開心散對(duì)雙側(cè)海馬CA1 區(qū)注射Aβ1-42 致AD 大鼠的治療作用及機(jī)制研究

裴海鸞馬貝貝王婷婷李瑞吉?jiǎng)⒔疠x于尚玥婁天宇左澤平田時(shí)秋李依林王晨曉田穎穎田 驕趙新月劉 闖郭玉東王 晶*王志斌*

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院,北京 102488;2.北京同仁堂研究院,北京 100071;3.北京市藥品檢驗(yàn)研究院,北京 102200)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一種起病隱匿并進(jìn)行性發(fā)展的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,該病多發(fā)于65 歲以上的老年人,病者在患病后7～10 年內(nèi)即不可避免地走向死亡[1-2]。 AD 患者臨床表現(xiàn)為長時(shí)間的認(rèn)知功能衰退、情節(jié)記憶與身體機(jī)能持續(xù)惡化、精神行為和睡眠-覺醒周期混亂,伴隨明顯的語言系統(tǒng)缺陷、情緒波動(dòng)異常以及嚴(yán)重的生活能力喪失。 AD 典型的病理特征為β-淀粉樣蛋白(amyloid beta-protein,Aβ)的積聚與沉積[3]、tau 蛋白過度磷酸化形成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles,NFTs)[4]、慢性神經(jīng)炎癥[5]以及顯著的突觸損傷與神經(jīng)元丟失[6]。 全球現(xiàn)今約有4400 萬人罹患AD,隨著社會(huì)人口老齡化的加劇與AD 病癥患者趨于年輕化,預(yù)計(jì)在2050 年AD病人數(shù)量將增至1 億。 疾病的迅速發(fā)展在毀壞個(gè)人健康與家庭安定的同時(shí),也為社會(huì)工作與全球經(jīng)濟(jì)帶來沉重負(fù)擔(dān)。

開心散記載于唐代藥王孫思邈所著的《備急千金要方·卷十四·小腸腑》中,主治“好忘”,由人參、遠(yuǎn)志、石菖蒲及茯苓四味中藥組成。 開心散復(fù)方中人參大補(bǔ)元?dú)?安神益智;遠(yuǎn)志祛痰開竅,解郁寧心,二者共用可除邪氣,養(yǎng)心血,散痰涎,利九竅,補(bǔ)臟腑之精虧,使耳目聰明,強(qiáng)志不忘。 茯苓利水滲濕,健脾寧心;石菖蒲開竅豁痰、化濕、醒神益智,兩藥配伍可化血積,治痹痛,定心氣,去痰阻,理五臟經(jīng)絡(luò)之氣亂、濕濁,使精神通透,心腦暢明。 由此全方共奏益氣養(yǎng)心、補(bǔ)虛、化痰、除濕利竅及安神益智之功,這與AD“臟腑虧損,髓海空虛,瘀血、痰濁阻塞經(jīng)絡(luò)腦竅”的病因病機(jī)格外契合,因此常被用于臨床治療“善忘”病癥。

近年來,國內(nèi)學(xué)者對(duì)開心散靶向癡呆的藥理學(xué)研究愈發(fā)關(guān)注,但多集中于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)[7]、效應(yīng)物質(zhì)發(fā)掘[8]及單一信號(hào)通路如氧化應(yīng)激[9]、神經(jīng)炎癥[10]、腦內(nèi)神經(jīng)再生[11]的驗(yàn)證,關(guān)于開心散經(jīng)典藥理活性的多環(huán)節(jié)考察仍為罕見。 因此,本研究擬采用雙側(cè)海馬CA1 區(qū)注射Aβ1-42造模損傷SD 大鼠為研究對(duì)象,并參照AD 發(fā)生發(fā)展的相關(guān)學(xué)術(shù)論點(diǎn)設(shè)立檢測(cè)因素與靶標(biāo),對(duì)開心散復(fù)方抗癡呆的藥理活性進(jìn)行較為全面地考證與篩查,以期為經(jīng)典古方的進(jìn)一步開發(fā)及深層次的通路挖掘提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)體重為(260～300)g 的SD 大鼠,雌雄各半,70 只,由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供[SCXK(京)2016-0011],動(dòng)物飼養(yǎng)在北京市藥品檢驗(yàn)研究院[SYXK(京)2020-0041],本研究由北京市藥品檢驗(yàn)所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查通過,并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R 原則給予人道的關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

石杉?jí)A甲片(河南太龍藥業(yè)股份有限公司,批號(hào):190304);開心散浸膏粉(由上海綠谷生命園醫(yī)藥有限公司提供,批號(hào):190301)。

Aβ1-42(BIOSS, 貨 號(hào): bs-0107P); 二 甲 亞 砜(DMSO) (國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,批號(hào):20180404);甲苯胺藍(lán)染液(貨號(hào):G1032)、蘇木精-伊 紅 染 液( 貨 號(hào): G1003)、 GSK-3β ( 貨 號(hào):GB11099)、Tau(貨號(hào):GB11178)、β-actin(貨號(hào):GB12001)及BAX(貨號(hào):GB11690)購自武漢賽維爾生物科技有限公司;BCL-2(Affinity,貨號(hào):BF9103)。乙酰膽堿(ACh)試劑盒(貨號(hào):CEA912Ge)、乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶(ChAT)試劑盒(貨號(hào):SEB929Ra)、乙酰膽堿酯酶(AChE)試劑盒(貨號(hào):SEB447Ra)、淀粉樣前體蛋白(APP)試劑盒(貨號(hào):SEB020Ra)、Aβ1-40酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(貨號(hào):CEA864Ra)、Aβ1-42酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(貨號(hào):CEA946Ra)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)檢測(cè)試劑盒(貨號(hào):SEA133Ra)、白介素-6(IL-6)檢測(cè)試劑盒(貨號(hào):SEA079Ra)及白介素-1β(IL-1β)檢測(cè)試劑盒(貨號(hào):SEA563Ra)均由武漢云克隆科技股份有限公司提供。

