丹參中33種農(nóng)藥殘留的LC-MS/MS與GC-MS/MS檢測(cè)方法研究

李 剛，魏慶紅，懷 靜，孟 彪，段偉偉 ，劉愛珍

(1.中藥飲片制造新技術(shù)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 亳州 236800；2.安徽協(xié)和成藥業(yè)飲片有限公司，安徽 亳州 236800；3.亳州市中藥材進(jìn)出口檢測(cè)中心，安徽 亳州 236800)

丹參為唇形科植物丹參SalviamiltiorrhizaBge.的干燥根和根莖，功效為活血祛瘀、通經(jīng)止痛、清心除煩、涼血消癰，在醫(yī)藥界用處廣泛[1]。隨著2020版《中國藥典》的實(shí)施，四部通則2341要求藥材及飲片(植物類)33種禁用農(nóng)藥不得檢出(不得過定量限)，但通則里并未指定每一品種藥材適用哪一種樣品前處理方法，需要每個(gè)單位根據(jù)藥材情況進(jìn)行篩選，同時(shí)選擇對(duì)應(yīng)品種的空白基質(zhì)，保證加標(biāo)回收率能滿足條件。然而在丹參33種農(nóng)殘的檢測(cè)方法篩選過程中發(fā)現(xiàn)，2020版《中國藥典》規(guī)定的5種供試品溶液制備方式所得結(jié)果的線性關(guān)系及回收率均不能達(dá)到要求，結(jié)果詳見表1。丹參的主要化學(xué)成分包括脂溶性的丹參酮類化合物和水溶性的酚酸類化合物，而其中的菲醌類化合物容易引起有機(jī)磷類化合物的降解，從而導(dǎo)致目標(biāo)物線性差、回收率低，如甲拌磷、涕滅威等甚至檢測(cè)不到峰[2-11]。本研究根據(jù)丹參樣品基質(zhì)的特殊情況，在前處理過程中添加保護(hù)劑，降低其氧化能力[12-18]，在QuEChERS法基礎(chǔ)之上，建立了一種丹參的33種農(nóng)藥殘留的快速檢測(cè)方法，該方法穩(wěn)定性好，回收率均能滿足要求且重現(xiàn)性良好，靈敏度高。采用該方法共檢測(cè)了34批丹參樣品，結(jié)果均未檢測(cè)到2020版中國藥典四部通則2341涉及的33種農(nóng)藥指標(biāo)，初步表明中藥材丹參農(nóng)藥殘留引起的風(fēng)險(xiǎn)性較小。

從上表結(jié)果可以看出，按照藥典四部通則2341規(guī)定的5種供試品溶液處理方式檢測(cè)丹參樣品，結(jié)果內(nèi)吸磷、殺蟲脒、甲拌磷、苯線磷的線性及加標(biāo)回收結(jié)果無法同時(shí)滿足要求。除上表之外，氯磺隆、蠅蟲磷、特丁硫磷、除草醚回收率低，無法滿足2020版中國藥典中規(guī)定回收率70%～120%的要求。為了能準(zhǔn)確檢測(cè)丹參中33種農(nóng)藥殘留的結(jié)果，根據(jù)丹參本身化學(xué)成分特性，按下述方式進(jìn)行試驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

54種禁用農(nóng)藥混和對(duì)照溶液(上海安譜科技有限公司，純度在 99.2%～99.5%，批號(hào)為2102078-2102076)；乙腈為質(zhì)譜純；甲醇為色譜純；水為超純水；甲酸為色譜純；L(+)-抗壞血酸；1，4-二硫代-DL-蘇糖醇；N-正丙基乙二胺為色譜純；氯化鈉、無水硫酸鈉為優(yōu)級(jí)純；丹參藥材購于山東省臨沂市，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院方成武教授鑒定為正品藥材。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent7000DGC/TQ氣質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜儀(美國安捷倫公司)；Agilent6470LC/TQ液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜儀型(美國安捷倫公司)；MCM36型百萬分之一電子天平(賽多利斯公司)；EOAA-HM-01多管旋渦混合儀；ATY224型萬分之一電子天平(日本島津公司)；NE-24basic全自動(dòng)氮吹儀；APE-16平行濃縮儀；DD-5MC低速大容量離心機(jī)；WL-100型打粉機(jī)。

1.3 色譜及質(zhì)譜條件

1.3.1 氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法 和2020版藥典規(guī)定方法類似，但增加了定性的同一種化合物離子對(duì)個(gè)數(shù)，確保同一個(gè)化合物為了最大限度地排除樣品的基質(zhì)干擾。氣相色譜參數(shù)儀器型號(hào)Agilent 7000D；色譜柱VF-17 MS，30 m×0.25 mm×0.25 μm(PN：CP8982)；進(jìn)樣體積1 μL；進(jìn)樣口溫度280 ℃，進(jìn)樣模式為不分流進(jìn)樣，0.75 min打開分流出口，50 mL/min。載氣模式為恒壓，壓力146 kPa。傳輸線溫度為310 ℃。升溫程序中：初溫60 ℃，5 min；第一階段，升溫速率40 ℃/min，溫度達(dá)到200 ℃；第二階段，升溫速率2 ℃/min，溫度達(dá)到230 ℃；第三階段，升溫速率25 ℃/min，溫度達(dá)到320 ℃保留時(shí)間3 min。

