葉面噴施褪黑素對(duì)海南高溫季節(jié)水培葉用萵苣生長(zhǎng)生理的影響

王博偉 陳艷麗 朱國(guó)鵬 楊雨 劉金偉 周鐸航

（海南大學(xué)園藝學(xué)院，海南省熱帶園藝作物品質(zhì)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南?？?570228）

葉用萵苣（Lactuca sativaL.）也稱生菜，原產(chǎn)于地中海沿岸，喜涼不耐熱（火國(guó)濤 等，2020），最適生長(zhǎng)溫度11～18 ℃。海南省位于熱帶地區(qū)，最高氣溫可達(dá)40 ℃以上，高溫環(huán)境易造成葉用萵苣抽薹，導(dǎo)致商品性降低（Mulabagal et al.，2010）。高溫脅迫嚴(yán)重影響植物細(xì)胞膜抗氧化酶系統(tǒng)和滲透調(diào)節(jié)體系的正常運(yùn)轉(zhuǎn)，細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）產(chǎn)生與清除平衡被打破（Kanazawa et al.，2000），產(chǎn)生過量自由基、膜脂過氧化，細(xì)胞膜透性改變，致使細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)外滲，從而對(duì)植株造成傷害（王濤 等，2013）。

褪黑素屬于吲哚類小分子物質(zhì)，即使不與受體結(jié)合也同樣具有生理活性。褪黑素在植物體內(nèi)廣泛存在，微摩爾濃度的褪黑素能促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育，與IAA 作用相似（Hernández-Ruiz et al.，2004）。褪黑素還能影響參與抗逆反應(yīng)的相關(guān)基因表達(dá)，對(duì)提高作物產(chǎn)量和抗逆性具有重要意義（Arnao &Hernández-Ruiz，2014）。作為一種新型有效的抗氧化劑，褪黑素能直接降低機(jī)體中活性氧和活性氮（RNS）的含量（徐向東 等，2010a；Tan et al.，2013），提高植株對(duì)脅迫的抗性。研究表明，外源施加適宜濃度褪黑素可緩解黃瓜硝酸鹽脅迫傷害（王偉香 等，2016）；促進(jìn)缺鈣環(huán)境中番茄對(duì)鈣的有效利用，減少缺鈣脅迫對(duì)細(xì)胞膜的傷害（李曉彤等，2019）。在高溫脅迫下，外源褪黑素預(yù)處理可減輕甘藍(lán)幼苗受到的傷害，并產(chǎn)生一定的高溫耐受性（曾慶棟 等，2017）。外源噴施50～100 μmol·L-1褪黑素能增加黃瓜抗壞血酸（AsA）和谷胱甘肽（GSH）的含量，抑制活性氧的生成，從而保證細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，提高黃瓜抗高溫能力（徐向東 等，2010b）。因此，葉面噴施適宜濃度的褪黑素對(duì)作物生長(zhǎng)生理以及提高產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要意義。

目前，關(guān)于褪黑素緩解植物鹽漬（Liang et al.，2015；Li et al.，2019；Zhan et al.，2019；Bahcesular et al.，2020）、干 旱（Wang et al.，2017；Li et al.，2018a）、低 溫（Li et al.，2018b；Wang et al.，2020）、高溫（Jia et al.，2020）、重金屬（Ahammed et al.，2020）等脅迫的研究較多，但對(duì)高溫季節(jié)水培葉用萵苣生長(zhǎng)生理的影響鮮見報(bào)道。本試驗(yàn)采用葉面噴施的方式進(jìn)行褪黑素預(yù)處理，研究褪黑素對(duì)高溫季節(jié)水培葉用萵苣生長(zhǎng)、生理指標(biāo)的影響，篩選適宜的褪黑素噴施濃度，以期為海南及熱帶地區(qū)高溫季節(jié)水培葉用萵苣高效生產(chǎn)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試葉用萵苣品種為辛普森精英散葉生菜，購(gòu)自圣尼斯種子（中國(guó)）有限公司；褪黑素購(gòu)自Solarbio 公司；營(yíng)養(yǎng)液采用1/2 濃度的日本園試配方營(yíng)養(yǎng)液。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)于2020 年10—12 月在海南大學(xué)園藝學(xué)院設(shè)施蔬菜生理實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。葉用萵苣種子用0.2%KNO3溶液常溫浸種8 h（陳艷麗 等，2014），置于光照培養(yǎng)箱中17 ℃條件下催芽，種子露白后播于水培育苗盤。幼苗三葉一心時(shí)，選擇生長(zhǎng)勢(shì)一致的健壯幼苗定植于營(yíng)養(yǎng)液槽中，使用充氧泵進(jìn)行人工充氧，每隔3 d測(cè)1次營(yíng)養(yǎng)液pH值并調(diào)節(jié)至6.0左右。

