乳腺癌中垂體瘤轉(zhuǎn)化基因1對(duì)免疫浸潤的影響及其預(yù)后價(jià)值

曾寶輝，過新民，郭順華

（廣州市紅十字會(huì)醫(yī)院/暨南大學(xué)附屬廣州紅十字會(huì)醫(yī)院 超聲科，廣東 廣州 510220）

乳腺癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率最高的女性惡性腫瘤。根據(jù)2018 年的全球癌癥數(shù)據(jù)[1]統(tǒng)計(jì)，乳腺癌新發(fā)病例占全部女性惡性腫瘤的25%。隨著乳腺癌的診治水平的不斷提高，乳腺癌患者的預(yù)后有了極大改善。但是，絕大部分乳腺癌患者仍不可能避免地出現(xiàn)轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，導(dǎo)致乳腺癌仍然是女性癌癥相關(guān)死亡的第二大癌種[2]。目前乳腺癌研究領(lǐng)域正致力于開發(fā)新的分子標(biāo)記物和治療靶點(diǎn)，以進(jìn)一步提高乳腺癌的診治效果[3]。開發(fā)新的分子標(biāo)記物對(duì)于乳腺癌的早期診斷、藥物反應(yīng)預(yù)測(cè)和復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)估都有很大的幫助，同時(shí)為乳腺癌的精準(zhǔn)治療提供新的工具[4-6]。

垂體瘤轉(zhuǎn)化基因1（pituitary tumor transforming gene 1，PTTG1）是一種癌基因，參與調(diào)控細(xì)胞周期和姐妹染色單體的分離。PTTG1 在多種腫瘤中高表達(dá)，且其產(chǎn)物具有體外轉(zhuǎn)化活性和體內(nèi)致瘤的活性，提示PTTG1 可能在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[7]。既往研究[8]發(fā)現(xiàn)高表達(dá)的PTTG1 與更強(qiáng)的腫瘤侵襲性及腫瘤血管生成密切相關(guān)。PTTG1可以通過與多種蛋白相互作用參與調(diào)控細(xì)胞轉(zhuǎn)錄過程，與細(xì)胞周期、代謝控制和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等密切相關(guān)[9]。越來越多的證據(jù)[7-9]表明，PTTG1 可作為癌癥侵襲轉(zhuǎn)移的生物標(biāo)志物。但乳腺癌中PTTG1的表達(dá)水平及其與患者預(yù)后的關(guān)系并不清楚，同時(shí)PTTG1 與乳腺癌免疫浸潤是否有關(guān)系也是未知。

本研究通過公共數(shù)據(jù)庫（包括Oncomine 在線網(wǎng)站、Coexpedia 數(shù)據(jù)庫和TIMER 數(shù)據(jù)庫）評(píng)估乳腺癌組織中PTTG1 mRNA 水平與乳腺癌患者預(yù)后之間的關(guān)系，進(jìn)一步探討PTTG1 mRNA 水平與乳腺癌患者的臨床病理特征以及腫瘤免疫細(xì)胞浸潤的關(guān)系，揭示PTTG1 在乳腺癌中的表達(dá)情況及其作用，為乳腺癌診斷和治療提供潛在的新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 PTTG在乳腺癌中的表達(dá)水平及其與生存預(yù)后的關(guān)系

筆者利用Oncomine 4.5 數(shù)據(jù)庫中Curtis Breast、Richardson Breast 和Zhao Breast 等[10-12]乳腺癌測(cè)序數(shù)據(jù)，分析乳腺癌組織與癌旁正常乳腺組織中PTTG1的mRNA 表達(dá)和DNA 拷貝數(shù)[13]。隨后，利用Kaplan-Meier Plotter（https://kmplot.com）在線分析平臺(tái)對(duì)Kaplan-Meier Plotter 數(shù)據(jù)庫中1 402 例乳腺癌患者進(jìn)行預(yù)后分析[14-15]，明確PTTG1 的表達(dá)水平與患者總生存率的關(guān)系。最后，使用UALCAN 在線數(shù)據(jù)分析工具（http://ualcan.path.uab.edu）分析TCGA 數(shù)據(jù)庫中1 097 例乳腺癌患者的PTTG1 表達(dá)水平與患者臨床病理特征的關(guān)系。

