析

郭 輝，張 健，楊剛龍，黃如今，郭 佳

(1.江南大學 無錫醫(yī)學院，無錫 214122; 2.江南大學 糖化學與生物技術(shù)教育部重點實驗室，無錫 214122; 3.南京醫(yī)科大學附屬無錫二院 口腔科，無錫 214122)

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舌癌臨床樣本N-連接糖鏈的表達分析

郭 輝1，張 健3，楊剛龍2，黃如今2，郭 佳2

(1.江南大學 無錫醫(yī)學院，無錫 214122; 2.江南大學 糖化學與生物技術(shù)教育部重點實驗室，無錫 214122; 3.南京醫(yī)科大學附屬無錫二院 口腔科，無錫 214122)

從糖組學角度分析健康志愿者和舌癌患者血清中差異表達的N-連接糖鏈，找出與舌癌密切相關(guān)的N-連接糖鏈結(jié)構(gòu)，為舌癌早期診斷、治療及預后提供參考依據(jù)。以臨床血清樣品為研究材料，采用濾膜分離全糖蛋白N-連接糖鏈法(N-glycan-FASP-T)對健康志愿者和舌癌患者血清中全糖蛋白N-連接糖鏈分別進行比較分析,并利用MALDI-TOF/TOF串聯(lián)質(zhì)譜解析糖鏈結(jié)構(gòu)，通過一級、二級質(zhì)譜方法分析糖鏈結(jié)構(gòu)和種類，并通過對糖鏈豐度數(shù)據(jù)的ROC曲線分析等統(tǒng)計學方法分析確定其表達水平對舌癌的影響。結(jié)果表明，與健康志愿者相比，舌癌患者血清糖鏈特征主要有：雜合型糖鏈比例升高；在復合型糖鏈中，三天線比例升高，而二天線及四天線的比例降低；末端Neu5Gc 增加；平分型糖鏈比例升高。統(tǒng)計學分析發(fā)現(xiàn)其中有10個糖鏈結(jié)構(gòu)在疾病發(fā)生過程中顯著上調(diào)(AUC值大于0.50，其中m/z=1256.510/1418.573的兩個糖鏈的AUC值達到了0.75)，可以作為潛在的生物標志物并可以進行深入探究，為舌癌早期診斷提供臨床參考依據(jù)。

舌癌；MALDI-TOF/TOF-MS；N-glycan-FASP-T；N-連接糖鏈；糖組學

舌癌是口腔頜面部常見的惡性腫瘤，具有高發(fā)病率和生存率低的特點[1]。流行病學研究發(fā)現(xiàn)，口腔易發(fā)生癌變的部位是舌體，多發(fā)生于男性，且發(fā)病年齡越來越年輕化，因此越來越受到眾多學者的關(guān)注[2]。相關(guān)研究中表明在正常的上皮細胞中只能檢測到GalNAc-T3，而在舌癌患者上皮細胞中能檢測到N-乙酰半乳糖胺轉(zhuǎn)移酶3(GalNAc-T3)和N-乙酰半乳糖胺轉(zhuǎn)移酶6(GalNAc-T6)[3]。由此看來，在舌癌病變的過程中糖鏈發(fā)生變化。因此推測在舌癌患者的血清和組織樣本中同樣也存在蛋白質(zhì)糖基化修飾異常的現(xiàn)象。為了驗證這一推斷，我們以臨床健康人和舌癌患者手術(shù)前后的血清樣品為研究材料，采用濾膜分離血清中全糖蛋白N-連接糖鏈的方法，利用MALDI-TOF/TOF串聯(lián)質(zhì)譜分析不同樣品中N-連接糖鏈的表達差異性，并通過一級、二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析糖鏈結(jié)構(gòu)和種類，找出與舌癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的糖蛋白N-連接糖鏈結(jié)構(gòu)，為舌癌早期的診斷、及時治療及良好預后提供重要的參考依據(jù)[4]。

1 材料與方法

1.1 材料

500 μL的分子篩超濾管(SIGMA-ALDRICH公司)；1.5 mL離心管(Corning公司)；舌癌病人血清樣本由無錫市第二人民醫(yī)院的張健醫(yī)生惠贈；臺式離心機(HITECHI公司)；ultrafleXtreme MALDI-TOF/TOF-MS(Bruker Daltonics公司)；離心濃縮儀(Martin Christ公司)；iMark酶標儀(Biorad公司)。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集和預處理 實驗中所用到的舌癌病人血清樣本主要包括舌癌病人血清16例(術(shù)前8例，術(shù)后8例)，健康志愿者血清7例。樣品采集方法：從無錫市第二人民醫(yī)院獲取健康志愿者血清，口腔鱗狀細胞癌病人術(shù)前、術(shù)后5 d血清各8份，在30 min～2 h之間對血清進行1200 r/min離心15 min，測定樣品的蛋白質(zhì)濃度，分裝-80℃保存?zhèn)溆?。為了保證實驗的準確性和可信度，以下實驗重復3次。