Morris 水迷宮(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所制,型號(hào):DMS-2);腦立體定位儀(北京眾實(shí)迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責(zé)任公司,型號(hào):ZS-FD/S);KDS Legato130微量注射泵(美國KD scientific 公司);微型手持式顱鉆(深圳市瑞沃德生命科技有限公司,型號(hào):78001);高速組織研磨儀(Servicebio,型號(hào):KZ-Ⅱ);酶標(biāo)檢測(cè)儀(BioTeK,型號(hào):Epoch)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 AD 大鼠的模型制備

(1)Aβ1-42寡聚體的孵育

將1 mg 的β-淀粉樣蛋白1-42 片段(Aβ1-42)溶于44 μL 的二甲亞砜(DMSO)中,再緩慢加入PBS溶液(456 μL),邊加邊輕搖混勻,定容到所需濃度(2 μg/μL)。 封口膜封好后,將溶液放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育7 d,使其聚集老化。

(2)動(dòng)物術(shù)前篩選

將大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d 后進(jìn)行篩選,經(jīng)Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)判別其空間學(xué)習(xí)記憶能力,淘汰游泳行為過于遲鈍的大鼠,將篩選出的正常大鼠隨機(jī)分為3 組:空白組10 只,假手術(shù)組10 只,其余歸入造模組。

(3)手術(shù)過程

大鼠麻醉后,將其置于腦立體定位儀上進(jìn)行固定;定位手術(shù)區(qū),局部備皮,酒精消毒;剪開大鼠頭部皮膚,切口沿中線分布,長度約15 mm,將顱骨表面粘膜撥開固定,使顱骨充分暴露;參照《大鼠腦立體定位圖譜》[12],確定前囟位點(diǎn)并標(biāo)記,鉆孔位點(diǎn)定位于前囟后方3.6 mm,旁開2 mm,以1.0 mm 鉆頭鉆孔;注射點(diǎn)定位于大鼠海馬CA1 區(qū),即自鉆孔位垂直顱骨表面向內(nèi)進(jìn)針約4.3 mm;恒速垂直注射,雙側(cè)各注射Aβ1-42寡聚體5 μL,以1 μL/min 的速度持續(xù)注射5 min,注射后留針5 min,再緩慢撤針,以確保溶液充分彌散;操作結(jié)束后,用牙科水泥封閉鉆孔,以青霉素粉涂于切口處以防感染,隨后縫合切口,碘伏擦拭消毒;將大鼠置于電熱毯上等候蘇醒,使其平穩(wěn)度過術(shù)后虛弱期。 假手術(shù)組大鼠參照上述操作注射等量的生理鹽水。 術(shù)后恢復(fù)3～7 d。

(4)癡呆大鼠判別

用Morris 水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)測(cè)試其逃避潛伏期,以空白組大鼠4 次訓(xùn)練的平均逃避潛伏期(學(xué)習(xí)成績)作為參考值(所有空白大鼠學(xué)習(xí)成績的平均值記為A),并計(jì)算出同1 d 內(nèi)每只造模大鼠的平均逃避潛伏期(記為B),若(B-A)/B>20%則判定造模成功,歸為癡呆大鼠。

1.3.2 分組及給藥

將50 只判定造模成功的癡呆大鼠按逃避潛伏期隨機(jī)分為5 組:模型組、石杉?jí)A甲組(0.046 mg/kg)、開心散低劑量組(11.48 mg/kg)、開心散中劑量組(22.96 mg/kg)與開心散高劑量組(45.92 mg/kg),每組10 只。 連續(xù)灌胃給藥30 d,每日1 次。 空白組、假手術(shù)組與模型組給予等量的純化水。

1.3.3 Morris 水迷宮行為學(xué)測(cè)試

(1)定位航行試驗(yàn)

試驗(yàn)共歷時(shí)5 d,每天定于固定時(shí)間段,每個(gè)時(shí)間段訓(xùn)練4 次。 4 次訓(xùn)練即將動(dòng)物分別從4 個(gè)不同的起始點(diǎn)(不同象限)放入水中。 動(dòng)物找到平臺(tái)后或120 s 內(nèi)找不到平臺(tái)(潛伏期記為120 s),則由實(shí)驗(yàn)者將其拿上平臺(tái),在平臺(tái)上休息15 s,再進(jìn)行下一次試驗(yàn)。 每日以動(dòng)物4 次訓(xùn)練測(cè)得逃避潛伏期的平均值作為動(dòng)物當(dāng)日的學(xué)習(xí)成績。 前2 d 的定位航行試驗(yàn)作為適應(yīng)性游泳訓(xùn)練以熟悉迷宮環(huán)境,統(tǒng)計(jì)動(dòng)物在第3、4、5 天的學(xué)習(xí)成績變化。

(2)空間探索試驗(yàn)

第6 天撤除原平臺(tái),將動(dòng)物任選1 個(gè)入水點(diǎn)放入水中,所有動(dòng)物必須為同一入水點(diǎn),記錄動(dòng)物在2 min 內(nèi)跨越原平臺(tái)的次數(shù)、在目標(biāo)象限的停留時(shí)間、目標(biāo)象限的游泳路程及游泳總路程,計(jì)算得出目標(biāo)象限游泳路程所占總路程的百分比(目標(biāo)象限游泳路程/游泳總路程)。

