昆蟲信息化合物的篩選及鑒定技術(shù)研究進展

錢沉魚, 苑鵬宇, 馬 濤, 溫秀軍

(華南農(nóng)業(yè)大學 林學與風景園林學院，廣東省森林植物種質(zhì)創(chuàng)新與利用重點實驗室，廣州 510642)

昆蟲在其生活史和生態(tài)學的許多方面都會利用化學信號和線索，化學通訊在昆蟲的覓食、求偶、棲息、交配等生理行為中起著重要作用。信息素是具有揮發(fā)性、半揮發(fā)性和非揮發(fā)性的化學物質(zhì)，可引起受體生物體的生理或行為反應[1-3]，分別參與長距離、中距離和短距離通信，根據(jù)其行為結(jié)果，可分為性信息素、聚集信息素、告警信息素和示蹤信息素等。自1959 年提出“信息素”一詞以來[4]，第一個信息素組分bobbykol 在蠶蛾Bombyx mori身上得以鑒定[5]，隨后越來越多的研究揭示了這些信息物質(zhì)在眾多昆蟲中的化學和生物學作用。當信息素與誘捕器結(jié)合使用時，可以有效地監(jiān)測和控制害蟲的危害[6]。昆蟲信息素是農(nóng)林害蟲綜合管理的重要組成部分，尤其是信息素的高效靈敏性，在害蟲種群密度較低時，表現(xiàn)出巨大的潛力[7-8]。此外，信息素具有物種特異性、對哺乳動物無毒、對環(huán)境無害等優(yōu)點，可在對天敵影響最小的情況下長期減少害蟲種群。大量研究表明，利用化學信息素作為生物農(nóng)藥，通過監(jiān)測、大規(guī)模誘捕、交配中斷、吸引、殺死和推拉策略來管理農(nóng)業(yè)、儲存產(chǎn)品和森林害蟲，可以顯著減少傳統(tǒng)殺蟲劑的使用，減緩病蟲抗藥性，從而提供可持續(xù)和生態(tài)友好的害蟲防控技術(shù)[7,9]。

昆蟲的觸角是連接昆蟲與大自然之間的主要化學信息通訊工具，尤其是觸角上的各類化學感受器，能接受外部環(huán)境刺激后形成化學信號[10]，通過化學感受器上的微孔進入水溶性淋巴液，與周圍的氣味結(jié)合蛋白 (odorant binding protein,OBP)、氣味受體 (odorant receptors, OR)、信息素結(jié)合蛋白 (pheromone binding protein, PBP)、化學感受蛋白 (chemosensory protein, CSP) 和感覺神經(jīng)元膜蛋白 (sensory neuron membrane proteins,SNMP) 結(jié)合，形成親水性的復合物，這些復合物可穿過感受器淋巴而激活信息素受體[11-13]。OR構(gòu)成了氣味檢測的核心，位于嗅覺受體神經(jīng)元(olfactory receptor neuron, ORN) 的樹突膜上[14]，介導特定氣味分子與嗅覺神經(jīng)元的結(jié)合，將化學信息信號轉(zhuǎn)換為電信號，負責嗅覺神經(jīng)元的敏感性和特異性[15]。最后通過高級腦中樞的信息整合，支配和調(diào)節(jié)昆蟲的行為反應[16]。目前，已在100 多種昆蟲中檢測到了OBP 的存在，例如蠶蛾[17]、玉米象Sitophilus zeamais[18]、韭菜遲眼蕈Bradysia odoriphaga[19]、東方果實蠅幼蟲寄生蜂Diachasmimoorpha longicaudata[20]、棉鈴蟲Helicoverpa armigera和煙青蟲Helicoverpa assulta[21]等。昆蟲通過其嗅覺系統(tǒng)感知氣味分子，如性信息素[22]、聚集信息素[23]和植物源揮發(fā)物[24]等。破解昆蟲與昆蟲、昆蟲與寄主植物之間的化學信息，實際是對昆蟲觸角及觸角上化學感受器的深入研究[25-26]，因此，電生理技術(shù)作為昆蟲觸角研究方法中最重要的技術(shù)之一，也是化學生態(tài)學研究中最常用的技術(shù)方法。