1.2.2 血清樣品的選擇及N-連接糖鏈的分離富集

在10 ku超濾膜中加入2 mg蛋白和200 μL的8 mol/L尿素，14 000r/min離心15 min，棄流出液；重復1次；加10 mmol/L的DTT溶液150 μL，混勻，于56℃孵育45 min，14 000 r/min離心10 min，棄流出液；加150 μL的20 mmol/L的IAM，暗室溫孵育20 min，14 000 r/min離心10 min，棄流出液；加150 μL的40 mmol/L NH4HCO3，振蕩混合2 min，14 000 r/min離心10 min，棄流出液，重復3次。將超濾管移至新的收集管中，加入200 μL PNGase F酶液，振蕩混合2 min，37℃濕盒孵育過夜，14 000 r/min離心10 min，棄流出液；加入200 μL的超純水，14 000 r/min離心8 min，重復1次。冷凍干燥流出液。

1.2.3 糖鏈的除鹽(Clean up)處理 加100 μL的Sepharose 4B和1 mL的甲醇水溶液(1：1)至離心管中，搖勻，12 000 r/min離心5 min，棄上清，重復2次。再加5：1：1的正丁醇：甲醇：水溶液1 mL，搖勻，12 000 r/min離心5min，棄上清，重復清洗2次。向糖鏈樣品中加入500 μL的5：1：1的正丁醇：甲醇：水溶液，上樣至Sepharose 4B離心管，搖勻，25℃振蕩反應1 h，14 000 r/min離心15 min，棄上清。加1 mL 5：1：1的正丁醇：甲醇：水溶液，搖勻，12 000 r/min離心5 min，棄上清，重復清洗3次。加1 mL的甲醇水溶液(1：1)搖勻，25℃振蕩20 min，12 000 r/min離心15 min，收集上清。重復1次，冷凍干燥樣品[5]。

1.2.4 MALDL-TOF/TOF-MS解析糖鏈 應用MALDI-TOF/TOF-MS儀器解析血清中糖蛋白的N-連接糖鏈。用50%的甲醇溶液4 μL溶解糖鏈，取1.5 μL糖鏈溶液點樣于MTP Anchorchip 384靶板上，晾干。加20 mg/mL基質(zhì)DHB 1 μL至樣品板上，自然晾干。以反射陽性離子模式鑒定多糖，用標準多肽樣品作為外標校正質(zhì)譜儀。再多點采集每個樣品的圖譜，每個圖譜掃描500次，將所有圖譜疊加獲得多糖一級圖譜。從一級圖譜中選擇質(zhì)譜峰進行二級質(zhì)譜分析，用Glycoworkbench軟件分析糖鏈的二級質(zhì)譜圖[6]。

1.2.5 糖鏈的質(zhì)譜結(jié)構(gòu)分析 在flexAnalysis軟件中取信噪比大于6的質(zhì)譜峰做后續(xù)分析，將所得糖鏈的m/z和信號強度用Glycoworkbench軟件分析。從數(shù)據(jù)庫導出每一個質(zhì)荷比可能對應的糖鏈結(jié)構(gòu)，對這些有可能的結(jié)構(gòu)再進一步通過二級質(zhì)譜進行確認驗證，然后得到可能性較大的一個或幾個。

2 結(jié)果與分析

2.1 舌癌血液樣品N-連接糖鏈糖組圖譜分析

蛋白質(zhì)的糖基化異常是腫瘤發(fā)生與發(fā)展過程中的一個基本特性，與腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過程有密切的關(guān)系[7-10]，要了解腫瘤中蛋白質(zhì)糖基化異常的相關(guān)機制，進一步確認潛在的N-連接糖鏈腫瘤標志物，首先要對特異性N-連接糖鏈的結(jié)構(gòu)進行鑒定、篩選和解析[11]。在所有糖鏈結(jié)構(gòu)解析方法中，質(zhì)譜具有高分辨率和高靈敏性等優(yōu)點，利用質(zhì)譜儀對糖鏈樣品進行檢測，可以分析獲得糖鏈結(jié)構(gòu)[12-13]。本實驗將舌癌病人血清(術(shù)前8例，術(shù)后8例)和健康志愿者血清(7例)利用一級、二級質(zhì)譜分析，獲得舌癌血清樣品的N-連接糖鏈質(zhì)譜圖，并進行對比分析，找出疾病不同階段的糖鏈差異，并對糖鏈結(jié)構(gòu)進行了二級結(jié)構(gòu)的分析，已確認糖鏈詳細信息(圖1)。

