細(xì)胞自噬分子調(diào)控機(jī)制的研究進(jìn)展

王 劭 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所 福州 350013

自噬過程于1957年由克拉克首次使用電子顯微鏡描述，但“自噬”一詞于1963年由因在溶酶體方面的工作獲得諾貝爾獎的Christian de Duve首次引入。自噬（auto-self，phagy-eating）被定義為一種進(jìn)化上保守且受嚴(yán)格調(diào)控的溶酶體途徑，可降解細(xì)胞質(zhì)物質(zhì)和細(xì)胞器，甚至降解微生物入侵者[1-2]。自噬過程具有不同的清除細(xì)胞質(zhì)成分的機(jī)制和途徑，因此，可以更準(zhǔn)確地細(xì)分為3種類型：巨自噬、微自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬[3-5]。從酵母到人類，微自噬和巨自噬都是高度進(jìn)化保守的，而分子伴侶介導(dǎo)的自噬是一種選擇性自噬形式，僅在哺乳動物細(xì)胞中觀察到[6-7]。巨自噬代表了最廣泛研究的自噬形式，并且涉及稱為自噬體的雙膜囊泡的顯著形成，其在與溶酶體融合之前圍繞并隨機(jī)隔離細(xì)胞質(zhì)成分[8-10]。一般來說，自噬被認(rèn)為是一種非選擇性的促生存細(xì)胞反應(yīng)[11]。然而，幾種表現(xiàn)出選擇性的自噬形式，例如mitophagy（降解線粒體）、reticulophagy（降解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)）、xenophagy（降解微生物）和aggrephagy（降解聚集的蛋白質(zhì)）已被認(rèn)可[12-13]。

1 自噬的調(diào)控與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)

自噬的原始科學(xué)定義（希臘語，“自食”）是將細(xì)胞質(zhì)貨物運送到溶酶體進(jìn)行降解[14-15]。至少存在三種不同形式的自噬（巨自噬、微自噬和伴侶介導(dǎo)的自噬），它們在向溶酶體輸送貨物的方式方面有所不同。巨自噬是真核細(xì)胞用于維持營養(yǎng)穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞器質(zhì)量控制的主要分解代謝機(jī)制，它由一組進(jìn)化上保守的基因介導(dǎo)，即自噬相關(guān)基因（ATG），最初是在酵母基因篩選中發(fā)現(xiàn)的[16]。除了少數(shù)例外，所有ATG基因都是有效形成密封自噬體所必需的，這些自噬體繼續(xù)與溶酶體融合[17-18]。在高等真核生物中，許多ATG基因功能多樣化，以促進(jìn)細(xì)胞外貨物向溶酶體遞送，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)貨物的質(zhì)膜定位或細(xì)胞外釋放，并協(xié)調(diào)細(xì)胞內(nèi)與各種細(xì)胞信號通路的通訊。

在哺乳動物細(xì)胞中，饑餓誘導(dǎo)的自噬受大約20種核心ATG蛋白的調(diào)節(jié)[19-20]，這些蛋白可分為幾個功能單元：（1）ULK激酶核心復(fù)合物，包括ULK1/2、ATG13、RB1CC1/FIP200和ATG101；（2）自噬特異性III類磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）復(fù)合物，包括VPS34、VPS15、Beclin1和ATG14L；（3）ATG9A運輸系統(tǒng)，包括ATG9A、WIPI1/2和ATG2A；（4）ATG12泛素-類似偶聯(lián)系統(tǒng)，包括ATG12、ATG7、ATG10、ATG5和ATG16L1；（5）LC3類泛素偶聯(lián)系統(tǒng)，包括LC3A/B/C、ATG7、ATG3和ATG4A/B/C/D。這些ATG蛋白在液泡附近分層募集，并組織自噬體形成所必需的自噬體前結(jié)構(gòu)。在ATG8脂質(zhì)系統(tǒng)中，活化的I型ATG8（LC3-I）被移動到ATG3，最終與磷脂酰乙醇胺結(jié)合[21]。ATG8-磷脂酰乙醇胺化合物通常被稱為II型ATG8（LC3-II），是最公認(rèn)的自噬活性分子標(biāo)記物。p62在選擇性自噬與泛素信號傳導(dǎo)之間起作用，與多泛素化蛋白聚集體結(jié)合并與LC3-II結(jié)合，使吞噬細(xì)胞能夠吞噬細(xì)胞溶質(zhì)成分、生長并最終關(guān)閉自噬體。由于蛋白質(zhì)p62通常被自噬降解并在自噬受到抑制時積累，因此，p62的減少表明囊泡降解和自噬通量成功[22-23]。