目前，常用于昆蟲信息化合物篩選及鑒定的儀器有觸角電位儀 (electroantennography, EAG)、氣相色譜-觸角電位聯(lián)用儀 (gas chromatographyelectroantennographic detection, GC-EAD)、氣質(zhì)聯(lián)用儀 (gas chromatography-mass spectrometer, GCMS)、單感器記錄儀 (single sensillum recordings,SSR) 和氣相色譜-單感器記錄聯(lián)用儀 (GC-SSR)。EAG 主要用于引起昆蟲觸角活性反應的已知化合物的篩選與測定；而GC-EAD 可直接用于混合物的高效篩選，與單獨使用EAG 相比，其可極大地提高篩查效率，降低工作量；SSR 和GC-SSR 技術(shù)則用于區(qū)分昆蟲觸角不同感受細胞的電位反應。信息素的化學結(jié)構(gòu)多種多樣，包括碳氫化合物、醇、酯、環(huán)氧化物、醛、酮、內(nèi)酯、羧酸和異戊二烯等[27-29]，這種結(jié)構(gòu)多樣性是信息素具有特異性的關(guān)鍵。不同組分的作用有可能是無關(guān)的、拮抗的或協(xié)同的，其具體效能取決于組分之間的比例。因此，GC-MS 技術(shù)作為破解化合物質(zhì)譜信息和結(jié)構(gòu)信息的有力手段和前提條件，通過選擇合適的毛細管柱，能實現(xiàn)大多數(shù)揮發(fā)性有機化合物的定性與定量分析。由于電生理技術(shù)具有較強的選擇性和靈敏性，已經(jīng)廣泛地應用于昆蟲的嗅覺行為及其化學生態(tài)學的研究，成為昆蟲信息化合物鑒定、篩選及其其他揮發(fā)性有機化合物生物活性測定的重要工具，使得信息素化學物質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息與作用機制更加清晰，為害蟲生物防治及綠色防控提供了更多途徑和技術(shù)支撐。本研究對上述昆蟲信息素的鑒定與分析技術(shù)進行了總結(jié)歸納，結(jié)合近年來國內(nèi)外研究報道，討論了電生理技術(shù)和氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的作用原理及應用，分析了不同技術(shù)在昆蟲信息素鑒定中的優(yōu)勢與不足，并對未來電生理技術(shù)在化學生態(tài)分析領(lǐng)域中可能面臨的機遇與難點進行了展望，以期為昆蟲信息素的研究提供有價值的參考。

1 觸角電位技術(shù)

觸角電位儀 (EAG) 是昆蟲化學生態(tài)中最常用的電生理學方法，最早是由科學家Schneider[30]利用EAG 技術(shù)測定了蠶蛾性信息素的嗅覺生理反應，記錄了在化合物的刺激作用下，蠶蛾觸角的尖端和根部之間產(chǎn)生了一個細微的電壓波動，是由昆蟲觸角內(nèi)的嗅覺神經(jīng)元被電化消磁所引起的。EAG 是一種快速測量由嗅覺刺激引起的觸角遠端和近端部分之間電位變化的優(yōu)越技術(shù)，也可使用純化合物來評估昆蟲觸角對某種刺激的反應和引發(fā)可檢測反應所需的劑量[31]。如圖1 所示，該儀器主要包括：數(shù)據(jù)采集控制器、刺激放大器、微動操作儀及觸角電位探頭、計算機、巴斯德管等構(gòu)成。昆蟲觸角上存在著大量的化學感受器，每一個感受器細胞都包含著類似于電源和電阻的結(jié)構(gòu)，這樣整根觸角就組成了無數(shù)的電源和電阻，從而形成串聯(lián)的閉合電路[32]。當觸角受到活性化合物刺激時，大量的感受細胞就會產(chǎn)生相應的電生理反應，從而在觸角的基部和端部形成一個總的電位變化 (去極化的直流信號)，得到觸角電位圖，通常用毫伏 (mV) 表示。這種電位的變化幅度與化合物的種類和屬性等密切相關(guān)，并隨著化合物濃度的增長而增長，直至飽和狀態(tài)。除此之外，還與昆蟲的種類及生理狀態(tài)、昆蟲觸角的活性、離體觸角的壽命和觸角電位儀放大器輸入信號的質(zhì)量及溫濕度狀況等相關(guān)[33]。

