外源性干預(yù)VEGF-C表達(dá)對(duì)肺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及機(jī)制

肖躍華，馬忠廈，陳宏旺，代傳宙，崔鑫鵬，顏慧

1郴州市第一人民醫(yī)院胸部腫瘤外科，湖南 郴州 422200；2郴州市第一人民醫(yī)院婦科腫瘤外科

目前，全球死于肺癌的人數(shù)逐年增加。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2015年我國(guó)肺癌發(fā)病率為0.733%，病死率為0.610%，均居世界首位，預(yù)計(jì)2025年我國(guó)死于肺癌的人數(shù)將達(dá)百萬(wàn)［1］。工業(yè)城市與礦區(qū)的肺癌發(fā)病率最高，在中國(guó)，肺癌的5年生存率僅為8%，原因主要為患者確診時(shí)已屬晚期，錯(cuò)過(guò)最佳治療時(shí)間［2］。肺癌是一種預(yù)后極差的疾病，肺癌的發(fā)生、發(fā)展及細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移極為復(fù)雜［3］。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-C（VEGF-C）可刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖，從而誘導(dǎo)血管和淋巴管生成。VEGF-C是淋巴管新生的有力誘導(dǎo)劑，是首個(gè)被識(shí)別具有促淋巴管新生的特異性作用［4］。研究證實(shí)，在多種原發(fā)惡性腫瘤（如胃癌、子宮癌、肝癌）組織中VEGF-C表達(dá)均高于癌旁組織，可能與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。國(guó)外已有較多實(shí)驗(yàn)報(bào)道證實(shí)，VEGF-C在癌細(xì)胞淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中有促進(jìn)作用［5］，阻斷VEGF-C在腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的這一機(jī)制，可能會(huì)控制惡性腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移［6］。有學(xué)者進(jìn)一步證明了VEGF-C在淋巴管生成及腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的作用。端粒酶卡扎爾體蛋白1（TCAB1）為端粒酶核心的蛋白組成部分，屬于WD40家族一員，可靈活循環(huán)介導(dǎo)分子間的相互作用，TCAB1蛋白表達(dá)與多種散發(fā)性腫瘤風(fēng)險(xiǎn)升高有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，TCAB1參與了DNA的損傷應(yīng)答，可修復(fù)損傷的DNA［7］。研究發(fā)現(xiàn)，TCAB1在癌細(xì)胞中一定程度上過(guò)表達(dá)［8］，但其在肺癌中的作用機(jī)制尚不明確。2020年10月—12月，我們通過(guò)離體實(shí)驗(yàn)觀察了外源性VEGF-C對(duì)肺癌細(xì)胞生物行為及TCAB1信號(hào)作用機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料肺癌細(xì)胞（A549細(xì)胞）購(gòu)于蘇州千舍生物科技有限公司；鼠抗人VEGF-C單克隆抗體購(gòu)于杭州聯(lián)科美訊生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；TCAB1抗體購(gòu)于巴傲得生物科技有限公司；胎牛血清購(gòu)自上海冰晴生物科技；MTT試劑盒、二甲基亞砜（DMSO）購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)有限公司；TRIzol購(gòu)于武漢科昊佳生物科技有限公司；蛋白電泳儀購(gòu)于濟(jì)南來(lái)寶醫(yī)療器械有限公司；RT-PCR試劑盒和儀器購(gòu)自上海雅吉生物科技有限公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒購(gòu)于蘇州宇恒生物科技有限公司；Transwell小室和基質(zhì)膠購(gòu)于寶信生物；流式細(xì)胞儀購(gòu)自北京德利卡生物技術(shù)有限公司。

1.2 A549細(xì)胞培養(yǎng)將低溫冷藏的A549細(xì)胞，快速移入37℃水中溶解，離心后，棄上清，加入培養(yǎng)基，37.5℃、5%CO2中培養(yǎng)，貼壁生長(zhǎng)，1～2 d更換新的培養(yǎng)液，細(xì)胞生長(zhǎng)至90%時(shí)，加入蛋白液消化，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 細(xì)胞分組及轉(zhuǎn)染取A549細(xì)胞1×106/mL，分為BK組、VC組、SC組。BK組不轉(zhuǎn)染，VC組、SC組均于EP管中放入200 μL轉(zhuǎn)染液體和4 μL脂質(zhì)體，SC組、VC組分 別加入5 μg的miR-21 mimics、NC mimics，充分混合，轉(zhuǎn)染7 h后備用。

1.4 A549細(xì)胞存活率檢測(cè)采用MTT法。將各組A549細(xì)胞按照1×106/mL接種到96板中，更換含有1%的牛血清培養(yǎng)基中同步消化。吸去原培養(yǎng)液，每個(gè)濃度6個(gè)復(fù)孔，均加入5 mg/mL的MTT溶液20μL，培養(yǎng)12、24、48及72 h后，吸棄培養(yǎng)液，再于每個(gè)孔中加入50 μL DMSO，搖勻后置于490 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)（OD值），取3次平均值，細(xì)胞存活率（%）=［A（加藥）-A（凋零）］／［A（對(duì)照）-A（凋零）］×100%。