經(jīng)過一級、二級質(zhì)譜的解析，得到注釋(表1)。

圖1 健康志愿者、術(shù)前舌癌患者和術(shù)后5 d舌癌患者血清中N-連接糖鏈一級(A)、二級(B)質(zhì)譜圖

Fig 1 MALDI-TOF/TOF-MS spectra of total N-glycans of the healthy volunteers,oral cancer patients and oral cancer patients after operative treatment in five days.Profiling of the N-linked glycan chain (A),and MALDI-TOF/TOF-MS analysis of N-glycan precursor ions in MS spectra(B)

表1 一級質(zhì)譜數(shù)據(jù)注釋

續(xù)表1(continued table 1)

編號No.試驗m/zExperimental理論m/zTheoretical糖鏈結(jié)構(gòu)Glycanstructure帶電離子Chargedion平均相對面積Averagerelativearea舌癌Oralcancer術(shù)后Postoperative健康者Healthy221808.7561809.6393[M+Na]+0.7860.7540.741231824.6971825.6342[M+Na]+0.0360.0420.090241849.7391850.6659[M+Na]+0.1860.2180.217251865.6581866.6608[M+Na]+0.0320.0700.068261869.6641869.7105[M+H]+-0.006-271894.0041892.6887[M+H]+0.0300.0570.076281904.7591905.6339[M+H]+0.1710.1950.139291909.4941907.6873[M+Na]+0.0840.1280.084301926.3441926.7319[M+H]+0.0130.0270.037311975.8081974.7418[M+H]+0.4300.6530.599321991.4551990.7367[M+H]+0.0660.0650.146332011.8602012.7187[M+Na]+0.1650.1890.144342027.9342028.7136[M+Na]+0.0190.0280.038352031.7342031.7633[M+Na]+0.0470.0500.060362035.5552034.6336[M+Na]+0.0230.0720.049372121.9402120.7997[M+H]+0.1190.1680.206382137.7332135.7742[M+H]+--0.021392158.9902158.7766[M+Na]+0.0220.0330.057402174.5112174.7751[M+Na]+-0.0120.027412177.5822177.8212[M+H]+0.0260.0240.044

續(xù)表1(continued table 1)

編號No.試驗m/zExperimental理論m/zTheoretical糖鏈結(jié)構(gòu)Glycanstructure帶電離子Chargedion平均相對面積Averagerelativearea舌癌Oralcancer術(shù)后Postoperative健康者Healthy422206.8762207.7576[M+H]+0.0400.0620.085432222.6032223.7903[M+H]+0.0200.0340.048442274.9262275.8692[M+H]+--0.014452288.8902288.8396[M+Na]+0.4310.5870.586462292.1522291.8641[M+H]+--0.076472304.4962304.8345[M+Na]+0.0570.0900.125482320.8212319.8090[M+Na]+--0.013492325.0862323.8791[M+Na]+0.0620.0770.112502340.5322339.8740[M+H]+0.0190.0250.049512434.5322433.8771[M+H]+0.0170.0200.037522486.5482484.9115[M+H]+0.007--532637.5332638.9480[M+H]+0.0060.0050.005542653.5022652.9541[M+Na]+--0.010552966.4492965.1070[M+H]+0.004-0.010563112.4503111.1650[M+H]+0.003--