目前，EAG 被廣泛應用于從一系列疑似化合物中篩選出可以引起昆蟲觸角活性反應的物質(zhì)[34]，以測定昆蟲觸角對活性化合物的電生理反應 (圖1)。如Zhao 等[35]等在東方蜜蜂Apis cerana中發(fā)現(xiàn)其氣味結(jié)合蛋白AcerOBP6 與大多數(shù)被測氣味具有親和力，并用EAG 判定該蜜蜂對2-庚酮反應最強烈，在沉默AcerOBP6 后，發(fā)現(xiàn)所選配體的 EAG 記錄值全部降低，由此推測出了參與覓食嗅覺識別的關(guān)鍵蛋白質(zhì)。Du 等[36]用 GC-EAD探究紅火蟻Solenopsis invicta對異構(gòu)體混合物中報警信息素的反應時，發(fā)現(xiàn)GC-EAD 響應太小而無法滿足研究的需要，繼而改用EAG 直接測量，獲得了顯著的觸角反應。近年來, Jacob 等[37-38]還新開發(fā)了一種EAG 結(jié)合電流源密度 (CSD) 模型預測的分析方法，并在實蠅科昆蟲身上驗證了該方法可用于繪制單個觸角的功能激活圖，能更加快速和全面地評估觸角對化合物的敏感性。

圖1 EAG 儀器原理示意圖[32]Fig.1 Schematic diagram of EAG equipment[32]

2 氣相色譜-觸角電位聯(lián)用技術(shù)

由氣相色譜 (GC) 和觸角電位儀 (EAG) 組成的氣相色譜-觸角電位聯(lián)用儀 (GC-EAD)，是一個聯(lián)合的分析系統(tǒng)，將基于 EAG 的方法提高到了更高水平。通常在選擇分析樣品的色譜柱時，根據(jù)目標化合物的特征可采用弱極性柱 (如DB-5MS、HP-5 和HP-5MS 等)、中等極性柱 (DB-17 和DB-17MS 等) 或強極性柱 (如HP-Wax、HP-INNOWax和DB-Wax 等)。雖然色譜柱固定相有著不同的極性，但適用范圍廣，對大多數(shù)化合物都具有比較高的靈敏度和質(zhì)譜完整性，如醛類、烯烴和萜類等。然而，相對于弱極性柱而言，強極性柱可改善低沸點分析物的分離度，尤其適用于酸、酯和甘醇等物質(zhì)的分離。氣相色譜柱出口端接Y 型分流器，使得色譜柱餾出物在火焰離子化檢測器(FID) 和 EAD 之間以 1:1 的分流比通過加熱的傳輸線進行分流?？刂茪饬鞯闹烽L度相同，使到達FID 和EAD 的時間基本保持一致，這樣GC和EAG 的響應峰可以同時一一對應記錄，收集的氣味化合物被迅速篩選，其他沒有引起活性反應的物質(zhì)不予考慮 (圖2)。雖然GC-EAD 不能提供相關(guān)化合物的結(jié)構(gòu)信息，但比較適用于從復雜混合物中篩選出主要成分或次要組分中具有活性的化合物，節(jié)省大量的時間和精力。

圖2 GC-EAD 儀器操作原理圖Fig.2 Schematic diagram of GC-EAD equipment

表1 和表2 中列舉的例子包含了從 2012—2022年期間針對不同昆蟲的性信息素、表皮揮發(fā)物、聚集信息素、告警信息素以及植物源揮發(fā)物組分，驗證昆蟲電生理反應的GC-EAD 適用條件以及相應的參考文獻。

表1 適用于不同信息素類型的GC-EAD 條件 (2012—2022)Table 1 The application of GC-EAD on pheromones (2012-2022)

Moorhouse 等[39]最早提出GC-EAD 聯(lián)合使用測定昆蟲觸角的反應，但由于EAG 反應容易被噪音 (儀器放大器輸入噪音、觸角本身噪音及外部電路噪音等) 或者基線漂移所覆蓋，無法得到令人滿意的結(jié)果。直到1975 年， Arn 等[40]使用氣相色譜柱對選擇性及敏感性很高的化合物進行檢測，弄清了GC 和EAG 聯(lián)用的GC-EAD 技術(shù)，得到了葡萄花翅小卷蛾Lobesia botrana雄蛾觸角對雌蛾性信息素腺體粗體物的GC-EAD 反應，從此大量的昆蟲信息化合物得到準確鑒定[41-42]。GC-EAD 技術(shù)已廣泛應用于昆蟲性信息素、植物源揮發(fā)物、表皮揮發(fā)物和示蹤信息素等物質(zhì)的初篩 (表2)。本實驗室也采用GC-EAD 技術(shù)分別篩選出了皮暗斑螟Euzophera batangensis、團花絹野螟Diaphania glauculalis、麻楝蛀斑螟Hypsipyla robusta、灰茶尺蠖Ectropis grisescens和綠翅絹野螟D.angustalis等昆蟲的性信息素活性組分[43-47]。