1.5 A549細(xì)胞侵襲能力檢測(cè)采用Transwell小室。將各組A549細(xì)胞接種于6孔板中，將50 mg/L的基質(zhì)膠稀釋后加入小室上層，37℃下呈凝膠狀態(tài)，細(xì)胞數(shù)目為1×106/mL，上室中加入細(xì)胞懸液，下室中加入少量胎牛血清培養(yǎng)基，37.5℃培養(yǎng)2 d，取出培養(yǎng)基，拭去殘留細(xì)胞，現(xiàn)配結(jié)晶紫，每孔500μL，將小室放入，25℃染色30 min，PBS清洗1次，稍晾干。顯微鏡觀察樣本，連續(xù)選5個(gè)清晰不同視野進(jìn)行數(shù)量統(tǒng)計(jì)，然后計(jì)算平均數(shù)。

1.6 A549細(xì)胞凋亡率檢測(cè)采用流式細(xì)胞儀。將0.25%蛋白酶消化的A549細(xì)胞，以5×107/mL個(gè)數(shù)接種到無(wú)牛血清培養(yǎng)基過(guò)夜，24 h后，2 000 r/min離心5 min（離心半徑6 cm），PBS沖洗3次，100μL接種于5 mL流式試管中，5μL的AnnexinⅤ與5μL的PI混合后染色，無(wú)光條件下，孵育15 min后注入400μL結(jié)合緩沖液用移液槍輕輕混勻，予以洗滌，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)，記錄細(xì)胞凋亡情況。

1.7 A549細(xì)胞中TCAB1蛋白表達(dá)檢測(cè)采用免疫印跡法。取A549細(xì)胞，給予TCAB1 siRNA干預(yù)，作為T(mén)C組。將各組A549細(xì)胞加入少量胰蛋白酶消化后，500 r/min離心5 min（離心半徑6 cm），離心保留上清液，放入樣孔中，進(jìn)行電泳實(shí)驗(yàn)。PVDF膜TBS浸泡10 min，反 復(fù)PBS沖 洗，每 次5 min，加 入1抗（1∶500），4℃孵育過(guò)夜；TBST溶液洗滌5 min×3次；加入相應(yīng)2抗（1∶2 000），室溫孵育30 min，雜交沖洗。后將膜浸入ECL工作液，隨后進(jìn)行檢測(cè)，獲取圖象。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料符合正態(tài)分布以±s表示，兩組間比較用t檢驗(yàn)，多組間比較用單因素方差分析，不同時(shí)間點(diǎn)比較采用重復(fù)測(cè)量方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組A549細(xì)胞存活率比較干預(yù)12、24、48、72 h時(shí)，BK組與VC組A549細(xì)胞存活率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05），SC組A549細(xì)胞存活率低于BK組、VC組，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 各組不同時(shí)點(diǎn)A549細(xì)胞存活率比較（%，±s）

表1 各組不同時(shí)點(diǎn)A549細(xì)胞存活率比較（%，±s）

注：與BK組比較，*P＜0.05；與VC組比較，#P＜0.05。

組別BK組VC組SC組A549細(xì)胞存活率12 h 100.00 99.71±1.06 81.29±6.59*#24 h 98.76±5.89 92.52±5.92 75.75±6.41*#48 h 95.54±5.68 93.43±5.65 61.38±6.02*#72 h 91.74±5.94 93.79±5.88 57.42±4.63*#

2.2 各組A549細(xì)胞侵襲數(shù)目比較BK組與VC組A549細(xì) 胞侵 襲 數(shù) 目 分 別 為（148.04±13.64）、（146.65±12.96）個(gè)，兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），SC組A549細(xì)胞侵襲數(shù)目為（104.53±9.87）個(gè)，低于BK組、VC組，三組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=24.383，P＜0.001）。

2.3 各組A549細(xì)胞凋亡率比較BK組與VC組A549細(xì)胞凋亡率分別為（8.63±0.84）%、（8.42±0.72）%，兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。SC組A549細(xì)胞凋亡率為（19.29±2.08）%，高于BK組、VC組，三組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=125.326，P＜0.05）。

2.4 各組A549細(xì)胞中TCAB1蛋白表達(dá)比較BK組、VC組A549細(xì)胞中TCAB1蛋白表達(dá)分別為2.03±0.21、1.98±0.20，兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），SC組A549細(xì)胞中TCAB1蛋白表達(dá)為1.35±0.12，低于BK組、VC組（P均＜0.05）。