由于鑒定了許多自噬相關(guān)基因ATG，以及憑借于監(jiān)測這一過程的實驗方法，自噬得到了廣泛的研究[24]。用電子顯微鏡檢測自噬體是最傳統(tǒng)的方法。因此，常規(guī)形態(tài)測量法是目前評估組織和培養(yǎng)細(xì)胞中自噬的標(biāo)準(zhǔn)。然而，電子顯微鏡方法的潛力有限，因此應(yīng)用了用于識別和量化以及調(diào)節(jié)自噬活性的新方法，熒光顯微鏡是檢測參與自噬體生物發(fā)生的分子的有力方法[25-26]。迄今為止，LC3（一種微管相關(guān)蛋白1輕鏈3）是唯一一種在從吞噬細(xì)胞到溶酶體降解的整個過程中特異性定位于自噬結(jié)構(gòu)的特征明確的蛋白質(zhì)[27-28]。自噬體的數(shù)量通常與LC3-II點狀結(jié)構(gòu)的數(shù)量密切相關(guān)，因此通?？梢允褂脽晒怙@微鏡對其進(jìn)行可視化，并使用圖像分析軟件進(jìn)行分析。LC3-II表達(dá)也可以通過免疫印跡分析或流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行定量和靈敏監(jiān)測[29]。盡管LC3-II是一種很有前途的自噬體標(biāo)志物，但有必要仔細(xì)解釋結(jié)果，因為LC3-II水平升高可能與自噬體合成增強(qiáng)或自噬體轉(zhuǎn)換減少有關(guān)[30]。自噬是一個動態(tài)和連續(xù)的細(xì)胞內(nèi)降解過程，用于去除蛋白質(zhì)或因折疊錯誤而老化、受損的細(xì)胞器。自噬通常是身體對饑餓和其他壓力的非選擇性反應(yīng)，令人驚訝的是，在營養(yǎng)豐富的條件下會發(fā)生基本自噬或組成性自噬。自噬具有復(fù)雜的過程和調(diào)控機(jī)制，在生理或病理條件下具有重要意義[31-32]。

自噬主要是一種有效的細(xì)胞內(nèi)分解代謝途徑，用于降解異常細(xì)胞蛋白聚集體和受損細(xì)胞器。盡管自噬最初被認(rèn)為是一種細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)，但越來越多的證據(jù)表明它在多種生物過程中發(fā)揮著正常的生理作用[33]。迄今為止，已在生命體大多數(shù)器官和許多不同的發(fā)育階段發(fā)現(xiàn)自噬，表明它對細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和更新至關(guān)重要[34]。自噬具有抗應(yīng)激和生理功能，一方面，自噬通過降解細(xì)胞內(nèi)成分在營養(yǎng)剝奪或其他壓力下為合成代謝產(chǎn)生新的構(gòu)件和能量；另一方面，自噬通過在正常條件下降解受損的細(xì)胞器或有害成分，參與細(xì)胞穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)和疾病預(yù)防。大量研究表明，在正常生理條件下，自噬發(fā)生在各種組織和器官中，并且處于不同的發(fā)育階段。這些結(jié)果表明，自噬在正常組織的發(fā)育和功能維持中是必不可少的。自噬的生理作用可分為兩個方面：在形態(tài)發(fā)生過程中促進(jìn)細(xì)胞重塑以及在成熟后維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[35-36]。因此，自噬在生物體中發(fā)揮著重要的生理功能。

2 自噬體途徑

自噬通過自噬體的形成將細(xì)胞質(zhì)成分傳遞給溶酶體降解[37-39]。自噬的形態(tài)學(xué)試驗包括幾個連續(xù)的階段：起始、成核、伸長、閉合、成熟，最后降解和向細(xì)胞質(zhì)輸出物質(zhì)（見圖1）。