表2 適用于不同揮發(fā)物類型的GC-EAD 條件 (2012—2022 年)Table 2 The application of GC-EAD on volatiles (2012-2022)

然而，對于植物源化合物，由于引起昆蟲觸角反應的峰值較小，更容易被噪聲覆蓋，因此需要提高信噪比 (signal to noise ratio，SNR) 以避免該現(xiàn)象的發(fā)生[48]，而新型裝置 (MEMS-GC-EAG)可迅速鑒定出低濃度下的揮發(fā)性有機化合物 (volatile organic compounds，VOCs)[49]。GC-EAD 還存在一些缺陷，比如：EAD 只顯示是否產(chǎn)生了嗅覺反應，不能提供引起昆蟲觸角反應的有關(guān)化合物準確信息；即使在樣品制備和氣相色譜條件最佳的情況下，仍有一些昆蟲也很難對EAD 做出響應，僅靠 GC-EAD 技術(shù)不一定能覆蓋所有的關(guān)鍵線索。最近，Shuttleworth 等[50]改進了原來的一次只能用一種固定的運行方法，通過四通分流器可以同時在極性和非極性色譜柱上運行樣品，大大提高了對活性化合物的分離度和鑒定。由于GC-EAD和GC-MS 是兩個獨立的系統(tǒng)，因此通常使用不同的氣相色譜系統(tǒng)。然而，兩種氣相色譜系統(tǒng)的類型、載氣和色譜柱不同，所分析化合物的峰形、保留時間和數(shù)量也有所不同，在比較兩個色譜圖中所對應的化合物時更加耗時；如果樣品量太少，無法保證第2 次進樣，則無法進一步進行分析篩選。因此，Li等[51]通過在氣相色譜中添加毛細管分離器來改進GC-EAD 技術(shù)，F(xiàn)ID 被質(zhì)譜取代。該方法將GC-EAD 和GC-MS 結(jié)合在一個系統(tǒng)中，不僅降低了一臺GC 和一臺FID 設(shè)備的成本，而且避免了不同色譜圖的比較，提高了工作效率。更重要的是，EAD 響應本身不能與昆蟲生物吸引力等特定功能直接相關(guān)，因此，GC-EAD實驗結(jié)果需用野外生物活性測定加以驗證，進而確認已鑒定化合物的生物活性。

3 氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)

使用 GC-EAD 可篩選出引起昆蟲電生理行為反應的活性成分，而GC-MS 可以通過毛細管色譜

柱先對復雜混合物中的組分進行高效分離，再經(jīng)過質(zhì)譜信息鑒定其中能引起昆蟲的電生理活性反應的單個或混合組分。Imrei 等[100]通過GC-MS 技術(shù)對截尾麗虎天牛Plagionotus detritus雄性體表揮發(fā)物中能引起GC-EAG 響應的兩個物質(zhì)進行了分析，將樣品的保留時間與在弱極性柱 (HP-5 MS)和極性柱 (DB-Wax) 上標準品的質(zhì)譜信息和保留時間對比，再結(jié)合手性色譜柱 (Cyclodex B) 分離對提取物的絕對構(gòu)型進一步分析表明，雄蟲產(chǎn)生的活性信息素組分為 (R)-3-羥基己烷-2 酮和 (S)-2-羥基辛烷-3-酮。類似地，Binyameen 等[102]在發(fā)掘棉花Gossypium hirsutum和丁香花Syringa vulgaris提取物中能引起夜蛾科害蟲Spodoptera littoralis生理活性的化合物時，為了防止組分在弱極性HP-5 色譜柱上有共餾出現(xiàn)象，用極性DB-Wax 對化合物重新進行了分離。Būda 等[103]用Stabil-Wax極性色譜柱發(fā)現(xiàn)了沙棘實蠅Rhagoletis batavad雄蟲信息素中潛在對映異構(gòu)體的存在，并分離出了能引起雌蟲EAD 反應的活性化合物，并隨后利用基于環(huán)糊精的固定相手性色譜柱 (Rt?-bDEXsm)分離出了(-)-δ-庚內(nèi)酯和(+)-δ-庚內(nèi)酯，其中只有前者能引起觸角反應。此外，結(jié)合質(zhì)譜信息可對活性物質(zhì)進行結(jié)構(gòu)確認，其中保留指數(shù) (RI) 是判斷信息素的化學特性的重要參數(shù)。通常使用正構(gòu)烷烴混合物來計算保留指數(shù)：