3 討論

肺癌是原發(fā)于支氣管黏膜上皮細(xì)胞或肺泡上皮細(xì)胞的最常見(jiàn)惡性腫瘤之一，盡管目前針對(duì)肺癌的治療手段逐步提升，但肺癌患者術(shù)后的生存率仍較低［9］。造成存活率較低的原因主要有腫瘤細(xì)胞的侵襲、增殖、轉(zhuǎn)移、凋亡，其中腫瘤的轉(zhuǎn)移是腫瘤細(xì)胞從原發(fā)部位通過(guò)血管、淋巴管系統(tǒng)向其他器官擴(kuò)散，這是造成患者死亡的主要原因［10］。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，某些生長(zhǎng)因子介入了癌細(xì)胞的侵襲和凋亡過(guò)程［11］。本研究前期對(duì)肺癌細(xì)胞生物學(xué)行為及TCAB1信號(hào)進(jìn)行論證、分析，RNAi技術(shù)有較好的普遍性及穩(wěn)定性，沉默效率較高，其中shRNA可更高效地下調(diào)目的基因表達(dá)。針對(duì)VEGF-C與腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲過(guò)程的關(guān)系及對(duì)TCAB1信號(hào)的影響，我們發(fā)現(xiàn)VEGFCmRNA在肺癌組織中的表達(dá)高于癌旁組織。VEGF-C可介導(dǎo)淋巴血管生成，是一個(gè)特異性淋巴管生成因子，在乳腺癌、子宮腫瘤、食管癌中均高表達(dá)，并且隨著腫瘤惡性程度的增加VEGF-C表達(dá)不斷增高［12］。劉樹(shù)庫(kù)等［13］研究證實(shí)，VEGF-C mRNA表達(dá)在癌組織及癌旁組織的相對(duì)含量高于正常組織。本研究通過(guò)免疫印跡法檢測(cè)A549細(xì)胞中TCAB1蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，SC組TCAB1在A549細(xì)胞中蛋白表達(dá)低于BK組、VC組，TC組與SC組A549細(xì)胞中TCAB1蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明抑制VEGF-C表達(dá)可降低TCAB1表達(dá)，其作用效果與敲除TCAB1基因相似。TCAB1是端粒酶關(guān)鍵核心蛋白成分，在腫瘤組織中高表達(dá)，TCAB1蛋白表達(dá)障礙與罹患多種散發(fā)性腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)升高有關(guān)，對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有重要作用［14］。有研究發(fā)現(xiàn)，TCAB1基因在A549細(xì)胞中表達(dá)升高，TCAB1能調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的放射敏感性，在惡性腫瘤細(xì)胞中均異常表達(dá)，并可使正常細(xì)胞惡化，若外源性降低TCAB1表達(dá)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡［15］。同時(shí)VEGF-C siRNA對(duì)TCAB1表達(dá)有一定影響，VEGF-C siRNA轉(zhuǎn)染肺癌細(xì)胞A549可顯著抑制TCAB1 mRNA和蛋白表達(dá)。戢楠楠等［16］研究證實(shí)，TCAB1具有致癌基因的一般特性，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展，但目前其致癌作用機(jī)制尚不明確，需進(jìn)一步研究。

本研究結(jié)果顯示，BK組、VC組A549細(xì)胞在48、72 h的存活率均低于SC組。VEGF-C可使腫瘤細(xì)胞進(jìn)入淋巴管，促進(jìn)腫瘤因子的轉(zhuǎn)移、存活，在不同階段有重要作用，表明敲除了VEGF-C后可阻礙其功能發(fā)揮，沉默VEGF-C的基因效應(yīng)持續(xù)擴(kuò)增，可降低癌細(xì)胞存活率［17］。郭夢(mèng)麗等［18］研究證實(shí)，VEGF-C基因的siRNA表達(dá)載體能抑制VEGF-C基因表達(dá)，并可抑制癌細(xì)胞增殖，減少癌細(xì)胞生存率。本研究表明，SC組A549細(xì)胞發(fā)生侵襲的細(xì)胞數(shù)量低于其他兩組，說(shuō)明降低VEGF-C表達(dá)可抑制肺癌細(xì)胞侵襲。VEGF-C會(huì)導(dǎo)致惡性腫瘤或周邊淋巴管的增生，從而導(dǎo)致淋巴管擴(kuò)張不斷增大，使癌細(xì)胞接觸到淋巴管的幾率變大；VEGF-C還可調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞，使淋巴腔變大，從而使癌細(xì)胞迅速進(jìn)入淋巴管，發(fā)生轉(zhuǎn)移［19］。馮瑤瑤等［20］研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌中的VEGF-C表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與惡性進(jìn)展有關(guān)，與本研究結(jié)果基本相似。有研究表明，VEGF-C siRNA可激活凋亡途徑引起癌細(xì)胞凋亡，使癌細(xì)胞發(fā)生G1/S期阻滯，減少癌細(xì)胞增殖、存活，表明其在癌細(xì)胞的生長(zhǎng)中起到抗凋亡作用［18］。徐海等［21］研究證實(shí)，子宮內(nèi)膜中的VEGF-C變化與癌細(xì)胞的凋亡有關(guān)，VEGF-C可作為治療子宮內(nèi)膜癌的特異性靶點(diǎn)，有利于生物治療的進(jìn)行，這與本研究結(jié)果相似。外源性降低VEGF-C表達(dá)可提高A549細(xì)胞凋亡數(shù)量。

綜上所述，外源性降低VEGF-C表達(dá)可降低A549細(xì)胞存活率及侵襲能力，提高細(xì)胞凋亡率；其作用機(jī)制可能與抑制TCAB1蛋白表達(dá)有一定關(guān)系。