緩苗后葉面噴施褪黑素，設(shè)置4 個(gè)濃度水平，分別為25、50、75、100 μmol·L-1，以清水為對(duì)照；每天下午18：00 均勻噴施褪黑素或清水，以幼苗葉片全部濕潤(rùn)為宜，連續(xù)處理15 d；每處理3 次重復(fù)，每重復(fù)20 株。處理期間環(huán)境條件為：溫度25℃/15 ℃（晝/夜，下同），相對(duì)濕度80%，光照強(qiáng)度300 μmol·m-2·s-1，光周期12 h。褪黑素預(yù)處理后進(jìn)行高溫脅迫，參考海口市8—10 月氣象資料，設(shè)置高溫條件為35 ℃/25 ℃。于高溫脅迫0、4 d時(shí)，每處理隨機(jī)選取5 株，切取離根尖約1 cm 處根樣測(cè)定根系活力，然后分別采集生長(zhǎng)點(diǎn)下第3 片葉測(cè)定生理指標(biāo)。高溫脅迫4 d 時(shí)，每處理隨機(jī)選取5 株，測(cè)定植株生長(zhǎng)指標(biāo)和葉色值。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

葉片數(shù)指植株展開葉片的數(shù)量；最大葉長(zhǎng)和最大葉寬使用直尺測(cè)量，葉長(zhǎng)為葉基部至頂端的長(zhǎng)度，葉寬為葉片最寬處的寬度；地上部和地下部鮮質(zhì)量使用電子天平稱量。葉色值采用SPAD-502儀器測(cè)定；相對(duì)電導(dǎo)率、根系活力、過氧化氫酶（CAT）活性、過氧化物酶（POD）活性、超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量的測(cè)定均參照劉婭（2018）的方法；游離脯氨酸（Pro）含量采用酸性茚三酮比色法測(cè)定（李合生，2000）；可溶性蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定（李合生，2000）；可溶性糖含量采用蒽酮比色法測(cè)定（王學(xué)奎，2006）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使 用Microsoft Excel 2019、SPSS Statistics 25（Duncan 法）軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析、差異顯著性檢驗(yàn)，利用GraphPad Prism 8 軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 褪黑素對(duì)高溫脅迫下葉用萵苣生長(zhǎng)指標(biāo)的影響

高溫水培環(huán)境下，不同濃度褪黑素預(yù)處理對(duì)葉用萵苣生長(zhǎng)指標(biāo)的影響較大（表1）。隨著褪黑素濃度的增加，葉片數(shù)差異不顯著，而最大葉長(zhǎng)、最大葉寬、地上部和地下部鮮質(zhì)量整體上表現(xiàn)為先顯著上升后顯著下降的變化趨勢(shì)。褪黑素濃度為25、50、75、100 μmol·L-1處理的地上部鮮質(zhì)量均顯著高于對(duì)照，分別為對(duì)照的1.46、2.18、2.12、1.73倍，其中50 μmol·L-1處理褪黑素處理效果最優(yōu)，且該濃度處理下最大葉長(zhǎng)、最大葉寬和地下部鮮質(zhì)量亦效果最佳，均顯著高于對(duì)照，分別比對(duì)照提高23.07%、30.28%和88.16%。

表1 不同濃度褪黑素預(yù)處理對(duì)高溫脅迫下葉用萵苣生長(zhǎng)指標(biāo)的影響

2.2 褪黑素對(duì)高溫脅迫下葉用萵苣葉片中抗氧化酶活性的影響

由表2 可知，高溫脅迫前（0 d）與脅迫后（4 d）各處理的葉用萵苣葉片抗氧化酶活性大多隨褪黑素濃度的增加呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢(shì)；與脅迫前相比，高溫脅迫后各處理的CAT、POD、SOD 活性均有不同程度地增加。其中，50 μmol·L-1褪黑素處理的CAT、POD、SOD 活性最高，均顯著高于對(duì)照，脅迫前分別是對(duì)照的1.31、1.94、1.17倍，脅迫后分別是對(duì)照的1.39、1.27、1.18 倍。