1.3.4 標(biāo)本采集

Morris 行為學(xué)測(cè)試結(jié)束后,每組隨機(jī)選取4 只大鼠,低溫環(huán)境下快速斷頭取腦,置于冰磚上矢狀切割腦組織,左側(cè)半腦組織用4%的多聚甲醛溶液固定,4℃保存,用于病理染色及免疫組化分析;右側(cè)半腦低溫下進(jìn)行海馬和皮層的分離,并將海馬、皮層分別用錫箔紙包裹,置于凍存管,-80℃保存,備用于Western blot 檢測(cè);剩余的各組大鼠在低溫環(huán)境下快速斷頭取腦,以冷生理鹽水清洗去除殘血,濾紙吸干后用錫箔紙包裹,-80℃凍存,以供ELISA檢測(cè)。

1.3.5 HE 染色與Nissl 染色

采用HE 染色及Nissl 染色法觀察各組大鼠腦組織的病理形態(tài)與損傷狀況,在400 倍成像下查看皮層、海馬組織各區(qū)域神經(jīng)元的數(shù)量、結(jié)構(gòu)與排列,并分析尼氏小體的數(shù)目與著色深淺,截圖采集圖像。

1.3.6 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)

樣本處理:準(zhǔn)確稱取待測(cè)腦組織重量,按重量(g):體積(mL)= 1 ∶9 的比例加入9 倍體積0.9%的生理鹽水,并放入勻漿珠,冰水浴條件機(jī)械勻漿,制成10%的腦組織勻漿,低溫(4℃)離心10 min(3500 r/min),分離上清液備檢。

檢測(cè)指標(biāo):膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)(ACh、ChAT 及AChE)、炎癥因子(TNF-α、IL-6 及IL-1β)及β-淀粉樣蛋白(APP、Aβ1-40及Aβ1-42)。

1.3.7 免疫組化染色分析(IHC)

采用IHC 法檢測(cè)大腦組織中tau 蛋白、GSK-3β的表達(dá)水平:在400 倍成像下分別截取海馬及皮層區(qū)域內(nèi)互不重疊的3 個(gè)視野,分別測(cè)量每張切片中海馬及皮層區(qū)域各3 個(gè)視野陽性表達(dá)的積分光密度(integrated optical density,IOD)值,IOD 值越高,代表陽性表達(dá)越強(qiáng)。

1.3.8 蛋白免疫印跡法(Western blot)

使用Western blot 法測(cè)定皮層、海馬組織中BAX、BCL-2 的表達(dá)程度:分析目標(biāo)條帶的光密度值,將目的條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值的比值作為目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均采用SAS 8.2 軟件進(jìn)行處理,各組數(shù)列均呈正態(tài)分布時(shí),數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,采用ANOVA 進(jìn)行單因素方差分析,同時(shí)用LSD-t檢驗(yàn)法進(jìn)行組間的多重比較,P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 開心散對(duì)AD 大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

2.1.1 開心散對(duì)AD 大鼠逃避潛伏期的影響

定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與空白組或假手術(shù)組相比,模型組大鼠在第3、4、5 天的逃避潛伏期明顯延長,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 相較于模型組,在第3 天,開心散低、中、高劑量組逃避潛伏期明顯下降(P<0.05 或P<0.01);第4 天,石杉?jí)A甲組、開心散低、中劑量組逃避潛伏期顯著縮短(P<0.05 或P<0.01);第5 天,石杉?jí)A甲組、開心散中劑量組逃避潛伏期明顯縮短(P<0.05)(結(jié)果見表1、圖1)。

表1 開心散對(duì)AD 大鼠逃避潛伏期的影響(±s)Table 1 Effect of Kaixin San on escape latency in AD rats

表1 開心散對(duì)AD 大鼠逃避潛伏期的影響(±s)Table 1 Effect of Kaixin San on escape latency in AD rats

注:與空白組或假手術(shù)組相比,#P<0.05;與模型組相比,△P<0.05,△△P<0.01。Note. Compared with the control group or sham operation group,#P<0.05. Compared with the model group,△P<0.05,△△P<0.01.

組別Groups劑量(mg/kg)Dosage n逃避潛伏期(s)Escape latency第3 天Third day 第4 天Fourth day 第5 天Fifth day空白組Control group / 9 17.59±11.17 9.52±2.91 14.74±9.01假手術(shù)組Sham operation group / 8 19.26±5.19 10.26±8.47 8.92±3.70模型組Model group / 10 32.11±20.17# 19.11±12.74# 16.86±11.66#石杉?jí)A甲組Huperzine A group 0.046 9 25.22±13.65 9.74±6.30△ 7.56±3.29△開心散低劑量組Kaixin San low dose group 11.480 8 17.22±11.70△ 5.85±3.10△△ 10.19±4.99開心散中劑量組Kaixin San medium dose group 22.960 7 16.11±4.80△△ 8.41±7.62△△ 7.76±5.44△開心散高劑量組Kaixin San high dose group 45.920 10 17.02±7.20△△ 13.10±9.13 13.11±9.13

圖1 開心散對(duì)AD 大鼠逃避潛伏期的影響Note. Compared with the control group or sham operation group,# P< 0.05. Compared with the model group,△P < 0.05,△△P<0.01.Figure 1 Effect of Kaixin San on escape latency in AD rats

2.1.2 開心散對(duì)AD 大鼠空間探索能力的影響

與空白組或假手術(shù)組相比,模型組穿越平臺(tái)次數(shù)、目標(biāo)象限停留時(shí)間及游泳路程所占百分比均明顯減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);相較于模型組,開心散中、高劑量組的穿越平臺(tái)次數(shù)增加(P<0.05);開心散低、高劑量組的目標(biāo)象限停留時(shí)間與游泳路程所占百分比均明顯提升(P<0.05 或P<0.01)(結(jié)果見表2、圖2)。