圖1 細(xì)胞自噬機(jī)制及其調(diào)控

2.1 自噬誘發(fā) 在最初的步驟中，形成了一種杯狀的雙膜結(jié)構(gòu)，稱為“隔離膜”。這種獨特的液泡周圍結(jié)構(gòu)，稱為吞噬細(xì)胞，被認(rèn)為是自噬體的前體，即為一種含有細(xì)胞質(zhì)成分的雙膜囊泡[40]。隔離膜的確切來源仍有爭議，但可能沒有單一來源。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體外膜或高爾基體的無核糖體區(qū)域似乎是吞噬細(xì)胞的來源[41-43]。

2.2 自噬膜伸長和閉合 吞噬細(xì)胞伸長并完全捕獲隔離的待降解內(nèi)容物，形成雙膜自噬體，或“自噬泡”。隔離可以是非特異性的，涉及吞噬大量細(xì)胞質(zhì)；也可以是選擇性的，針對特定的目標(biāo)內(nèi)容物，如細(xì)胞器或侵入性微生物[44]。自噬體在細(xì)胞質(zhì)中隨機(jī)形成，典型的自噬體雙膜空泡大小為300～900 nm。這一步是一個簡單的隔離，不會發(fā)生降解。

2.3 自噬體成熟和降解 完整的自噬體經(jīng)歷了一個逐步成熟的過程，包括自噬體與溶酶體融合，自噬溶酶體內(nèi)容物被水解酶降解。最近的一些研究揭示了細(xì)胞骨架元素（如肌動蛋白微絲和微管）在自噬的特定方面的重要性[45]。自噬體以依賴動力蛋白的方式沿著微管運輸?shù)饺苊阁w，溶酶體聚集在微管組織中心（MTOC，位于細(xì)胞核附近）周圍。在那里，自噬體與溶酶體對接，自噬體的外膜依次與溶酶體的膜融合[46]。內(nèi)膜最終與貨物一起被駐留的水解酶消耗掉。此外，自噬體可以首先與其他囊泡融合，包括內(nèi)體和多泡體，形成稱為兩性體的混合細(xì)胞器，隨后與溶酶體融合，其中包埋的細(xì)胞溶質(zhì)內(nèi)容物被降解[47]。目前尚不清楚兩性體形成是否是自噬體-溶酶體融合的先決條件。與溶酶體融合的自噬體隨后成熟為單膜降解細(xì)胞器自溶酶體，通常稱為“自噬溶酶體”[48]。水解酶的酸化和獲得，包括蛋白酶、脂肪酶、核酸酶和糖苷酶，使自溶酶體能夠降解隔離的自噬體內(nèi)成分，然后將分解產(chǎn)物轉(zhuǎn)移回細(xì)胞質(zhì)，在那里它們可以被回收或進(jìn)一步分解代謝。自噬泡的流動性依賴于微管，而融合似乎與細(xì)胞骨架元素?zé)o關(guān)。上述液泡的定義是基于它們的功能，而不是它們的形態(tài)。因此，區(qū)分自噬體、兩性體和自溶體并不容易，盡管已經(jīng)提出了一些監(jiān)測自噬通量的方法，但降解步驟相當(dāng)難以測量[49]。自噬體的成熟是一個相對較快的過程，在饑餓條件下，所有描述的事件都發(fā)生在10～15 min內(nèi)[50]。

3 自噬活性的調(diào)節(jié)