2.3 褪黑素對(duì)高溫脅迫下葉用萵苣葉片相對(duì)電導(dǎo)率和MDA 含量的影響

由圖1 可知，高溫脅迫前（0 d）各處理葉用萵苣葉片的相對(duì)電導(dǎo)率均顯著低于對(duì)照，而MDA含量除100 μmol·L-1褪黑素處理外其他處理均與對(duì)照差異不顯著。高溫脅迫后（4 d），各處理的相對(duì)電導(dǎo)率和MDA 含量較脅迫前都有不同程度的提高；兩者的變化趨勢(shì)大致相同，均隨褪黑素濃度的增加表現(xiàn)為先下降后上升的趨勢(shì)，但各處理均顯著低于對(duì)照，且50 μmol·L-1褪黑素處理的相對(duì)電導(dǎo)率和MDA 含量均顯著低于其他處理。

圖1 不同濃度褪黑素預(yù)處理對(duì)高溫脅迫下葉用萵苣葉片相對(duì)電導(dǎo)率和MDA 含量的影響

2.4 褪黑素對(duì)高溫脅迫下葉用萵苣葉片中滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

由表3 可知，高溫脅迫前（0 d），隨著褪黑素濃度的增加各處理葉用萵苣葉片可溶性蛋白質(zhì)含量呈先上升后下降的變化趨勢(shì)，50、75、100 μmol·L-1處理均顯著高于對(duì)照，分別比對(duì)照提高39.53%、30.01%、22.41%；而可溶性糖含量和Pro 含量未見明顯規(guī)律。與脅迫前相比，高溫脅迫后（4 d）各處理的葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量均有一定程度的增加，且隨著褪黑素濃度的增加葉片可溶性蛋白質(zhì)、可溶性糖、Pro 含量均表現(xiàn)為先上升后下降的變化趨勢(shì)，其中50 μmol·L-1處理的可溶性蛋白質(zhì)、可溶性糖、Pro 含量最高，均顯著高于對(duì)照，分別為對(duì)照的1.19、1.50、2.61 倍。

表3 不同濃度褪黑素預(yù)處理對(duì)高溫脅迫下葉用萵苣葉片中滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

2.5 褪黑素對(duì)高溫脅迫下葉用萵苣根系活力和葉色值的影響

由圖2 可知，高溫脅迫前（0 d），隨著褪黑素濃度的增加葉用萵苣根系活力呈先下降后上升的變化趨勢(shì)，且各處理的根系活力均低于對(duì)照，褪黑素濃度為50 μmol·L-1時(shí)根系活力最低，顯著低于對(duì)照。高溫脅迫后（4 d），各處理的根系活力均顯著高于對(duì)照，25、50、75、100 μmol·L-1褪黑素處理的根系活力分別是對(duì)照的2.04、2.56、2.32、1.71倍；并且隨褪黑素濃度的增加表現(xiàn)出先上升后下降的變化趨勢(shì)，其中50 μmol·L-1處理的根系活力顯著高于其他處理，效果最優(yōu)。理的葉色值最高，顯著高于其他處理；其次為50 μmol·L-1處理。

圖2 不同濃度褪黑素預(yù)處理對(duì)高溫脅迫下葉用萵苣根系活力的影響

3 討論

由圖3 可知，褪黑素各濃度處理的葉用萵苣葉色值均顯著高于對(duì)照，隨著褪黑素濃度的增加表現(xiàn)為先上升后下降的變化趨勢(shì)，其中75 μmol·L-1處理。

圖3 不同濃度褪黑素預(yù)處理對(duì)高溫脅迫下葉用萵苣葉色值的影響

高溫脅迫下，細(xì)胞膜抗氧化酶活性的變化反映了植物的耐熱脅迫能力。徐向東等（2010a）和吳雪霞等（2019）研究發(fā)現(xiàn)，外源褪黑素能顯著提高高溫脅迫下黃瓜、茄子幼苗的CAT、POD、SOD活性以及ROS 清除能力。本試驗(yàn)中，隨著葉面噴施褪黑素濃度的增加，高溫脅迫下葉用萵苣葉片中的抗氧化酶活性呈先上升后下降的變化趨勢(shì)，其中50 μmol·L-1褪黑素處理效果最顯著，抗氧化酶活性大幅度提高，表明褪黑素可通過增強(qiáng)葉用萵苣葉片中的抗氧化酶活性來緩解高溫脅迫下ROS 誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷，其可能的原因是由于褪黑素促進(jìn)了植物體內(nèi)相關(guān)保護(hù)酶的基因表達(dá)來提高酶活性，從而提高抗氧化能力。