圖2 開心散對(duì)AD 大鼠空間探索能力的影響Note. A, Control group. B, Sham operation group. C, Model group. D, Huperzine A group. E, Kaixin San low dose group. F, Kaixin San medium dose group. G, Kaixin San high dose group. Compared with the control group or sham operation group,#P<0.05. Compared with the model group,△P<0.05,△△P<0.01.Figure 2 Effect of Kaixin San on spatial exploration ability of AD rats

表2 開心散對(duì)AD 大鼠空間探索能力的影響(±s)Table 2 Effect of Kaixin San on spatial exploration ability of AD rats

表2 開心散對(duì)AD 大鼠空間探索能力的影響(±s)Table 2 Effect of Kaixin San on spatial exploration ability of AD rats

注:與空白組或假手術(shù)組相比,#P<0.05;與模型組相比,△P<0.05,△△P<0.01。Note. Compared with the control group or sham operation group, #P<0.05. Compared with the model group,△P<0.05,△△P<0.01.

組別Groups劑量(mg/kg)Dosage n穿越平臺(tái)次數(shù)(次)Number of crossing platform目標(biāo)象限停留時(shí)間(s)Target quadrant residence time目標(biāo)象限路程所占百分比(%)Percentage of target quadrant path空白組Control group / 9 6.56±1.88 50.79±8.47 40.27±5.71假手術(shù)組Sham operation group / 8 7.13±2.10 51.76±10.15 40.27±6.38模型組Model group / 10 5.20±2.86# 44.05±6.54# 32.93±7.78#石杉?jí)A甲組Huperzine A group 0.0460 9 5.67±1.58 46.98±5.79 37.99±5.17開心散低劑量組Kaixin San low dose group 11.480 8 5.88±2.23 51.99±9.04△ 40.25±6.84△開心散中劑量組Kaixin San medium dose group 22.960 7 8.14±3.53△ 48.67±7.80 37.29±5.53開心散高劑量組Kaixin San high dose group 45.920 10 7.60±2.01△ 54.73±6.64△△ 41.92±5.05△△

2.2 開心散對(duì)AD 大鼠腦組織病理形態(tài)的影響

2.2.1 HE 染色

HE 染色結(jié)果顯示,空白組、假手術(shù)組大鼠皮層神經(jīng)元邊界清晰,形態(tài)規(guī)則;海馬組織神經(jīng)元數(shù)量豐富、排列緊密,形態(tài)結(jié)構(gòu)正常。 與空白組相比,模型組皮層、海馬組織均可見神經(jīng)元皺縮,皮質(zhì)細(xì)胞數(shù)量明顯減少,細(xì)胞間隙增大;海馬組織細(xì)胞排列散亂無序,細(xì)胞層數(shù)減少,形態(tài)不規(guī)則,甚至出現(xiàn)核仁消失。 相較于模型組,各給藥組腦組織病理形態(tài)有不同程度的改善,皮層神經(jīng)元數(shù)量增多,皺縮狀態(tài)緩解;海馬區(qū)域細(xì)胞排列較整齊,細(xì)胞層數(shù)增加,形態(tài)結(jié)構(gòu)趨于正常(結(jié)果見圖3)。

圖3 開心散對(duì)AD 大鼠腦組織病理形態(tài)的影響(HE 染色)Note. A, Control group. B, Sham operation group. C, Model group. D, Huperzine A group. E, Kaixin San low dose group. F, Kaixin San medium dose group. G, Kaixin San high dose group.Figure 3 Effect of Kaixin San on pathological morphology of brain tissue in AD rats (HE staining)

2.2.2 Nissl 染色

Nissl 染色結(jié)果顯示,空白組、假手術(shù)組大鼠皮層及海馬組織神經(jīng)元排列整齊、均勻,細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整;尼氏小體數(shù)量豐富,形態(tài)正常,尼氏物質(zhì)呈深藍(lán)色顆?；虬邏K狀染色。 與空白組相比,模型組皮層、海馬中尼氏小體數(shù)量明顯減少,染色變淺,神經(jīng)元排列散亂且間隙明顯增大。 相較于模型組,各給藥組腦組織病理狀況有不同程度的改善,其皮層及海馬組織中尼氏小體數(shù)量增加,且海馬CA1 區(qū)細(xì)胞排列緊密整齊,胞漿著色變深(結(jié)果見圖4)。

圖4 開心散對(duì)AD 大鼠腦組織病理形態(tài)的影響(Nissl 染色)Note. A, Control group. B, Sham operation group. C, Model group. D, Huperzine A group. E, Kaixin San low dose group. F, Kaixin San medium dose group. G, Kaixin San high dose group.Figure 4 Effect of Kaixin San on pathological morphology of brain tissue in AD rats (Nissl staining)

2.3 開心散對(duì)AD 大鼠腦組織中膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)的影響

與空白組或假手術(shù)組相比,模型組大鼠腦組織中ChAT 的活性及ACh 的含量均明顯降低,AChE的活性升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05 或P<0.01)。 相較于模型組,開心散低、高劑量組ACh 的含量明顯增加(P<0.05 或P<0.01);石杉?jí)A甲組、開心散低、中劑量組ChAT 的活性增強(qiáng),且AChE 的活性顯著降低(P<0.05 或P<0.01)(結(jié)果見表3、圖5)。

表3 開心散對(duì)AD 大鼠膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)的影響(±s,n=6)Table 3 Effect of Kaixin San on cholinergic neurotransmitter in AD rats

表3 開心散對(duì)AD 大鼠膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)的影響(±s,n=6)Table 3 Effect of Kaixin San on cholinergic neurotransmitter in AD rats

注:與空白組或假手術(shù)組相比,#P<0.05,##P<0.01;與模型組相比,△P<0.05,△△P<0.01。Note. Compared with the control group or sham operation group,#P<0.05,##P<0.01. Compared with the model group,△P<0.05,△△P<0.01.