其中： RTX是未知物X 的保留時間，RTn是其中第n個碳的烷烴在 X 之前洗脫的保留時間，RT(n+1)是在 X 之后洗脫的n+ 1 個碳的烷烴的保留時間[104]。為了確保鑒定結(jié)果的可靠性，通常采用從至少兩個不同固定相的氣相毛細管柱 (包括弱極性柱和極性柱) 中獲得的保留數(shù)據(jù)進行 RI 計算[57,80]。通過與合成的或購買的標準品的質(zhì)譜和保留時間進行比較，最終得到準確的物質(zhì)信息。在缺乏標準品的情況下，可將未知化合物的質(zhì)譜與譜庫中的質(zhì)譜信息進行對比，而此時往往需要多個數(shù)據(jù)庫 (如NIST、Wiley/NBS registry) 的交叉多重驗證，再結(jié)合文獻或與已發(fā)表的化合物的保留指數(shù)進行比對，以提高化合物定性的準確度[99,101,105]。

飛行時間質(zhì)譜檢測器 (TOFMS) 結(jié)合全二維氣相色譜 (GC × GC) 是一種更為先進的化學分析技術(shù)。原理上，該方法由兩個配備不同極性色譜柱的串聯(lián)系統(tǒng)組成，通過調(diào)制器進行連接[106]。隨后調(diào)制器經(jīng)過反復調(diào)制，從第1 根色譜柱洗脫的每份組分釋放到第2 根色譜柱，進行二次分離。由于調(diào)制之后所產(chǎn)生的二維峰寬比較窄 (低至50 ms，取決于低溫調(diào)制的頻率)，因此需要具有較高采集頻率 (最低每秒50 Hz) 的質(zhì)譜檢測器才能提高系統(tǒng)精度[107]。在全二維色譜圖中，包含了化合物在一維色譜柱 (以分鐘為單位) 和二維色譜柱 (以秒為單位) 分離后的保留時間，使用該技術(shù)既可以減少共餾出峰的出現(xiàn)，也能實現(xiàn)痕量化合物的檢測。相對于傳統(tǒng)的一維氣相色譜系統(tǒng)，全二維氣相色譜更有利于發(fā)現(xiàn)隱藏在高含量物質(zhì)下的微量共餾出活性物質(zhì)[108]。由于許多昆蟲揮發(fā)性化合物的組成成分復雜，存在一些化學性質(zhì)相似的同分異構(gòu)體，僅靠一維氣相色譜難以達到理想的分離效果[109]，因此，GC × GC-TOFMS 技術(shù)也引入到了許多昆蟲信息素的分離鑒定中，如非洲果蠅表皮揮發(fā)物[99]、蠟螟科Ahomia sociella雌蟲求偶信息素[110]和灰茶尺蠖E.grisescens性信素[43]等。通過GC × GC-TOFMS 得到的高分辨質(zhì)譜信息，發(fā)現(xiàn)了灰茶尺蠖的兩種性信息素成分為單環(huán)氧化物和三烯，具有II 型鱗翅目信息素成分的特征[43]。地中海果蠅C.capitata雄性揮發(fā)物包括了多種化學結(jié)構(gòu)接近的復雜混合物，在用GC-EAD 檢測時，發(fā)現(xiàn)辛酸乙酯和(E)-3-辛烯酸乙酯兩種化合物都有響應，可在一維GC 上兩種化合物幾乎同時被洗脫[101]，無法精確鑒定。而借助于GC × GC 系統(tǒng)中兩根不同極性的色譜柱 (一維：弱極性DB-5 色譜柱；二維：極性BPX-50 色譜柱)，則大大提高了共餾出化合物的分離度。如圖3 所示，在EAD 圖上可以明顯看到辛酸乙酯(36)和(E)-3-辛烯酸乙酯(37)兩個化合物的響應信號，且辛酸乙酯的信號要強于(E)-3-辛烯酸乙酯；GC × GC-TOFMS 也證實了這兩個化合物的存在，但(E)-3-辛烯酸乙酯的質(zhì)譜響應要明顯高于辛酸乙酯?？梢?，在一維GC分析時會誤以為只有(E)-3-辛烯酸乙酯的EAD 響應。