質(zhì)譜參數(shù)：儀器型號(hào)Agilent7000GC-MS/MS，掃描模式MRM，離子化方式EI，離子源溫度280 ℃，四級(jí)桿溫度150 ℃，溶劑延遲3 min，MRM條件同藥典方法。

1.3.2 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法 色譜條件：同樣的，和2020版藥典規(guī)定方法類似，增加了定性的同一種化合物離子對(duì)個(gè)數(shù)，確保同一個(gè)化合物為了最大限度的排除樣品的基質(zhì)干擾。色譜柱：Agilent Porosell SB-C18(2.1 mm×100 mm，2.7 μm)，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量3 μL，流動(dòng)相A為含5 mM甲酸銨的的0.1%甲酸水溶液，B為0.1%甲酸溶液(含5 mM甲酸銨)∶乙腈=5∶95，按照2020版中國藥典要求進(jìn)行梯度洗脫，后運(yùn)行6 min。

質(zhì)譜條件：極性為正極，干燥氣體溫度為280 ℃，干燥氣流為7 L/min，鞘層氣體溫度為350 ℃，氣體流量為11 L/min，霧化壓力(Psi)為40，毛細(xì)管電壓(V)為3 500，噴嘴電壓(V)為0(正極)，數(shù)據(jù)采集模式為MRM。

1.4 樣品前處理

1.4.1 對(duì)照溶液的制備 精密量取54種禁用農(nóng)藥混和對(duì)照溶液(已標(biāo)示各相關(guān)農(nóng)藥品種的濃度)0.5 mL，另精密量取單標(biāo)殺蟲瞇對(duì)照品200 μL，置20 mL棕色量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，即得以甲胺磷2.5 mg/L為例的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取上述混合對(duì)照品儲(chǔ)備液10 mL置50 mL量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，即得500 μg/L的混合對(duì)照品溶液。

1.4.2 GC-MS/MS用內(nèi)標(biāo)溶液的制備 精密稱定磷酸三苯酯對(duì)照品適量，加乙腈溶解并制成每1.0 mg/mL溶液，再次以乙腈稀釋定容至0.1 μg/mL。

1.4.3 空白基質(zhì)溶液的制備 取丹參空白基質(zhì)粉末，同供試品方法處理，得到空白基質(zhì)溶液。

1.4.4 基質(zhì)混合對(duì)照溶液的制備 精密量取空白基質(zhì)溶液6份，每份取1.0 mL，40 ℃水浴濃縮至約0.6 mL，分別加入混合對(duì)照品溶液20 μL、50 μL、100 μL、150 μL、200 μL、400 μL，加乙腈稀釋至1 mL，渦旋混勻，即得[1]。

1.4.5 還原溶劑的制備 精密稱定8.8 g VC或者0.77 g DTT，加水稀釋溶解，轉(zhuǎn)移并定容至50 mL容量瓶，搖勻，即得。

1.4.6 供試品溶液的制備 取供試品粉末過三號(hào)篩，精密稱定3 g，加入臨用新配的VC(抗壞血酸)或者DTT(1，4-二硫代-DL-蘇糖醇)150 μL，置50 mL聚苯乙烯具塞離心管中，添加回收的樣品需要加入混合標(biāo)準(zhǔn)品(如添加濃度為50 ppb，需加入2.5 ppm混標(biāo)60 μL)，加入1%冰醋酸溶液15 mL和陶瓷均質(zhì)子渦旋，保證藥材粉末充分浸潤，放置30 min，為了其在酸性條件下細(xì)胞膨脹，更易提取。再精密加入乙腈15 mL，渦旋振蕩5 min，渦旋速度至少500次/min。加入QuEChERS提取鹽包，能吸附基質(zhì)中絕大部分干擾物(如有機(jī)酸、脂肪酸、碳水化合物)，渦旋震蕩3 min，再次冰浴冷卻10 min，之后再4 ℃低溫5 000 r/min離心5 min，取上清液9 mL，加入提前準(zhǔn)備好的裝有凈化材料的分散固相萃取凈化管中，渦旋震蕩5 min，渦旋速度至少500次/min，4 ℃低溫8 000 r/min離心5 min，精密吸取上清液5 mL，置氮吹儀上于40 ℃水浴，逐漸濃縮至約0.5 mL，添加內(nèi)標(biāo)物質(zhì)200 μL，添加回收樣品和實(shí)際樣品均直接加乙腈定容1.0 mL?；|(zhì)空白樣品先加入混合標(biāo)準(zhǔn)溶液后(如基質(zhì)標(biāo)濃度為50 ppb，則加入500 ppb混合標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μL)，再加乙腈定容至1.0 mL。定容后的樣品，渦旋混勻，過0.22 μm的PTFE濾膜，過濾液取400 μL加入120 μL的水，混勻后，供LC-MS/MS檢測(cè)，注入液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，按外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算。 剩下的過濾液取400 μL，加入100 ppb的內(nèi)標(biāo)三苯基磷酸酯120 μL，混勻后，供GC-MS/MS檢測(cè)，注入氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀，按內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算，即得。