組別Groups 劑量(mg/kg)Dosage ACh(pg/mg) ChAT(ng/mg) AChE(ng/mg)空白組Control group / 5.23±0.78 126.29±22.26 0.61±0.14假手術(shù)組Sham operation group / 4.24±0.54 127.70±10.20 0.55±0.10模型組Model group / 3.84±0.98# 113.12±26.33# 0.80±0.11##石杉?jí)A甲組Huperzine A group 0.046 4.68±0.70 174.64±23.47△△ 0.52±0.08△△開心散低劑量組Kaixin San low dose group 11.480 6.13±2.19△△ 138.43±13.36△ 0.63±0.15△開心散中劑量組Kaixin San medium dose group 22.960 4.08±0.92 159.35±19.74△△ 0.55±0.16△△開心散高劑量組Kaixin San high dose group 45.920 5.23±0.78△ 127.07±21.50 0.73±0.16

圖5 開心散對(duì)AD 大鼠膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)的影響Note. A, Control group. B, Sham operation group. C, Model group. D, Huperzine A group. E, Kaixin San low dose group. F, Kaixin San medium dose group. G, Kaixin San high dose group. Compared with the control group or sham operation group,#P<0.05,##P<0.01.Compared with the model group,△P<0.05,△△P<0.01.Figure 5 Effect of Kaixin San on cholinergic neurotransmitter in AD rats

2.4 開心散對(duì)AD 大鼠腦組織中炎癥因子的影響

與空白組或假手術(shù)組相比,模型組大鼠腦組織中TNF-α、IL-1β 及IL-6 等炎癥因子的含量明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。 相較于模型組,石杉?jí)A甲組、開心散低劑量組TNF-α 的含量明顯下降(P<0.05);石杉?jí)A甲組、開心散低、中劑量組IL-1β 與IL-6 的含量顯著降低(P<0.05 或P<0.01)。(結(jié)果見表4、圖6)

表4 開心散對(duì)AD 大鼠腦組織炎癥因子的影響(±s,n=6)Table 4 Effect of Kaixin San on inflammatory factors in brain tissue of AD rats

表4 開心散對(duì)AD 大鼠腦組織炎癥因子的影響(±s,n=6)Table 4 Effect of Kaixin San on inflammatory factors in brain tissue of AD rats

注:與空白組或假手術(shù)組相比,##P<0.01;與模型組相比,△P<0.05,△△P<0.01。Note. Compared with the control group or sham operation group,##P<0.01. Compared with the model group,△P<0.05,△△P<0.01.

組別Groups 劑量(mg/kg)Dosage TNF-α(pg/mg) IL-1β(pg/mg) IL-6(pg/mg)空白組Control group / 8.58±2.76 8.62±1.35 7.32±1.46假手術(shù)組Sham operation group / 8.38±1.53 8.24±0.86 6.32±0.58模型組Model group / 13.30±2.19## 11.51±1.26## 10.03±1.62##石杉?jí)A甲組Huperzine A group 0.046 9.46±2.63△ 7.99±1.69△△ 7.60±1.66△開心散低劑量組Kaixin San low dose group 11.480 9.52±3.37△ 9.24±1.57△ 7.23±2.00△開心散中劑量組Kaixin San medium dose group 22.960 13.24±2.44 8.50±2.54△△ 6.81±2.49△△開心散高劑量組Kaixin San high dose group 45.920 10.22±3.10 10.63±1.75 8.35±2.31

圖6 開心散對(duì)AD 大鼠腦組織炎癥因子的影響Note. A, Control group. B, Sham operation group. C, Model group. D, Huperzine A group. E, Kaixin San low dose group. F, Kaixin San medium dose group. G, Kaixin San high dose group. Compared with the control group or sham operation group,##P<0.01. Compared with the model group,△P<0.05,△△P<0.01.Figure 6 Effect of Kaixin San on inflammatory factors in brain tissue of AD rats

2.5 開心散對(duì)AD 大鼠腦組織中β-淀粉樣蛋白含量的影響

與空白組或假手術(shù)組相比,模型組大鼠腦組織中APP、Aβ1-40及Aβ1-42的含量明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05 或P<0.01);相較于模型組,石杉?jí)A甲組、開心散低、高劑量組APP 的含量顯著下降(P<0.01);開心散中劑量組Aβ1-40的含量降低(P<0.05);石杉?jí)A甲組、開心散中、高劑量組Aβ1-42的含量均明顯減少(P<0.05 或P<0.01)(結(jié)果見表5、圖7)。

表5 開心散對(duì)AD 大鼠腦組織中β-淀粉樣蛋白含量的影響(±s,n=6)Table 5 Effect of Kaixin San on β-amyloid protein content in brain tissue of AD rats

表5 開心散對(duì)AD 大鼠腦組織中β-淀粉樣蛋白含量的影響(±s,n=6)Table 5 Effect of Kaixin San on β-amyloid protein content in brain tissue of AD rats

注:與空白組或假手術(shù)組相比,#P<0.05,##P<0.01;與模型組相比,△P<0.05,△△P<0.01。Note. Compared with the control group or sham operation group,#P<0.05,##P<0.01. Compared with the model group,△P<0.05,△△P<0.01.