圖3 地中海果蠅雄性信息素的GC × GC-TOFMS分析及EAD 響應[101]Fig.3 The GC × GC-TOFMS analysis and GC-EADs response of C. capitata male pheromone[101]

4 單感器記錄儀

單感器記錄儀 (SSR) 是一種用于研究昆蟲對化學刺激引起的嗅覺神經(jīng)元反應及細胞外動作電位變化的技術(shù)，是篩選特定氣味受體活性配體的有效方法，常用于昆蟲化學生態(tài)學和神經(jīng)生理學研究[111]。嗅覺受體是嵌在ORN 膜上的通道，負責將化學信號轉(zhuǎn)換為電信號[112]。由于信號轉(zhuǎn)導改變了ORN 膜上的活性電位頻率，可作為神經(jīng)元反應幅度的指標。在操作SSR 時，先用牙科蠟將活體昆蟲安裝在顯微鏡載玻片上。使用兩個鎢絲電極，將接地端的參比電極插入昆蟲的復眼或腹部，另一端記錄電極連接到前置放大器并插入感受器以完成電路。前置放大器連接到模數(shù)信號轉(zhuǎn)換器，該轉(zhuǎn)換器又連接到計算機以便于記錄和可視化信號[113]。刺激控制器控制經(jīng)過活性炭過濾的恒定氣流，通過硅膠和玻璃管引至昆蟲處。昆蟲觸角和觸須上的嗅覺感覺神經(jīng)元 (olfactory sensory neurons, OSN) 可將嗅覺信息從外界環(huán)境傳送到昆蟲大腦。OSN 的受體活性會誘導電尖峰的產(chǎn)生，因此SSR 能夠監(jiān)測感受器和參比電極之間的電位差[114]。Park 等[115]使用單感器記錄技術(shù)研究了雄性和雌性卷葉蛾Cydia succedana中OSN 對宿主和非宿主揮發(fā)物的反應，發(fā)現(xiàn)雌蛾觸角上的ORN和OSN 類別都比雄蛾豐富。其中，兩種最豐富的OSN 對宿主植物釋放的β-月桂烯和 (E) -β-羅勒烯表現(xiàn)出高度特異性反應，而其他的OSN 對非寄主植物的幾種化合物產(chǎn)生反應，說明卷葉蛾可能利用具有高度特異性的OSN 來區(qū)分寄主植物和非寄主植物[115]。

在單感器記錄中，尖峰數(shù)量的變化代表昆蟲對特定刺激的敏感性，不同類型嗅覺感受器的神經(jīng)信號對化學線索有著不同的動作電位類型和幅度[116]。根據(jù)尖峰幅度差異可用于評估每個感受器中的ORN 活性，因此可用于研究昆蟲對特定化學物質(zhì)的編碼過程。例如，致倦庫蚊C u l e x qsuinquefasciatus短鈍毛狀Ⅱ型 (short blunt trichoid II, SBTII) 感受器上神經(jīng)元細胞 A 和B 對不同類別的氣味表現(xiàn)出明顯不同的反應模式。芳烴和雜環(huán)化合物可激發(fā)SBTII A 的強烈響應，而引起SBTII B 最積極反應的是醛類化合物。此外，SBTII B 對2-己酮 ((60 ± 14 ) 尖峰/s) 和3-甲基吲哚 ((75 ±4)尖峰/s) 有反應，但SBTII A 則沒有反應[117]。其次，不同神經(jīng)元響應化合物刺激的時間動態(tài)也各不相同，從瞬時到階段性或持久響應。象鼻蟲Apion fulvipes觸角上其中1 類OSN 對吲哚的反應是強烈且持久的。當吲哚劑量在1～10 μg 時，即使是在刺激的幾分鐘后，尖峰幅度仍遠高于無刺激時的；而當吲哚劑量為0.1 μg 時，雖然引起的反應較弱，但同樣是持續(xù)的。與此同時，在其他6 類OSN 中，隨著化合物劑量的減少，因刺激產(chǎn)生的響應在時間動態(tài)上表現(xiàn)為從持久響應變?yōu)殡A段性響應[118]。相反，梨小食心蟲Grapholita molesta雄蟲觸角ORN 上的細胞能對Z8-12:Ac產(chǎn)生反應，但受刺激后的響應時間不足1 s[119]。

