PD-1基因單核苷酸多態(tài)性與肝細(xì)胞癌臨床表型的相關(guān)性研究

陸小華 袁洪新▲ 蘇靚靚

1.南通大學(xué)附屬醫(yī)院介入放射科，江蘇南通 226001；2.南通大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)影像科，江蘇南通 226001

肝細(xì)胞癌是臨床常見惡性腫瘤，其病死率高居我國惡性腫瘤第二位。肝細(xì)胞癌的形成和進(jìn)展是由不同因素相互作用、多基因協(xié)同參與、多靶點多通路共同調(diào)控的復(fù)雜過程[1]。單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）是在基因組水平由單個核苷酸變異所引起的DNA 序列多態(tài)性。自發(fā)現(xiàn)至今，其已不僅作為預(yù)判疾病罹患風(fēng)險的重要依據(jù)，還有望成為預(yù)估療效及預(yù)后的生物標(biāo)志物[2]。目前其與肝細(xì)胞癌形成及轉(zhuǎn)歸存在關(guān)聯(lián)的報道較多[3-5]。對于腫瘤微環(huán)境的研究目前已成為熱點。免疫抑制機(jī)制在腫瘤形成發(fā)展的過程中占據(jù)主導(dǎo)地位，免疫T 細(xì)胞的耗竭是其中最重要的因素。研究表明，腫瘤T 細(xì)胞耗竭的重要標(biāo)志包括程序性死亡受體1（programmed cell death protein 1，PD-1）在內(nèi)的多種負(fù)性共刺激分子高表達(dá)，在T 細(xì)胞免疫反應(yīng)的負(fù)調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮重要作用[6]。通過開展體內(nèi)外基礎(chǔ)及臨床研究，開發(fā)相關(guān)藥物，阻斷這些分子的信號傳導(dǎo)通路，降低它們的表達(dá)水平，恢復(fù)T 細(xì)胞作為免疫屏障抵抗腫瘤的功能。其中，PD-1 是目前研究的熱門靶點，針對其設(shè)計的多種免疫藥物已應(yīng)用于臨床[7-9]。

已有多種惡性腫瘤易感性與PD-1 基因SNP存在關(guān)聯(lián)的報道[10-11]，但其與肝細(xì)胞癌臨床表型相關(guān)的報道不多。本研究選取PD-1 基因中最小等位基因頻率（minor allele frequency，MAF）>5%，文獻(xiàn)中較多涉及且可經(jīng)外周血標(biāo)本進(jìn)行基因分型的rs10204525 位點、rs2227982 位點、rs36084323 位點作為研究對象[12-13]，探究該基因SNP 與肝細(xì)胞癌臨床表型之間是否存在關(guān)聯(lián)性，以期為肝細(xì)胞癌個體化治療及預(yù)后判斷提供參考，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2021年1—12月南通大學(xué)附屬醫(yī)院介入放射科收治的新發(fā)肝細(xì)胞癌患者165 例，入組后進(jìn)行臨床相關(guān)資料收集及外周靜脈血標(biāo)本采集。納入標(biāo)準(zhǔn)：①首診初治的肝細(xì)胞癌患者；②體力狀況評分（PS）<3 分患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①非首診初治肝細(xì)胞癌患者；②體力狀況評分（PS）≥3 分患者。其中男120 例（72.73%），女45 例（27.27%）；年齡25～90 歲，平均（62.20±1.24）歲；BCLC A 期17 例（10.3%），B 期90 例（54.55%），C 期58 例（35.15%）；有門靜脈侵犯31 例（18.79%），無門靜脈侵犯134 例（81.21%）；有肝外轉(zhuǎn)移39 例（23.64%），無肝外轉(zhuǎn)移126 例（76.36%）。診斷標(biāo)準(zhǔn)參考《原發(fā)性肝癌診療指南（2022年版）》[14]，156 例滿足臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，另有9 例經(jīng)穿刺活檢滿足病理診斷標(biāo)準(zhǔn)。依據(jù)BCLC 分期標(biāo)準(zhǔn)加以分期。醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會對本研究資料收集和血標(biāo)本采集批準(zhǔn)認(rèn)可。

1.2 方法

1.2.1 主要儀器和試劑 混勻型干式恒溫器（TND03-H-H，Thermo Fisher 公司）；臺式離心機(jī)（Pico-21，Thermo Fisher 公司）；DNA 快速抽提試劑盒（上海生工公司）；漩渦混合器（GL-88B，其林貝爾儀器制造有限公司）；電泳槽（DYCZ-21，北京市六一儀器廠）；Synergy LX MULTI-Mode Microplate Reader（BioTek 公司）；HiSeq XTen 測序儀（Illumina 公司）。

1.2.2 位點分型 ①DNA 抽提：使用DNA 快速抽提試劑盒提取基因組DNA，凍存?zhèn)溆?；②位點分型：利用包括cutadapt 軟件、prinseq-lite 軟件、bwa軟件、annovar 軟件等在內(nèi)的panel 高通量數(shù)據(jù)分析技術(shù)進(jìn)行相關(guān)位點基因分型。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

本研究數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料用[n（%）] 表示，采用χ2檢驗比較各位點突變基因型與野生基因型在不同臨床表型中的頻數(shù)分布差異，各位點突變基因型與野生基因型在肝細(xì)胞癌不同臨床表型之間的關(guān)聯(lián)強度采用比值比（odds ratio，OR）及其95% 置信區(qū)間（confidence interval，CI）的形式表示，并對P值、OR值從性別、年齡等方面進(jìn)行校正。P< 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 rs36084323 SNP與肝細(xì)胞癌臨床表型的相關(guān)性分析