2.2 不同糖型N-連接糖鏈在舌癌中的比較分析

本實驗從血清中共分離獲得56種N-連接糖鏈結(jié)構(gòu)，糖鏈結(jié)構(gòu)峰型明顯，信噪比均大于6。通過對每個樣本、多次重復的實驗，我們發(fā)現(xiàn)患者血清(樣本數(shù)：16)與健康志愿者血清(樣本數(shù)：7)中36個糖鏈的表達有明顯的差異，其中有30個糖鏈結(jié)構(gòu)為巖藻糖化，有5個在健康志愿者體內(nèi)特異性的表達，有6個在病人體內(nèi)特異性表達；7個糖鏈結(jié)構(gòu)為唾液酸化。為了準確、直觀地分析血清中各種類型的 N-連接糖鏈表達水平的變化，我們把注釋的糖鏈分為高甘露型糖鏈(high-mannose)、雜合型糖鏈(hybrid)、二天線型糖鏈(biantennary)、多天線型糖鏈 (multiantennary)和平分型糖鏈(bisected)等5類，分別分析這5種糖鏈，希望發(fā)現(xiàn)不同糖鏈在舌癌發(fā)生過程中的規(guī)律，進而了解N-連接糖鏈與舌癌之間的關(guān)系。從表中可以看出不同類型的N-連接糖鏈在舌癌中有較明顯的變化。健康志愿者和舌癌患者血清在雜合型的表達上具有明顯的差別：健康志愿者血清中雜合型比例明顯要低于病人手術(shù)前(20.0% VS 31.9%)，病人手術(shù)后該比例有一定的降低。在健康志愿者和舌癌患者血清中復雜型糖鏈的精細結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化。與健康志愿者相比，舌癌患者血清中糖鏈結(jié)構(gòu)具有3個典型的特點：1)在復合型糖鏈中，三天線比例升高，而二天線及四天線的降低。2)末端Neu5Gc增加，人體細胞缺少從Neu5Ac轉(zhuǎn)化為Neu5Gc的唾液酸羥化酶，因此健康志愿者體內(nèi)不存在Neu5Gc。在腫瘤細胞表面卻高表達Neu5Gc，推測腫瘤細胞中的唾液酸羥化酶高表達，將Neu5Ac轉(zhuǎn)化為Neu5Gc，導致腫瘤細胞中的Neu5Ac減少[14]。3)平分型糖鏈比例較高，在手術(shù)后有降低的現(xiàn)象(見表2)。

表2 血清樣本中不同類型的糖鏈比例(%)

圖2 舌癌血清樣品中 N-連接糖鏈AUC值大于0.5的ROC曲線分析圖Fig 2 ROC curve analysis of serum samples oral cancer N-glycan chain

2.3 舌癌血清樣品中 N-連接糖鏈的ROC曲線分析

為了尋找潛在的糖鏈分子標志物，作為臨床診斷。將每一個糖鏈進行ROC曲線分析。從源數(shù)據(jù)56個糖鏈中，挑選出18個糖鏈作為可能的診斷依據(jù)，其AUC值大于0.5，在統(tǒng)計學上可以認為是準確的，而其中的1256.510、1418.573兩個糖鏈的AUC值為0.750，可以認為十分準確。從ROC曲線分析可以發(fā)現(xiàn)m/z為1137.440、1337.635、1340.543、1418.535、1442.595、1500.649、1546.557、1708.708、1808.756、2486.548 10個峰在病人血清中表達上調(diào)，同時他們的AUC值均大于0.5，基本可以作為診斷依據(jù)。m/z為1256.463、1418.535這兩個峰的AUC值達到0.7以上(圖2)，可以作為診斷依據(jù)。

3 討論

腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個極其復雜的過程，在這個過程中有多種基因及其產(chǎn)物參與其中，因此，探討舌癌發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)鍵性因素并加以干預，或許能推遲或遏止舌癌的發(fā)生發(fā)展[15]。許多學者希望能從血液、體液等非創(chuàng)傷的臨床樣品中找到一種用于診斷舌癌的分子標志物。目前有研究者發(fā)現(xiàn)與舌組織發(fā)生癌變相關(guān)的基因和蛋白質(zhì)有TWIST1、MMPs、p53、HMGB1[16-17]，但是只能在晚期才能進行臨床的檢測確認與癌變有關(guān)的標志物，有的標志物則在良性與惡性腫瘤中無明顯差異性的表達，目前尚未找到十分有力的診斷參考標志物[18]。大量研究表明，在探討癌癥生物標記分子的過程中，大多數(shù)細胞的糖蛋白異常表達，例如在肝癌發(fā)生發(fā)展的過程中，異常表達唾液酸化糖聚合物，檢測到在健康志愿者體內(nèi)不存在的Neu5Gc[19]；前列腺癌的臨床樣本中，也發(fā)現(xiàn)某一些糖鏈異常表達[20]等。這些研究結(jié)果均表明糖類物質(zhì)和癌癥之間存在一定的關(guān)系，但是很少從糖鏈的角度來研究舌癌的發(fā)病機理，尚未有人把糖鏈作為臨床診斷的標志物。鑒于糖組學技術(shù)(如芯片技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)等)可以用于深入廣泛地研究糖類物質(zhì)在舌癌發(fā)生過程中的作用[21-22]，目前，與CEA(Carcinoembryonic Antigen )、CA125(Cancer Antigen 125)、TSGF(Tumor Supplied Group of Factors)和CA153(Cancer Antigen 153)等聯(lián)合診斷方法相比較，糖鏈結(jié)構(gòu)的檢測更具有特異性與靈敏性[23]。同時，由于糖鏈結(jié)構(gòu)的高度多變性，舌癌的臨床診治標準有望越來越細化，并具有個體性。