組別Groups 劑量(mg/kg)Dosage APP(ng/mg) Aβ1-40(pg/mg) Aβ1-42(pg/mg)空白組Control group / 1.07±0.20 32.25±9.67 16.43±3.53假手術(shù)組Sham operation group / 1.07±0.19 27.64±7.89 14.18±1.98模型組Model group / 1.83±0.22## 40.38±6.81# 22.25±3.64##石杉?jí)A甲組Huperzine A group 0.046 1.09±0.16△△ 30.25±6.46 13.82±3.65△△開心散低劑量組Kaixin San low dose group 11.480 1.06±0.32△△ 33.98±14.58 21.71±8.60開心散中劑量組Kaixin San medium dose group 22.960 1.62±0.56 26.19±9.53△ 12.35±3.15△△開心散高劑量組Kaixin San high dose group 45.920 1.24±0.37△△ 30.31±5.32 16.35±2.24△

圖7 開心散對(duì)AD 大鼠腦組織中β-淀粉樣蛋白含量的影響Note. A, Control group. B, Sham operation group. C, Model group. D, Huperzine A group. E, Kaixin San low dose group. F, Kaixin San medium dose group. G, Kaixin San high dose group. Compared with the control group or sham operation group,#P<0.05,##P<0.01. Compared with the model group,△P<0.05,△△P<0.01.Figure 7 Effect of Kaixin San on β-amyloid protein content in brain tissue of AD rats

2.6 開心散對(duì)AD 大鼠腦組織中tau 蛋白磷酸化的影響

2.6.1 開心散對(duì)AD 大鼠皮層、海馬組織中tau 蛋白表達(dá)水平的影響

與空白組或假手術(shù)組相比,模型組大鼠皮層、海馬組織中tau 蛋白棕黃色陽性表達(dá)產(chǎn)物明顯增多,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05 或P<0.01);相較于模型組,開心散中劑量組皮層組織中tau 蛋白的陽性表達(dá)量顯著下降(P<0.05);石杉?jí)A甲組、開心散低劑量組海馬組織中tau 蛋白的表達(dá)水平均有下調(diào)(P<0.05)(結(jié)果見表6、圖8、圖9)。

圖8 開心散對(duì)AD 大鼠腦組織中tau 蛋白表達(dá)水平的影響Note. A, Control group. B, Sham operation group. C, Model group. D, Huperzine A group. E, Kaixin San low dose group. F, Kaixin San medium dose group. G, Kaixin San high dose group. Compared with the control group or sham operation group,#P<0.05,##P<0.01. Compared with the model group,△P<0.05.Figure 8 Effect of Kaixin San on the expression of tau in brain tissue of AD rats

圖9 開心散對(duì)AD 大鼠腦組織中tau 蛋白表達(dá)水平的影響Note. A, Control group. B, Sham operation group. C, Model group. D, Huperzine A group. E, Kaixin San low dose group. F, Kaixin San medium dose group. G, Kaixin San high dose group.Figure 9 Effect of Kaixin San on the expression of tau in brain bissue of AD rats

表6 開心散對(duì)AD 大鼠腦組織中tau 蛋白表達(dá)水平的影響(±s,n=4)Table 6 Effect of Kaixin San on the expression of tau in brain tissue of AD rats

表6 開心散對(duì)AD 大鼠腦組織中tau 蛋白表達(dá)水平的影響(±s,n=4)Table 6 Effect of Kaixin San on the expression of tau in brain tissue of AD rats

注:與空白組或假手術(shù)組相比,#P<0.05,##P<0.01;與模型組相比,△P<0.05。Note. Compared with the control group or sham operation group,#P<0.05,##P<0.01. Compared with the model group,△P<0.05.

組別Groups 劑量(mg/kg)Dosage 皮層(IOD)Cortex 海馬(IOD)Hippocampus空白組Control group / 826.97±552.16 1244.68±906.16假手術(shù)組Sham operation group / 561.62±295.79 1374.30±814.44模型組Model group / 1390.36±233.98## 2849.53±702.32#石杉?jí)A甲組Huperzine A group 0.046 792.01±304.28 1181.80±500.61△開心散低劑量組Kaixin San low dose group 11.480 928.21±408.26 1479.75±523.92△開心散中劑量組Kaixin San medium dose group 22.960 747.18±486.63△ 1515.77±1139.74開心散高劑量組Kaixin San high dose group 45.920 793.42±505.62 1845.28±1432.42

2.6.2 開心散對(duì)AD 大鼠皮層、海馬組織中GSK-3β 表達(dá)水平的影響

與空白組或假手術(shù)組相比,模型組大鼠皮層、海馬組織中GSK-3β 棕黃色免疫陽性產(chǎn)物明顯增多,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);相較于模型組,石杉?jí)A甲組、開心散高劑量組皮層組織中GSK-3β 陽性表達(dá)量顯著降低(P<0.05 或P<0.01);石杉?jí)A甲組、開心散低、中、高劑量組海馬組織中GSK-3β 表達(dá)水平均下降(P<0.05 或P<0.01)。 (結(jié)果見表7、圖10、圖11)

圖10 開心散對(duì)AD 大鼠腦組織中GSK-3β 表達(dá)水平的影響Note. A, Control group. B, Sham operation group. C, Model group. D, Huperzine A group. E, Kaixin San low dose group. F, Kaixin San medium dose group. G, Kaixin San medium dose group. Compared with the control group or sham operation group,#P<0.05. Compared with the model group,△P<0.05,△△P<0.01.Figure 10 Effect of Kaixin San on GSK-3β expression in brain tissue of AD rats

圖11 開心散對(duì)AD 大鼠腦組織中GSK-3β 表達(dá)水平的影響Note. A, Control group. B, Shamoperation group. C, Model group. D, Huperzine A group. E, Kaixin San low dose group. F, Kaixin San medium dose group. G, Kaixin San high dose group.Figure 11 Effect of Kaixin San on GSK-3β expression in brain tissue of AD rats

表7 開心散對(duì)AD 大鼠腦組織中GSK-3β 表達(dá)水平的影響(±s,n=4)Table 7 Effect of Kaixin San on GSK-3β expression in brain tissue of AD rats

表7 開心散對(duì)AD 大鼠腦組織中GSK-3β 表達(dá)水平的影響(±s,n=4)Table 7 Effect of Kaixin San on GSK-3β expression in brain tissue of AD rats

注:與空白組或假手術(shù)組相比,#P<0.05;與模型組相比,△P<0.05,△△P<0.01。Note. Compared with the control group or sham operation group,#P<0.05. Compared with the model group,△P<0.05,△△P<0.01.