此外，化學刺激物通常需要先在溶劑中溶解和稀釋，以測試不同濃度的劑量效應。甲苯在0.01 μg/μL 的低閾值下便可引發(fā)致倦庫蚊短鈍毛狀Ⅱ型 (SBTII) 感受器上神經(jīng)元細胞A 的響應，當甲苯質(zhì)量濃度達到10 μg/μL 時甚至可引起強烈和興奮的反應[117]。由于昆蟲對石蠟油具有低敏性，因為在測試許多昆蟲受體神經(jīng)元對化合物的反應時，通常以石蠟油為溶劑來溶解不同的刺激物[120]。在臭蟲的研究中，同時驗證了石蠟油和二甲亞砜(DMSO) 溶解刺激物的效果[121-122]，發(fā)現(xiàn)同種刺激物在DMSO 中稀釋相同劑量會引發(fā)感受器更強的神經(jīng)反應[123]。SSR 技術(shù)的應用范圍極為廣泛，Jiang 等[55]利用SSR 技術(shù)驗證了草地貪夜蛾Spodoptera frugiperda雄性觸角中的感受器對雌蟲產(chǎn)生的性信息素的反應，發(fā)現(xiàn)雄性觸角中存在兩種功能類型的長毛狀感受器，分別對信息素Z9-14:Ac 和Z7-12:Ac 敏感。Dong 等[124]通過SSR 評估了大灰優(yōu)食蚜蠅Eupeodes corollae雌蟲和雄蟲觸角對10 種花香揮發(fā)物的嗅覺神經(jīng)反應，根據(jù)尖峰幅度確定了該蟲觸角上感受器I 亞型中能夠?qū)谆∠惴雍推渌枷阕寤衔锲鸱磻纳窠?jīng)元。還有研究者利用SSR 表征了致倦庫蚊神經(jīng)元對化學驅(qū)蟲劑的反應，這對今后篩選新的驅(qū)蚊劑具有重要意義[113]。單感器記錄儀是一種強大的勘測技術(shù)，為昆蟲在嗅覺神經(jīng)元的響應動態(tài)過程提供了的寶貴見解，開辟了探索昆蟲神經(jīng)反應的新途徑，有利于將來開發(fā)有效的害蟲防治新試劑。

5 氣相色譜-單感器記錄儀聯(lián)用技術(shù)

氣相色譜-單感器記錄儀聯(lián)用儀 (GC-SSR) 在近年來得到較快發(fā)展，通過該儀器可明確昆蟲對特定信息化合物具有生理反應的嗅覺受體神經(jīng)元ORN 及其靈敏程度，進而驗證信息化合物誘發(fā)神經(jīng)信號傳導的過程[125]。操作GC-SSR 時，需將記錄電極輕輕地壓入感受器的底部，以建立與ORN 的電接觸[126]。目前，該儀器可通過兩種方式將電極與觸角感器細胞接觸：一種為玻璃刀片切除感覺器的頂端，將充滿電解質(zhì)溶液的電極與去頂?shù)母杏X器連結(jié)；另一種方法為用極細的鎢絲電極從感覺毛基部一側(cè)插入，電極頂端就和感覺細胞內(nèi)部接觸。隨后，將樣品放置在巴斯德管口的濾紙條上，通過刺激感覺器來確定樣品的生物活性。通過接口放大器放大位于感覺器中的 ORN 的動作電位，當提取物引起 ORN 的響應時，隨后將樣品通過加熱傳輸線注入到與 SSR 記錄裝置相連的氣相色譜儀中。在氣相色譜儀中，色譜柱末端安裝一個分流器，一半的洗脫物通過加熱傳輸線流向昆蟲觸角，另一半流向到FID 中，便可得到同時記錄了ORN 的活性和在色譜柱上分離組分的色譜圖。當受到不同氣味的刺激時，ORN 表現(xiàn)出不同程度的特異性，可由神經(jīng)元的尖峰幅度差異來區(qū)分單個ORN[127]。