1.2 Coexpedia分析

Coexpedia（http：//www.coexpedia.org/）數(shù)據(jù)庫是從GEO 中多個(gè)人類和小鼠數(shù)據(jù)集整合構(gòu)建的基因共表達(dá)數(shù)據(jù)庫[16]。利用Coexpedia 分析在乳腺癌中與PTTG1 表達(dá)顯著相關(guān)的基因，并選取排名前50 的基因做后續(xù)分析。

1.3 富集分析

使用R 語言中的clusterProfiler 包將PTTG1 共表達(dá)的前50 基因進(jìn)行GO 和KEGG 通路富集分析[17]。

1.4 腫瘤免疫細(xì)胞浸潤相關(guān)性分析

通過TIMER 數(shù)據(jù)庫（https://cistrome.shinyapps.io/timer）分析PTTG1 的表達(dá)水平及其與6 種免疫細(xì)胞（CD4+Th1 細(xì)胞、CD4+Th2 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞、B 細(xì)胞和中性粒細(xì)胞）浸潤水平的相關(guān)性。

1.5 microRNA預(yù)測(cè)

使用R 語言包“multiMiR”預(yù)測(cè)PTTG1 以及其共表達(dá)基因相互作用的microRNA[18]，并使用Cytoscape 3.6.0 構(gòu)建microRNA-mRNA 可視化網(wǎng)絡(luò)[19]。

2 結(jié) 果

2.1 PTTG1 在乳腺癌組織中高表達(dá)且與患者不良預(yù)后相關(guān)

對(duì)來自TCGA 數(shù)據(jù)庫的多個(gè)乳腺癌研究中PTTG1 的mRNA 和DNA 拷貝數(shù)水平進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)顯示，在乳腺癌組織中，PTTG1 的mRNA 表達(dá)和DNA 拷貝數(shù)變異（CNV）顯著高于正常乳腺組織（P<0.05）（圖1A-E）。對(duì)Kaplan-Meier Plotter 數(shù)據(jù)庫中1 402 例乳腺癌患者進(jìn)行預(yù)后分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乳腺癌中PTTG1 mRNA 高表達(dá)患者的總生存率顯著低于低表達(dá)的患者（P<0.001）（圖1F）。隨后，TCGA數(shù)據(jù)庫中篩選出1 097 例乳腺癌患者，根據(jù)患者的臨床分期、種族、年齡、TP53 狀態(tài)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等情況進(jìn)行分組分析。結(jié)果顯示，各個(gè)分組中乳腺癌的PTTG1 表達(dá)均高于正常乳腺組織（圖2）。這些結(jié)果提示PTTG1 的表達(dá)水平可以作為乳腺癌潛在的診斷和預(yù)后標(biāo)記物。

圖1 乳腺癌中PTTG1 mRNA 的表達(dá)水平及其與患者生存率的關(guān)系 A-D：在Curtis Breast、Richardson Breast、TCGA Breast和Zhao Breast數(shù)據(jù)集中乳腺腫瘤組織和正常乳腺組織之間PTTG1 mRNA表達(dá)水平的差異；E：TCGA數(shù)據(jù)集中乳腺腫瘤組織和正常乳腺組織之間PTTG1 DNA拷貝數(shù)的差異；F：Kaplan-Meier生存曲線分析PTTG1表達(dá)高低對(duì)總生存率的影響（n=1 402）Figure 1 The expression level of PTTG1 mRNA in breast cancer tissues and its relationship with survival rate of patients A-D: The differences of PTTG1 mRNA expression levels between breast tumor tissues and normal breast tissues in the Curtis Breast,Richardson Breast,TCGA Breast and Zhao Breast datasets;E: The difference in PTTG1 DNA copy number between breast tumor tissues and normal breast tissues in the TCGA dataset;F: Analysis the influence of PTTG1 expression level on overall survival rate with Kaplan-Meier survival curve (n=1 402)