組別Groups劑量(mg/kg)Dosage皮層(IOD)Cortex海馬(IOD)Hippocampus空白組Control group / 4693.20±2424.03 2047.70±554.39假手術(shù)組Sham operation group / 5004.02±1654.56 2421.76±1088.99模型組Model group / 8641.52±2230.49# 3967.49±1515.58#石杉?jí)A甲組Huperzine A group 0.046 4974.27±3274.99△ 2102.58±1375.84△開心散低劑量組Kaixin San low dose group 11.480 5113.12±2794.35 1752.94±1119.70△△開心散中劑量組Kaixin San medium dose group 22.960 5068.12±2072.73 2091.91±627.92△開心散高劑量組Kaixin San high dose group 45.920 2692.39±2236.57△△ 2290.97±785.73△

2.7 開心散對(duì)AD 大鼠腦組織中BCL-2 與BAX表達(dá)水平的影響

與空白組或假手術(shù)組相比,模型組大鼠腦組織中BAX 蛋白的相對(duì)表達(dá)量升高,且BCL-2/BAX 的比值下降,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 相較于模型組,各給藥組腦組織中BAX 蛋白的表達(dá)水平趨于下調(diào)(P>0.05),且BCL-2/BAX 的比值有不同程度的升高趨勢(shì)(P>0.05)(結(jié)果見表8、圖12、圖13)。

圖12 開心散對(duì)AD 大鼠腦組織中BCL-2 及BAX 表達(dá)水平的影響Note. A, Control group. B, Sham operation group. C, Model group. D, Huperzine A group. E, Kaixin San low dose group. F, Kaixin San medium dose group. G, Kaixin San high dose group.Figure 12 Effect of Kaixin San on expression of BCL-2 and BAX in brain tissue of AD rats

圖13 開心散對(duì)AD 大鼠腦組織中BCL-2 及BAX 表達(dá)水平的影響Note. A, Control group. B, Sham operation group. C, Model group. D, Huperzine A group. E, Kaixin San low dose group.F, Kaixin San medium dose group. G, Kaixin San high dose group.Figure 13 Effect of Kaixin San on expression of BCL-2 and BAX in brain tissue of AD rats

表8 開心散對(duì)AD 大鼠腦組織中BCL-2 及BAX 表達(dá)水平的影響(±s,n=4)Table 8 Effect of Kaixin San on expression of BCL-2 and BAX in brain tissue of AD rats

表8 開心散對(duì)AD 大鼠腦組織中BCL-2 及BAX 表達(dá)水平的影響(±s,n=4)Table 8 Effect of Kaixin San on expression of BCL-2 and BAX in brain tissue of AD rats

組別Groups 劑量(mg/kg)Dosage BCL-2 BAX BCL-2/BAX空白組Control group / 1.030±0.331 0.266±0.160 6.032±5.970假手術(shù)組Sham operation group / 1.004±0.296 0.312±0.183 4.478±3.089模型組Model group / 0.916±0.219 0.371±0.223 3.298±2.352石杉?jí)A甲組Huperzine A group 0.046 0.909±0.248 0.201±0.151 6.227±4.265開心散低劑量組Kaixin San low dose group 11.480 0.938±0.374 0.186±0.132 7.675±7.486開心散中劑量組Kaixin San medium dose group 22.960 0.933±0.299 0.241±0.155 4.914±2.918開心散高劑量組Kaixin San high dose group 45.920 1.019±0.324 0.339±0.214 3.920±2.667

3 討論

Morris 水迷宮作為現(xiàn)今應(yīng)用最廣泛的考察嚙齒類動(dòng)物空間學(xué)習(xí)與長期記憶的行為學(xué)測(cè)試[13],提供了一套評(píng)估不同認(rèn)知域功能的靈活方式,其中最廣為人知的隱藏平臺(tái)訓(xùn)練(定位航行)和空間探索檢驗(yàn)可有效評(píng)測(cè)鼠類的空間記憶與記憶保持能力[14]。本研究中,經(jīng)開心散治療后,Aβ1-42造模后的大鼠水迷宮各項(xiàng)目的測(cè)試成績有較明顯提升,說明開心散可在一定程度上改善機(jī)體的認(rèn)知導(dǎo)航能力。

AD 作為一類中樞神經(jīng)系統(tǒng)漸進(jìn)性衰退病癥,從起病、發(fā)展到惡化、死亡的整個(gè)過程均涉及到特有的病理生理學(xué)改變,HE 染色與Nissl 染色可通過簡單的染料組合揭示細(xì)胞細(xì)節(jié)與超微結(jié)構(gòu)分布,借此可推斷神經(jīng)元的功能狀態(tài)與畸變信息[15]。 病理形態(tài)觀察證實(shí),相較于模型組,給藥組大鼠皮層、海馬組織病理狀況有所改善,神經(jīng)元數(shù)量增多,尼氏小體數(shù)目增加,形態(tài)結(jié)構(gòu)趨于正常,表明開心散可緩解AD 動(dòng)物的腦組織損傷,恢復(fù)神經(jīng)元的生理功能。