本實驗利用濾膜分離全糖蛋白N-連接糖鏈法(N-glycan-FASP-T)[24]建立一種在糖蛋白水平上鑒定舌癌發(fā)生時人血清中糖蛋白的變化情況，使其能夠作為一種舌癌發(fā)生早期診斷方法。最后利用MALDI-TOF/TOF-MS技術(shù)對23例，3類臨床血清樣本的N-連接糖鏈進行定量分析，獲得舌癌的 N-連接糖鏈的譜圖，共鑒定和注釋56種 N-連接糖鏈及其最可能的糖鏈結(jié)構(gòu)。通過對糖鏈在不同血清樣本中定量分析對比，確定N-連接糖鏈在健康志愿者和舌癌患者血清中的表達差異性，為進一步探索有效的舌癌分子標志物開拓了新的思路。對獲得的糖鏈結(jié)構(gòu)進行糖型分析后發(fā)現(xiàn)，在舌癌患者血清中高表達復合型糖鏈中的三天線、唾液酸化、巖藻糖化和平分型糖鏈，并推測高表達唾液酸糖基轉(zhuǎn)移酶和巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶，為研究相關(guān)糖基轉(zhuǎn)移酶表達的變化提供信息基礎。然而，在手術(shù)后平分型糖鏈、唾液酸化復合型中二天線和四天線以及雜合型糖鏈有降低的現(xiàn)象，從而表明舌癌病人在手術(shù)后，病情得到好轉(zhuǎn)，從糖鏈的角度來分析，術(shù)后舌癌患者越來越接近健康志愿者的水平。我們推測通過闡明這些抑制復雜型糖過表達的分子機理有可能為防止舌癌腫瘤惡化提供一定的指導意義。

總之，該研究成果為進一步對舌癌相關(guān)的糖組學研究提供定量分析參考。我們認為，為進一步揭示舌癌惡性演變與其糖組學的關(guān)系，可以從大量臨床樣本如血清水平上，進行對比分析，篩選出最可能的分子標志物。在本研究的基礎上可以在后續(xù)的相關(guān)研究中進行一定的驗證性實驗和擴展性實驗。這些實驗可以包括：凝集素組化、功能糖蛋白質(zhì)組學和分子機理探究[25-26]。

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Analysis of N-linked glycans in tongue cancer

GUO Hui1,ZHANG Jian3,YANG Gang-long2,HUANG Ru-jin2,GUO Jia2

(1.Wuxi Medical School,Jiangnan University,Wuxi 214122; 2.Key Laboratory of Carbohydrate Chemistry & Biotechnology,Ministry of Education,Jiangnan University,Wuxi 214122; 3.Department of Stomatology,Wuxi second Hospital Attiliated to Nanjing Medical University,Wuxi 214122,China)

In order to identify the N-glycans which are closely related with tongue cancer and provide the evidence to help the early diagnosis,prevention and treatment,the N-glycome in the serum of the healthy volunteers and patients with tongue cancer was compared.The human serum samples was collected and the N-glycans of the whole glycoprotein using N-glycan-FASP-T was isolated,and then identified and was their structures determined by MALDI-TOF/TOF tandem mass spectrometry.After that,the relationship between N-glycan abundance and the tongue cancer was analyzed by the method of ROC curve.Compared to healthy volunteers,in the serum of the patients with tongue cancer,the level of hybrid type,three-antenna and bisecting N-glycans are increased,while the two antennas and four antennas are N-glycans reduced.In addition,there are more terminal Neu5Gc.The statistical analysis results showed that 10 N-glycan structures were significantly upregulated in the course of tongue cancer (AUC>0.50,and AUC to 0.75,which m/z=1256.510/1418.573).

oral cancer; MALDI-TOF-MS; N-glycan-FASP-T; N-linked glycans; glycomics

2016-03-21；

2016-04-08

收稿日期：國家自然科學基金青年科學基金(編號：81402115)

郭 輝，碩士，助理實驗師，研究方向為糖生物學和腫瘤生物學研究，E-mail：270724902@qq.com

郭 佳，博士，講師，研究方向為糖生物學和腫瘤生物學研究，E-mail：guojia@jiangnan.edu.cn

10.3969/j.issn.2095-1736.2016.06.007

R739.86

A

2095-1736(2016)06-0007-08