圖2 PTTG1的表達(dá)與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系 A：PTTG1在不同臨床分期乳腺癌組織中的相對(duì)表達(dá)水平；B：PTTG1在不同種族乳腺癌患者中的相對(duì)表達(dá)水平；C：PTTG1在不同年齡段乳腺癌患者中的相對(duì)表達(dá)水平；D：PTTG1在不同TP53狀態(tài)的乳腺癌患者中的相對(duì)表達(dá)水平；E：PTTG1在不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)乳腺癌患者中的相對(duì)表達(dá)水平；F：正常乳腺組織標(biāo)本和乳腺癌組織標(biāo)本中PTTG1 mRNA表達(dá)水平的箱線圖Figure 2 Correlation between PTTG1 expression and clinicopathologic features in breast cancer A: The relative expression level of PTTG1 in breast cancer tissues with different clinical stages;B: The relative expression level of PTTG1 in breast cancer patients with different races;C: The relative expression levels of PTTG1 in breast cancer patients with different ages;D: The relative expression level of PTTG1 in breast cancer patients with different TP53 status;E: The relative expression level of PTTG1 in breast cancer patients with different status of lymph node metastasis;F: Boxplots of PTTG1 mRNA expression levels in normal and breast cancer tissues

2.2 乳腺癌中PTTG1 的共表達(dá)基因及其相互作用網(wǎng)絡(luò)

為了分析乳腺癌中PTTG1 的共表達(dá)基因及其相互作用網(wǎng)絡(luò)，本研究利用Coexpedia 分析PTTG1的共表達(dá)基因（圖3）。結(jié)果顯示，共有182 個(gè)與PTTG1 共表達(dá)的基因，提示PTTG1 可能具有廣泛的調(diào)控作用。篩選出其中排名前50 的基因進(jìn)行后續(xù)分析。基因富集分析顯示，這些基因編碼的蛋白質(zhì)主要定位于紡錘體、染色體以及著絲粒。這些蛋白主要功能是與微管蛋白結(jié)合，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶的活性，并參與細(xì)胞核的分裂、細(xì)胞器分離和染色體分離（圖4A-C）。KEGG 通路分析的結(jié)果顯示，這些蛋白主要在細(xì)胞周期調(diào)控、減數(shù)分裂、HTLV-1 感染中發(fā)揮作用（圖4D-E）。

圖3 PTTG1的共表達(dá)基因網(wǎng)絡(luò)（PTTG1用紅色圓圈標(biāo)識(shí)，共表達(dá)基因用綠色圓圈標(biāo)注）Figure 3 Co-expression gene network of PTTG1 (PTTG1 marked by red circles,and the co-expressed genes marked by green circles)

圖4 乳腺癌中PTTG1共表達(dá)基因的GO和KEGG通路富集分析 A：PTTG1及其共表達(dá)基因的分子功能作用；B：PTTG1及其共表達(dá)基因在細(xì)胞成分中的作用；C：PTTG1及其共表達(dá)基因所參與的生物學(xué)過程；D：PTTG1及其共表達(dá)基因的KEGG相關(guān)通路；E：細(xì)胞周期通路網(wǎng)絡(luò)（共表達(dá)基因在此通路中所在的位置以紅色標(biāo)注）Figure 4 Enrichment analysis of GO and KEGG pathways of PTTG1 co-expressed genes in breast cancer A: Molecular functional roles of PTTG1 and its co-expressed genes;B: The role of PTTG1 and its co-expressed genes in cell components;C: Biological processes involved in PTTG1 and its co-expressed genes;D: KEGG related pathways of PTTG1 and its co-expressed genes;E: Network of cell cycle pathway (the locations of co-expressed genes in this pathway indicated in red)

利用clusterProfiler 的R 語言包對(duì)共表達(dá)基因以及富集通路進(jìn)行可視化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PTTG1 相關(guān)的基因主要通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期發(fā)揮作用。其中MAD2L1、CDC20、CCNB2、CCNA2、BUB1、ESPL1、CDK1 和CCNB1 在PTTG1 調(diào)節(jié)細(xì)胞周期中發(fā)揮著重要的作用（圖5A）。PTTG1 共表達(dá)基因參與多個(gè)通路的調(diào)節(jié)，可能通過這些通路參與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展（圖5B）。