ACh 參與大腦信息處理的神經(jīng)傳導(dǎo),與人體的記憶行為及學(xué)習(xí)認(rèn)知功能密切相關(guān)。 AD 的病變伴隨著腦內(nèi)ACh 的“合成-傳遞-攝取”鏈?zhǔn)Ш狻hAT與AChE 的活性失常,膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)出現(xiàn)明顯缺陷,進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體學(xué)習(xí)記憶功能障礙[16]。 ELISA 檢測(cè)證明,經(jīng)開心散干預(yù)的AD 大鼠腦組織中AChE活性降低,ChAT 與ACh 的含量上升,進(jìn)一步揭示了開心散對(duì)膽堿能神經(jīng)傳遞的靶向作用,間接維持ACh 合成、降解過程的動(dòng)態(tài)平衡。

慢性免疫炎癥反應(yīng)是AD 發(fā)生并且逐漸惡化的關(guān)鍵誘因[17-19],隨著機(jī)體年齡的增長和Aβ 的持續(xù)生成與集聚,小膠質(zhì)細(xì)胞(MG)與星形膠質(zhì)細(xì)胞(AS)在長期慢性活化過程中被過度激活,導(dǎo)致炎性細(xì)胞因子如IL-1β、IL-6、TNF-α 的大量生成與釋放,腦組織局部炎癥反應(yīng)加重,神經(jīng)元受損、變性甚至死亡[20]。 研究過程中觀察到,AD 大鼠經(jīng)開心散治療后,腦組織中的炎癥因子含量均下降,證明開心散可抑制促炎因子的過度釋放,由此減輕腦內(nèi)炎癥微環(huán)境的毒性效應(yīng)。

Aβ 是由淀粉樣前體蛋白(APP)水解生成的正常代謝物,在β-分泌酶和γ-分泌酶的剪輯切割下,APP 可降解為以Aβ1-40和Aβ1-42為代表的Aβ 肽段[21]。 在健康機(jī)體內(nèi),Aβ 的產(chǎn)生與降解可保持動(dòng)態(tài)平衡;然而當(dāng)機(jī)體發(fā)生衰老、受到物理或化學(xué)損傷時(shí),會(huì)導(dǎo)致“Aβ-APP”代謝鏈?zhǔn)С?Aβ 因此聚積沉淀形成彌漫性的神經(jīng)炎斑[22]。 經(jīng)給藥治療后的AD 鼠腦內(nèi)Aβ 相關(guān)蛋白含量均有降低,表明開心散可減少Aβ 的異常蓄積,使其生成與清除狀態(tài)趨于平衡。

Tau 蛋白是一類與微管相關(guān)的組分,可與微管結(jié)合促進(jìn)其穩(wěn)定并組裝成束,協(xié)助神經(jīng)細(xì)胞間的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)[23]。 由于機(jī)體的衰老和致病因素的入侵,蛋白激酶如GSK-3β 活性的失衡,促使tau 蛋白的異常修飾和過度磷酸化,進(jìn)而毀壞了微管的結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性,軸突運(yùn)輸、信號(hào)傳導(dǎo)等生理功能損壞,最終導(dǎo)致神經(jīng)元的變性死亡和癡呆的發(fā)生[24]。 開心散干預(yù)后的AD 大鼠皮層、海馬組織內(nèi)tau 蛋白及其磷酸化激酶GSK-3β 的表達(dá)水平明顯下調(diào),證明開心散可調(diào)控tau 蛋白磷酸化水平,維護(hù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的正常運(yùn)轉(zhuǎn)。

BCL-2 蛋白質(zhì)大家族主導(dǎo)著細(xì)胞對(duì)誘發(fā)凋亡的各種刺激及損害的敏感性與抵抗力[25]。 根據(jù)結(jié)構(gòu)同源性與功能可分為抗凋亡蛋白(以BCL-2 為代表)與促凋亡蛋白(以BAX 為代表)[26],BCL-2 與BAX 在大腦中的比例介導(dǎo)著神經(jīng)元的存活[27]。 研究發(fā)現(xiàn),開心散治療后的AD 大鼠腦組織中BAX 蛋白的表達(dá)量有所降低,且BCL-2/BAX 的比值趨于升高,表明開心散在一定程度上可干涉凋亡因子對(duì)神經(jīng)元的毀傷,進(jìn)而減少其凋亡的發(fā)生。

然而,本研究旨在對(duì)開心散抗癡呆的藥理活性進(jìn)行全面篩查與驗(yàn)證,所采用的海馬CA1 區(qū)注射Aβ1-42寡聚體致癡呆模型只能復(fù)制AD 的部分癥狀與病因,且研究所設(shè)立的指標(biāo)與靶點(diǎn)較為寬泛,缺乏針對(duì)單一神經(jīng)功能系統(tǒng)或完整信號(hào)蛋白通路的側(cè)重考查,還需在后續(xù)研究中加以補(bǔ)充探索。

由以上可知,開心散對(duì)雙側(cè)海馬CA1 區(qū)注射Aβ1-42造模大鼠的癡呆癥狀與腦組織損傷有較好的治療作用和緩解效果,其作用機(jī)制涉及到膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)、炎癥因子、β-淀粉樣蛋白、tau 蛋白磷酸化水平以及凋亡因子等多靶點(diǎn)、多通路的靶向調(diào)控與干預(yù),此研究也進(jìn)一步證實(shí)開心散抗癡呆的藥理活性,其作為治療“好忘”的經(jīng)典古方具備進(jìn)一步挖掘的價(jià)值。