以該位點野生基因型CC 患者作為對照，雜合突變基因型CT 的患者分期偏晚的風(fēng)險降低（OR=0.306，95%CI：0.118～0.679，P< 0.05）；出現(xiàn)門靜脈侵犯的風(fēng)險降低（OR=0.239，95%CI：0.098～0.631，P< 0.05）；發(fā)生肝外轉(zhuǎn)移的風(fēng)險降低（OR=0.394，95%CI：0.165～0.833，P< 0.05）。純合突變基因型TT 患者與野生型CC 患者相比，在肝細(xì)胞癌BCLC 分期、門靜脈侵犯、肝外轉(zhuǎn)移等臨床表型之間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P> 0.05）。見表1。

表1 rs36084323 SNP與肝細(xì)胞癌臨床表型的相關(guān)性分析

2.2 rs10204525 SNP與肝細(xì)胞癌臨床表型的相關(guān)性分析

以該位點野生基因型CC 患者作為對照，攜帶雜合突變基因型CT、純合突變基因型TT 患者分別與野生基因型相比，在BCLC 分期、門靜脈侵犯、肝外轉(zhuǎn)移方面比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P> 0.05）。見表2。

2.3 rs2227982 SNP與肝細(xì)胞癌臨床表型的相關(guān)性分析

以該位點野生基因型GG 患者作為對照，攜帶雜合突變基因型AG、純合突變基因型AA 患者分別與野生基因型相比，在BCLC 分期、門靜脈侵犯、肝外轉(zhuǎn)移方面比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P> 0.05）。見表3。

3 討論

PD-1 屬于CD28 家族成員，是一種Ⅰ型跨膜糖蛋白，基因定位2q37.35，其在T 細(xì)胞、B 細(xì)胞、NK細(xì)胞、DC 細(xì)胞等多種細(xì)胞中表達(dá)。其可通過下調(diào)機(jī)體免疫系統(tǒng)的免疫應(yīng)答功能及抑制T 細(xì)胞活動調(diào)控免疫系統(tǒng)，從而對自身耐受起促進(jìn)作用。雖可預(yù)防機(jī)體免疫性疾病發(fā)生，但也阻礙免疫系統(tǒng)識別殺滅腫瘤細(xì)胞。程序性死亡配體-1（programmed deathligand-1，PD-L1）作為PD-1 的配體，多于腫瘤細(xì)胞表面存在。腫瘤細(xì)胞表面PD-L1 的胞外區(qū)與免疫T 細(xì)胞表面高表達(dá)的PD-1 相結(jié)合，通過PD-L1/PD1 通路抑制免疫T 細(xì)胞增殖，進(jìn)一步抑制抗腫瘤免疫應(yīng)答。另外，研究發(fā)現(xiàn)在腫瘤浸潤性T細(xì)胞（tumor infiltratinglymphocyte，TIL）中PD-1 處于高表達(dá)水平。持續(xù)存活的腫瘤細(xì)胞可抑制PD-1在TIL 中的活化，使腫瘤細(xì)胞得以逃避免疫監(jiān)視，同時能夠增強TIL 分泌免疫抑制類炎癥細(xì)胞因子，對腫瘤細(xì)胞的增殖、抗凋亡、遷移等生物學(xué)行為起促進(jìn)作用。目前針對PD-1 研發(fā)的藥物已廣泛應(yīng)用于腫瘤臨床治療中，明顯改善部分患者的生存期[15-16]。

目前針對PD-1 基因SNP 的研究主要集中在腫瘤的遺傳易感性方面，而臨床工作中制訂治療方案時需考慮不同的臨床表型。對肝細(xì)胞癌臨床表型與該基因SNP 的相關(guān)性研究，可為肝細(xì)胞癌個體化治療以及預(yù)后判斷提供參考，現(xiàn)實價值和應(yīng)用前景均較高。

本研究分析探討了PD-1 基因rs10204525、rs2227982、rs36084323 位點SNP 與肝細(xì)胞癌臨床表型之間的相關(guān)性。結(jié)果顯示，rs36084323 位點CT 基因型患者較野生基因型CC 患者BCLC 分期偏早、門脈侵犯/肝外轉(zhuǎn)移的風(fēng)險顯著減少（P< 0.05），提示攜帶該基因型的肝細(xì)胞癌患者發(fā)生腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的可能性相對較小，預(yù)后可能更好。rs10204525、rs2227982 位點SNP 與相關(guān)臨床表型之間無相關(guān)性（P> 0.05）。通過檢測PD-1 基因rs36084323 位點的不同基因型，可預(yù)判肝細(xì)胞癌的臨床表型，為個體化治療及判斷預(yù)后提供參照。本研究雖取得陽性結(jié)果，但非大樣本研究，且受到多種混雜因素的影響，選擇偏倚不可避免。另外，僅對關(guān)聯(lián)性表象進(jìn)行分析，尚未進(jìn)一步深入探究其中機(jī)制。在今后的臨床及科研工作中，將簡化檢測流程，擴(kuò)大樣本量，進(jìn)一步研究相關(guān)機(jī)制，并設(shè)法減少干擾因素，以期取得質(zhì)量更高、說服力更強的研究成果。

綜上所述，PD-1 基因SNP 與肝細(xì)胞癌臨床表型之間存在一定的相關(guān)性，檢測相關(guān)位點基因型對個體化治療及判斷預(yù)后具有一定的參考價值。