圖5 乳腺癌中PTTG1共表達(dá)基因和通路的可視化網(wǎng)絡(luò) A：PTTG1共表達(dá)基因可視化網(wǎng)絡(luò)；B：共表達(dá)基因的KEGG通路富集可視化網(wǎng)絡(luò)Figure 5 Visual network of PTTG1 co-expressed genes and pathways in breast cancer A: Visual network of PTTG1 coexpressed genes;B: Visual network of KEGG pathway enrichment in co-expressed genes

2.3 PTTG1 的表達(dá)與浸潤性免疫細(xì)胞的浸潤水平相關(guān)性分析

TIMER 數(shù)據(jù)庫分析顯示PTTG1 的表達(dá)與6 種免疫細(xì)胞（CD4+Th1 細(xì)胞，CD4+Th2 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞、B 細(xì)胞和中性粒細(xì)胞）之間密切相關(guān)（圖6）。PTTG1 表達(dá)水平與CD4+Th1 細(xì)胞（r=0.490，P=3.52e-61）、CD4+Th2 細(xì)胞（r=0.765，P=3.7e-192）、巨噬細(xì)胞（r=0.308，P=2.8e-23）、B 細(xì)胞（r=0.228，P=3.69e-13）和中性粒細(xì)胞（r=0.121，P=1.27e-04）的浸潤水平呈正相關(guān)，與CD8+T 細(xì)胞浸潤水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.198，P=3.16e-10）。

圖6 PTTG1表達(dá)水平與浸潤性免疫細(xì)胞浸潤水平的關(guān)系 A-F：PTTG1的表達(dá)與CD4+ Th1細(xì)胞、CD4+ Th2細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、CD8+ T細(xì)胞、B細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤水平呈正相關(guān)，與CD8+ T細(xì)胞浸潤程度呈負(fù)相關(guān)Figure 6 Relationship between the expression level of PTTG1 and the infiltration level of infiltrating immune cells A-F:The expression of PTTG1 positively correlated with the infiltration levels of CD4+ Th1 cells,CD4+ Th2 cells,macrophages,CD8+ T cells,B cells and neutrophils,and negatively correlated with the infiltration degree of CD8+ T cells

2.4 乳腺癌中PTTG1 和共表達(dá)基因的相互作用網(wǎng)絡(luò)

為進(jìn)一步探討PTTG1 在乳腺癌中的作用機(jī)制，本研究利用multiMiR R 語言數(shù)據(jù)包分析了與PTTG1以及其共表達(dá)基因相互作用的microRNA。其中，與PTTG1 相互作用的microRNA 有30 個(gè)，與PTTG1共表達(dá)的排名前50 基因相互作用的microRNA 有5 130 個(gè)，共同靶向PTTG1 及其共表達(dá)基因的microRNA 共有17 個(gè)。使用Cytoscape 軟件對(duì)microRNA-基因網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化，結(jié)果提示PTTG1可能由microRNA 以ceRNA 的機(jī)制調(diào)控（圖7）。

圖7 PTTG1-microRNA-共表達(dá)基因可視化網(wǎng)絡(luò)Figure 7 Visualization network of PTTG1-microRNA-Coexpression genes

3 討 論

早期診斷和預(yù)后評(píng)價(jià)是癌癥管理中極其關(guān)鍵且富有挑戰(zhàn)性的環(huán)節(jié)。乳腺癌異質(zhì)性極大，需要應(yīng)用多種生物標(biāo)記物的協(xié)同分析，以實(shí)現(xiàn)乳腺癌的早期診斷和預(yù)后精準(zhǔn)預(yù)測(cè)[20]。因此，當(dāng)前迫切需要發(fā)現(xiàn)更多的乳腺癌生物標(biāo)記物，從而實(shí)現(xiàn)乳腺癌早診早治和預(yù)后評(píng)價(jià)[21-22]。