2 結(jié)果

2.1 校準(zhǔn)曲線考察

在設(shè)定的校準(zhǔn)曲線濃度10～200 ng/mL范圍內(nèi)(甲胺磷計(jì))，丹參基質(zhì)匹配校準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均在0.990～0.999之間，表明方法校準(zhǔn)曲線線性良好。

表2 對(duì)照品逐級(jí)稀釋及校準(zhǔn)曲線配制表

2.2 定量限考察

以丹參空白基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線最低點(diǎn)作為丹參33種農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法的定量限，僅為2020版中國藥典0212通則要求定量限的1/2～1/15，表明該測(cè)試方法靈敏度良好，能完全滿足2020版中國藥典規(guī)定的定量限要求。

2.3 專屬性考察

在上述“1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，其LC-MS/MS與GC-MS/MS所出峰的踏板數(shù)分離度等均滿足要求，丹參空白基質(zhì)無干擾峰存在。

圖1 LC-MS/MS空白基質(zhì)圖譜

圖2 LC-MS/MS丹參樣品圖譜

圖3 LC-MS/MS 33種農(nóng)藥殘留標(biāo)準(zhǔn)品最低點(diǎn)圖譜

圖4 GC-MS/MS空白基質(zhì)圖譜

圖5 GC-MS/MS丹參樣品圖譜

圖6 GC-MS/MS 33種農(nóng)藥殘留標(biāo)準(zhǔn)品最低點(diǎn)圖譜

2.4 精密度與重復(fù)性考察

選擇篩選好的丹參空白基質(zhì)，以2020版藥典規(guī)定的定量限濃度加標(biāo)，平行6次，精密度結(jié)果RSD為2.0%～13.5%；按上述方法同時(shí)處理6批丹參樣品，所測(cè)33種農(nóng)藥殘留的重復(fù)性結(jié)果的RSD在2.3%～11.4%范圍內(nèi)。表明測(cè)試方法精密度與重復(fù)性均滿足要求。

2.5 準(zhǔn)確度考察

2020版中國藥典規(guī)定33種農(nóng)藥殘留的回收率范圍應(yīng)在70%～120%，但由于有些藥材化學(xué)成分不一，重復(fù)性符合要求，部分農(nóng)藥殘留的回收率亦可在60%～130%，上述丹參的33種農(nóng)藥殘留化合物加標(biāo)回收率為72.5%～110.2%，均滿足要求。

表3 丹參的33種農(nóng)藥殘留化合物加標(biāo)回收結(jié)果匯總

3 討論

針對(duì)丹參本身化學(xué)成分特性，加入臨用新配的VC(抗壞血酸)或DTT(二硫蘇糖醇)，降低其氧化能力，避免其與33種農(nóng)藥殘留提取試劑的反應(yīng)，通過上述結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)其線性關(guān)系、檢測(cè)限、系統(tǒng)適應(yīng)性、精確性、重復(fù)性、準(zhǔn)確性均符合2020版中國藥典要求，可以作為丹參33種農(nóng)藥殘留的檢測(cè)。

現(xiàn)有的2020版中國藥典規(guī)定檢測(cè)33種農(nóng)藥殘留時(shí)需要?dú)庀嗌V-串聯(lián)質(zhì)譜法與高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法共同檢測(cè)，均需要精密吸取對(duì)應(yīng)處理方式的基質(zhì)混合對(duì)照溶液及供試品溶液各1 mL，即需要按照要求分別準(zhǔn)備兩種供試液，現(xiàn)有方法只需要處理一份即可滿足需求，提高了處理效率。

丹參作為單基源中藥材，在進(jìn)行33種農(nóng)藥殘留量檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)，同一批丹參，以不同產(chǎn)地的丹參空白基質(zhì)為參照，部分化合物所得結(jié)果及其回收率差異較大。2020版中國藥典規(guī)定經(jīng)檢測(cè)不含待測(cè)農(nóng)藥殘留的相同品種中藥材為其空白基質(zhì)，但經(jīng)過大量測(cè)試發(fā)現(xiàn)，只有采用同一基源、同一產(chǎn)地的空白基質(zhì)才能最大限度地降低藥材的基質(zhì)效應(yīng)。