在哺乳動物中，自噬體的形成似乎是一個高度協(xié)調(diào)的多步驟過程。在自噬體形成的早期階段，自噬泡的成核需要III類磷酸肌醇3-激酶（PI3K）的活性，PI3K是含有重要蛋白質(zhì)ATG6（也稱為Beclin 1）的大分子特異性復(fù)合物的一部分[51]。在哺乳動物中，至少有3種類型的III-PI3激酶復(fù)合物有助于自噬，因此，自噬體的形成受到Rab7和UV-RAGVps34-beclin1 PI3激酶復(fù)合體的正向調(diào)節(jié)，而由Rubicon-UV-RAG-Vsp34-beclin1復(fù)合物負(fù)調(diào)控[52-53]。雖然由含有Beclin-1的復(fù)合物產(chǎn)生的PI3標(biāo)記了自噬體生成的位點，但吞噬細(xì)胞的延伸和自噬體的成熟需要2個泛素樣系統(tǒng)[54]。ATG5和ATG12參與2個類泛素化反應(yīng)中的第一個，這些反應(yīng)與ATG16L（ATG16樣）非共價相互作用以形成復(fù)合物[55-56]。第二個類泛素化反應(yīng)涉及在哺乳動物中切割微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(MAP1-LC3)，也稱為ATG8或LC3，隨后與磷脂、磷脂酰乙醇胺(PE)結(jié)合形成LC3-II在自噬體膜中[57]。LC3-II是一種獨特的蛋白質(zhì)，它與新形成的自噬體膜特異性相關(guān)，而不與其他囊泡結(jié)構(gòu)相關(guān)，LC3-II存在于細(xì)胞溶質(zhì)和自噬體內(nèi)表面，因此在自噬體形成過程中增加[58]。在哺乳動物中，LC3從LC3-I（游離形式）轉(zhuǎn)化為LC3-II（PE結(jié)合形式），被認(rèn)為是自噬體形成的關(guān)鍵步驟[59]。盡管ATG5-ATG12在自噬體形成完成后丟失，但即使在與溶酶體融合后，LC3-II仍與自噬體結(jié)合，此后自噬體細(xì)胞溶質(zhì)面上的LC3-II可以脫脂并回收（至LC3-I）。因此，LC3-II的水平與自噬體數(shù)量相關(guān)，這種特定的關(guān)聯(lián)使其成為監(jiān)測自噬的極佳標(biāo)志物[60-61]。此外，自噬體的形成受到細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外氨基酸濃度和ATP水平的嚴(yán)格調(diào)節(jié)，這些信號通路包括哺乳動物雷帕霉素靶點mTOR激酶[62]。這種進(jìn)化上保守的TOR激酶復(fù)合物1是營養(yǎng)狀態(tài)的傳感器，在控制細(xì)胞生長中起重要作用[63]。

4 自噬的生理功能

自噬在所有真核細(xì)胞中組成性地以低基礎(chǔ)水平發(fā)生，它作為細(xì)胞質(zhì)量控制機(jī)制發(fā)揮作用，負(fù)責(zé)細(xì)胞內(nèi)成分的正常更新和維持細(xì)胞能量平衡[64]。在大多數(shù)情況下，自噬構(gòu)成了促進(jìn)細(xì)胞存活的應(yīng)激適應(yīng)途徑，因此與許多基本生理活動有關(guān)，例如發(fā)育、分化和組織重塑[65-66]。自噬產(chǎn)生的分解產(chǎn)物-氨基酸、脂肪酸、核苷和碳水化合物，由溶酶體通透酶釋放，可以全身輸送并輸出到細(xì)胞質(zhì)中以供重復(fù)使用。此外，自噬降解中釋放的氨基酸可以與脂肪酸一起被三羧酸循環(huán)用于維持細(xì)胞ATP的產(chǎn)生[67]。自噬可以通過許多壓力源迅速上調(diào)，包括營養(yǎng)缺乏、激素和生長因子剝奪、高溫或缺氧或藥物（例如雷帕霉素）[68]。真核生物中最著名的進(jìn)化保守應(yīng)激反應(yīng)是饑餓期間在培養(yǎng)細(xì)胞和完整生物體中刺激自噬[69-70]。最近，人們認(rèn)識到自噬不僅有助于細(xì)胞質(zhì)成分的更新，而且還可以靶向細(xì)胞內(nèi)病原體以在先天免疫過程中降解[71-72]。自噬的這種管家功能包括通過稱為異體吞噬的過程直接消除某些細(xì)胞內(nèi)微生物病原體。消除許多細(xì)菌（A組鏈球菌、金黃色葡萄球菌、結(jié)核分枝桿菌、冠狀立克次體）、寄生蟲（弓形蟲）和病毒（I型單純皰疹病毒），自噬參與細(xì)胞自主抗菌防御系統(tǒng)[73-75]。