PTTG1 在多種惡性腫瘤中高表達(dá)，被認(rèn)為是一種致癌基因，它的高表達(dá)對(duì)腫瘤的生長和發(fā)展具有促進(jìn)作用并與多種癌癥的不良預(yù)后有關(guān)[23-27]。PTTG1 mRNA 在腸癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)，是腸癌預(yù)后的一個(gè)獨(dú)立的危險(xiǎn)因素[23]。在非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）中，Li 等[24]發(fā)現(xiàn)PTTG1 在NSCLC 的侵襲、轉(zhuǎn)移中具有重要作用，通過siRNA 敲低PTTG1 表達(dá)可抑制NSCLC 細(xì)胞的侵襲。應(yīng)用siRNA 干擾PTTG1 的表達(dá)后，口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的侵襲能力顯著降低。而microRNA-186 和microRNA-655 可抑制PTTG1 在口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的侵襲活性[8]。Cui 等[25]發(fā)現(xiàn)敲低PTTG1 可顯著抑制膠質(zhì)母細(xì)瘤的血管生成，抑制細(xì)胞的遷移和侵襲，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。Fraune 等[26]通過對(duì)12 427 例前列腺癌樣本進(jìn)行免疫組化檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PPTG 可單獨(dú)或與其他生物標(biāo)志物聯(lián)合使用能較好地評(píng)估前列腺癌的侵襲性。Grzechowiak 等[27]證實(shí)了PTTG1 在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中的具有顯著的促癌作用。這些研究表明PPTG1 是潛在的腫瘤診斷標(biāo)記物和治療靶點(diǎn)。本研究通過對(duì)開放數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)PTTG1在乳腺癌組織中表達(dá)升高并與不良預(yù)后相關(guān)，提示PTTG1 可能在乳腺癌中發(fā)揮癌基因的作用，是乳腺癌潛在的診斷和預(yù)后標(biāo)志物。

本研究使用clusterProfiler 的R 語言分析PTTG1及其共表達(dá)基因的富集情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PTTG1 的功能主要富集在核分裂、細(xì)胞器分離和染色體分離上。KEGG 通路富集則提示，PTTG1 與乳腺癌的細(xì)胞周期、減數(shù)分裂、HTLV-1、p53 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是密切相關(guān)的。細(xì)胞周期失調(diào)是癌細(xì)胞惡性增殖的基礎(chǔ)，細(xì)胞周期紊亂可導(dǎo)致癌細(xì)胞快速增殖[28]。p53是一個(gè)重要的抑癌基因，p53 突變和喪失抑癌作用是腫瘤惡變的一個(gè)重要原因[29]。而本研究發(fā)現(xiàn)PTTG1 的表達(dá)與p53 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)密切相關(guān)。因此，筆者推測(cè)乳腺癌中PTTG1 高表達(dá)可能通過調(diào)控細(xì)胞周期和p53 信號(hào)通路而使得腫瘤增殖和侵襲能力增強(qiáng)，從而導(dǎo)致患者的不良預(yù)后。期待進(jìn)一步的研究來驗(yàn)證該假說。

大量研究[30-31]證實(shí)，腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞與腫瘤預(yù)后和對(duì)治療的反應(yīng)密切相關(guān)。PTTG1 表達(dá)與乳腺癌中多種抑制性免疫細(xì)胞浸潤水平呈正相關(guān)，同時(shí)與具有抗癌作用的CD8+T 細(xì)胞浸潤水平呈負(fù)相關(guān)，這可能是PTTG1 高表達(dá)造成患者預(yù)后不良的另一重要原因。本研究結(jié)果表明，PTTG1 參與調(diào)控乳腺癌的免疫微環(huán)境，推測(cè)PTTG1 的表達(dá)可能與免疫治療的療效相關(guān)，這值得后續(xù)進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究證實(shí)乳腺癌組織中PTTG1表達(dá)上調(diào)且其高表達(dá)與乳腺癌患者的不良預(yù)后相關(guān)。PTTG1 與乳腺癌的免疫浸潤密切相關(guān)，是乳腺癌潛在的診斷標(biāo)記物和治療靶點(diǎn)。但是，PTTG1 在乳腺癌中發(fā)揮作用的具體機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究加以闡明。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。