細(xì)胞膜的穩(wěn)定性反映了植物的耐高溫能力。MDA 含量可衡量細(xì)胞膜質(zhì)過氧化的程度（Ding et al.，2017），而MDA 作為細(xì)胞膜脂過氧化反應(yīng)產(chǎn)物又會(huì)對(duì)生物膜造成嚴(yán)重傷害。本試驗(yàn)結(jié)果表明，高溫脅迫后各處理葉用萵苣葉片的相對(duì)電導(dǎo)率和MDA 含量均上升，其中50 μmol·L-1外源褪黑素處理的相對(duì)電導(dǎo)率和MDA 含量均顯著低于其他處理，說明施用適宜濃度的褪黑素能顯著降低高溫脅迫下葉用萵苣葉片MDA 含量，有效減輕高溫對(duì)細(xì)胞膜的損害，這與陳碧華等（2006）在甘藍(lán)幼苗上的研究結(jié)果一致。

滲透調(diào)節(jié)是一種植物抵御外界脅迫傷害，保障植株正常生長(zhǎng)的生理機(jī)能?？扇苄缘鞍踪|(zhì)、可溶性糖和Pro 是植物體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，可使植株受逆境脅迫時(shí)維持正常的細(xì)胞勢(shì)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，高溫脅迫導(dǎo)致葉用萵苣葉片可溶性蛋白質(zhì)、可溶性糖、Pro 含量升高，50 μmol·L-1外源褪黑素處理的葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量最高，說明施用褪黑素可以通過促進(jìn)葉用萵苣對(duì)可溶性蛋白質(zhì)、可溶性糖和Pro 的合成來維持細(xì)胞內(nèi)滲透勢(shì)，穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)環(huán)境以緩解脅迫帶來的傷害，這與吳雪霞等（2019）在茄子幼苗上的研究結(jié)果一致。

高溫脅迫下，植物的光合作用能力下降，葉綠素的降解速度加快，合成速度降低，同時(shí)高溫脅迫也會(huì)導(dǎo)致植株根系活力的降低。余雪娜等（2016）、曾慶棟等（2017）在茄子、甘藍(lán)幼苗上的研究表明，外源褪黑素能增強(qiáng)高溫脅迫下植株葉片光合色素的穩(wěn)定性，這與本試驗(yàn)結(jié)果一致。此外，高溫脅迫導(dǎo)致葉用萵苣根系活力降低，而外源施用褪黑素能顯著緩解根系活力的降低，說明褪黑素能在一定程度上緩解高溫對(duì)葉用萵苣根系造成的傷害，維持根系正常生理代謝的活力。

高溫脅迫下，植株生長(zhǎng)受到不同程度的影響，表現(xiàn)為形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變（張永平 等，2012），生物量的變化是植物對(duì)脅迫的綜合反應(yīng)，也是評(píng)估抗逆性的重要指標(biāo)（劉領(lǐng) 等，2019）。本試驗(yàn)中，葉面噴施褪黑素顯著提高了葉用萵苣地上部和地下部鮮質(zhì)量，其中50、75 μmol·L-1處理的最大葉長(zhǎng)、最大葉寬、地上部和地下部鮮質(zhì)量均顯著高于對(duì)照，以50 μmol·L-1處理的效果更優(yōu)。表明微摩爾濃度的褪黑素即可在一定程度上減輕不良環(huán)境對(duì)葉用萵苣的傷害，從而促進(jìn)葉用萵苣在高溫脅迫下的生長(zhǎng)發(fā)育。

4 結(jié)論

高溫水培環(huán)境下，葉面噴施褪黑素可以提高葉用萵苣葉片中抗氧化酶活性和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量，有效減輕高溫對(duì)細(xì)胞質(zhì)膜的傷害，增強(qiáng)葉用萵苣對(duì)高溫脅迫的耐受性，維持植株的正常生長(zhǎng)，進(jìn)而提高產(chǎn)量。在本試驗(yàn)條件下，褪黑素濃度為50 μmol·L-1的處理效果最好，可用于海南高溫季節(jié)水培葉用萵苣生產(chǎn)。