此外，自噬在調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫反應(yīng)、免疫耐受以及免疫系統(tǒng)的發(fā)育和穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用[76]。在神經(jīng)系統(tǒng)中，自噬的刺激限制了有毒產(chǎn)物的積累并保護(hù)神經(jīng)元免于退化[77]。在肌肉中，心臟細(xì)胞的基礎(chǔ)自噬似乎在細(xì)胞質(zhì)成分（包括線粒體）的轉(zhuǎn)換中具有特殊的管家作用，并且在應(yīng)激反應(yīng)中被上調(diào)[78]。Griffiths等研究表明，自噬通過減少氧化應(yīng)激和炎癥以及增加一氧化氮的生物利用度來保護(hù)動脈內(nèi)皮功能。也有人提出自噬參與網(wǎng)織紅細(xì)胞成熟過程中線粒體的降解[79]。來自肝臟的脂滴通過它們在自溶酶體中的組成性降解被消除[80]，但另一方面，自噬是產(chǎn)生白色脂肪組織特征的大脂滴所必需的。自噬的抗衰老作用可能取決于其質(zhì)量控制功能，該功能通過易于聚集的蛋白質(zhì)的沉積和受損的線粒體來限制活性氧的產(chǎn)生[81]。越來越多的證據(jù)表明，在嚙齒類動物和人類中，經(jīng)典自噬（巨自噬）和伴侶介導(dǎo)的自噬水平隨著衰老而下降[82]。

老化的有絲分裂后細(xì)胞的一個主要特征是黃褐色自發(fā)熒光脂褐質(zhì)沉積物的積累[83]。自噬的一個關(guān)鍵生理作用似乎是細(xì)胞保護(hù)，但這一過程也通過其與細(xì)胞凋亡和壞死的交織關(guān)系與細(xì)胞死亡有關(guān)[84]。一些研究表明過度降解細(xì)胞成分促成了一種細(xì)胞死亡形式，通常稱為II型程序性細(xì)胞死亡或自噬性細(xì)胞死亡（ACD），其特征是細(xì)胞質(zhì)部分的大規(guī)模隔離，使細(xì)胞具有特征性的空泡狀外觀。ACD也以不依賴于半胱天冬酶的方式發(fā)生，沒有凋亡形態(tài)的關(guān)鍵特征，例如染色質(zhì)濃縮和核碎片[85-86]。然而，自噬和細(xì)胞凋亡有幾個共同的調(diào)節(jié)元件，這表明自噬在細(xì)胞存活和細(xì)胞死亡中具有雙重作用[87]。

5 小結(jié)與展望

自發(fā)現(xiàn)第一個酵母ATG基因以來，在了解自噬生物學(xué)及其與生物體健康和疾病的相關(guān)性方面取得了快速進(jìn)展[88]。重要的是，自噬調(diào)節(jié)可能是適用于多種疾病的治療策略。然而，對自噬蛋白在免疫相關(guān)過程中多種功能的分子機(jī)制的理解仍然相當(dāng)原始，當(dāng)前的蛋白質(zhì)組學(xué)和基因組篩選有可能改變自噬和免疫研究。這種轉(zhuǎn)變將包括通過使用現(xiàn)代系統(tǒng)生物學(xué)工具來廣泛地了解自噬蛋白-蛋白相互作用和信號調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，從而促進(jìn)對現(xiàn)有已知自噬免疫功能分子機(jī)制的更深入理解。也許更令人興奮的是，這種轉(zhuǎn)變可能會揭示這種古老的自衛(wèi)機(jī)制在免疫方面發(fā)揮作用的新方法[89]。

近年來，關(guān)于經(jīng)濟(jì)動物自噬的研究數(shù)量顯著增多，支持動物生產(chǎn)的生理功能（繁殖、生長、免疫系統(tǒng)和肌肉組織成熟）已被證明受自噬的調(diào)節(jié)[90]。然而，在農(nóng)業(yè)面臨日益嚴(yán)峻的社會和環(huán)境挑戰(zhàn)背景下，仍然需要做很多工作來了解自噬在畜禽養(yǎng)殖中的作用，以及如何應(yīng)用所獲得的知識來改善動物的發(fā)育、生長和健康，以及它們的產(chǎn)品質(zhì)量。例如，雖然現(xiàn)在在豬、牛、鴨或雞中明確確定了許多病原微生物使用自噬體機(jī)制進(jìn)行傳播，但缺乏有關(guān)機(jī)制的精確數(shù)據(jù)，阻礙了有效免疫策略的定義[90-92]。同樣，更好地了解自噬對這些物種對環(huán)境、營養(yǎng)或氧化應(yīng)激反應(yīng)的機(jī)制，將有助于定義應(yīng)對生態(tài)農(nóng)業(yè)綠色循環(huán)發(fā)展的科研策略。