GC-SSR 已成功運用在許多昆蟲對特殊氣味化合物的反應驗證。Binyameen 等[102]通過GC-SSR，用GC 分離棉花和丁香花頂空提取物中的單個成分，用以刺激夜蛾科害蟲Spodoptera littoralis細胞，從而判斷一個神經(jīng)元是否對 45 種刺激物中的任何一種做出反應。與使用GC-EAD 或使用單一SSR 的研究相比，使用GC-SSR 檢測到OSN 和活性化合物的功能類別分別增加了40%和34%。Wang 等[85]在研究雌性煙青蟲H.assulta識別煙草揮發(fā)物以及將哪些氣味化合物用作產(chǎn)卵線索時，首先用GC-MS 初篩了14 種揮發(fā)性化合物，隨后用SSR 驗證了其對壬醛和庚醛可作出反應，且對壬醛的反應明顯更強，而壬醛是煙青蟲氣味受體的主要配體。此外，GC-SSR 主要記錄的是單個神經(jīng)元的電位變化，而GC-EAD 主要記錄的是昆蟲整個觸角的電位變化，故而GC-SSR 具有更高的分辨率和靈敏度。對于植物源揮發(fā)物活性組分的篩選、以及通過GC-EAD 無法篩選而遺漏的生物活性化合物，GC-SSR 可以作為 GC-EAD 的有力補充。例如使用GC-SSR，在藍桉Eucalyptusglobulus中得到了6 種可以引起桉樹蛀干害蟲Phoracantha semipunctata的活性化合物，而使用GC-EAD 卻無法檢測到[128]。這可能是由于少量OSN 的活動導致受體電位的總和很小，達不到GC-EAD 的信號檢測閾值，表明在識別具有生理活性的氣味上，GC-SSR 是比GC-EAD 更優(yōu)越的儀器。

6 展望

隨著昆蟲電生理學技術(shù)的快速發(fā)展，在信息素的分析、鑒定和表征方面，可獲得的方法更加多樣化，其應用范圍也從信息素的快速鑒定擴展到分子細胞水平上的嗅覺機制及神經(jīng)傳導研究。EAG、GC-EAD、GC-MS、SSR 和GC-SSR 作為化學生態(tài)學研究的重要技術(shù)手段，各有優(yōu)缺點，相輔相成。

1) 氣相色譜與電生理技術(shù)的聯(lián)合使用在提高了對昆蟲性信息素的識別能力，具有快速分離、反應靈敏、可操作性強等優(yōu)點，而GC-SSR 的出現(xiàn)將電生理技術(shù)推向了更精準的高度，可以靈敏、準確地檢測到觸角上不同感受器對信息素組分的特異性反應。目前，信息素的鑒定仍以GC-MS 為主，但該技術(shù)難以判定化合物雙鍵位置、順反構(gòu)型以及手性異構(gòu)的判定。

2) 國內(nèi)對于Type II 信息素的鑒定以及一些帶有旋光構(gòu)型的物質(zhì)仍難以篩選和鑒定，而一些具有重大危害的害蟲，如春尺蠖Apocheima cinerarius和油桐尺蠖Buzura suppressaria等的性信息素至今尚未能成功破解。因此，核磁共振 (NMR) 和質(zhì)譜 (MS) 等儀器分析技術(shù)也應加入鑒定的過程中，以確保準確獲取揮發(fā)性代謝物的化學特性。

3) 全二維氣相色譜飛行質(zhì)譜聯(lián)用儀 (GC × GCTOFMS) 等高分辨儀器在對具有EAG 活性化合物的分離鑒定中也起著非常重要的作用，但目前尚未看到有研究將全二維氣相色譜技術(shù)與EAG 耦合使用的研究報道，在未來的研究中應注重不同技術(shù)的結(jié)合，提高化合物的分離度和結(jié)果的準確性。

4) 昆蟲信息素通常具有揮發(fā)性較強、含量較低、組成復雜等特點，當儀器鑒定和量化信息素的靈敏度較低時，需要采用一些特殊的前處理方法進行捕獲及富集。近年來，一些快速、高富集、高效提取方法正在應用于信息素的采集，比如固相微萃取技術(shù)、動態(tài)頂空分析法、頂空-固相微萃取和直接接觸吸附萃取等，可將目標化合物富集在不同吸附材料 (如多孔聚合物、活性纖維或特殊涂層材料) 上，而吸附強度很大程度上依賴于材料對揮發(fā)性分子的親和力，因此可根據(jù)不同化合物的分子質(zhì)量來選擇或優(yōu)化不同的吸附材料性能。這些方法具有應用范圍廣、專一性高的優(yōu)點，尤其是可從生物活體中直接獲得VOC，在信息化合物采集及富集方面具有很大優(yōu)勢。

綜上所述，研究者應根據(jù)研究目的，采用合理的試驗方法才能得到準確的研究結(jié)果。隨著對理論研究的不斷深入，相信電生理技術(shù)將在化學生態(tài)分析領(lǐng)域中會有更廣闊的應用前景。