拐棗山楂果酒發(fā)酵工藝優(yōu)化及其抗氧化活性分析

王 娟，魏 貞，石明生，王彥平，湯高奇*

（河南農業(yè)職業(yè)學院 食品工程學院，河南 鄭州 451450）

拐棗（Hovenia acerba）為鼠李科枳椇屬植物，又名枳棋、萬壽果、雞爪連等，拐棗肉質果梗肥厚扭曲，紅褐色，香味濃郁，滋味甘甜[1]。拐棗不僅含有豐富的葡萄糖、果糖、氨基酸、維生素及人體必需的礦物質，還含有多糖、黃酮類等活性物質，具有健胃補血、增強免疫力、抗氧化、抗腫瘤、降血脂等營養(yǎng)保健功能[2-5]。山楂（Crataegus pinnatifido）為薔薇科山楂屬植物，又名山里紅、山里果、紅果等[6]。山楂果實不僅富含有機酸、氨基酸、維生素C、胡蘿卜素、礦物質等營養(yǎng)成分，還含有大量的黃酮類活性成分，具有抗氧化、降血脂、抗腫瘤、調節(jié)血壓等作用[7-10]。

近年來，隨著人民健康意識的提高，低醇度、富營養(yǎng)、具備保健功能的果酒類越來越受到消費者的青睞，研制生產低醇度果酒具有良好的市場前景。我國具有豐富的拐棗和山楂資源，且二者也可以藥食兩用，具有較高的保健作用和經濟價值。目前關于拐棗和山楂的開發(fā)主要集中在鮮食、果脯、果汁飲料[11-12]及果酒[13-15]加工上。近年來，復合果酒釀造工藝方面亦有較多成果，如紅棗山楂酒[16]、無花果山楂酒[17]和黑藜麥山楂酒[18]等，研究方向主要是果酒工藝的優(yōu)化、香氣化合物、總黃酮及抗氧化性的測定等。復合果酒通過將水果進行混合發(fā)酵，使不同原料間的營養(yǎng)物質、香氣、色澤及活性成分等相輔相成，制得口感好、風味佳、營養(yǎng)高的果酒，解決了果酒口感和風味單一的問題，提升了果酒品質。通過市場調研發(fā)現，目前市面上所售的拐棗酒和山楂酒大多為露酒，酒精度較高，將拐棗和山楂混合發(fā)酵制備果酒未有報道。該研究以拐棗和山楂為原料進行混合發(fā)酵，并對果酒的理化指標、微生物指標及抗氧化性進行研究，旨在豐富果酒的品種，為拐棗和山楂資源的開發(fā)利用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

拐棗：購于河南信陽；山楂：河南省農業(yè)高新科技園；白砂糖：云南滇鵬糖業(yè)有限公司；Lalvin 71B降酸酵母菌（3.2×108CFU/g）、果膠酶（30 000 U/mL）：法國拉曼德公司。

平板計數瓊脂（plate count agar，PCA）培養(yǎng)基、煌綠乳糖膽鹽肉湯（brilliant green lactose bile broth，BGLB）培養(yǎng)基、結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（violet red bile aga，VRBA）培養(yǎng)基：北京陸橋技術股份有限公司；蘆丁標準品（純度＞98%）：北京索萊寶科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical，DPPH）（純度為97%）：美國Sigma公司；無水乙醇、維生素C、過氧化氫、水楊酸、硫酸亞鐵（均為分析純）：天津富晨化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

FA1604電子分析天平：上海光學儀器一廠；206A破壁機：美的股份有限公司；VORTEX 21K高速冷凍離心機：湘儀離心機儀器有限公司；SPX-250B-ZⅡ生化培養(yǎng)箱、BJ-2CD超凈工作臺：上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；TU-1810紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；PHS-25 pH計：上海雷磁儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 拐棗山楂酒制備工藝與操作要點

原料選取→預處理→破碎→酶解→調配→接種→主發(fā)酵→過濾→后發(fā)酵→澄清→過濾→陳釀→成品

操作要點：

原料選取：選取形態(tài)飽滿、紅褐色、無霉變及病蟲害的新鮮拐棗；選取顏色鮮紅、無霉變及病蟲害的新鮮山楂。

預處理、破碎：拐棗和山楂清洗干凈，將山楂去籽后置于90 ℃熱水中熱燙5 min，冷卻后按照1∶3（g∶mL）的料水比分別將拐棗和山楂破碎打漿。

酶解：將拐棗漿和山楂漿混合后按質量比加入0.3%的果膠酶，然后在40 ℃條件下酶解4 h。酶解結束后，將其置于80 ℃水浴條件下滅酶15 min，冷卻后備用。

調配、接種、過濾、發(fā)酵：根據試驗設計向果漿中補加白砂糖，調節(jié)發(fā)酵液的初始糖度。然后按照0.03%的質量比加入偏重亞硫酸鉀進行殺菌。根據設定配方加入71B降酸酵母菌，攪拌均勻后進行恒溫酒精發(fā)酵。每天對發(fā)酵醪的酒精度和糖度進行測量，待其糖度和酒精度變化緩慢時停止發(fā)酵，過濾去渣，0～4 ℃環(huán)境下陳釀2個月，得到果酒成品。

1.3.2 單因素試驗

原料配比優(yōu)化：在初始糖度21°Bx，酵母接種量0.3 g/L，發(fā)酵時間7 d，發(fā)酵溫度22 ℃的條件下，分別設置拐棗漿和山楂漿質量比3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3進行發(fā)酵。發(fā)酵結束后，對果酒進行感官評定并測定糖度和酒精度。

初始糖度優(yōu)化：在拐棗漿和山楂漿質量比1∶1，酵母接種量0.3 g/L，發(fā)酵時間7 d，發(fā)酵溫度22 ℃的條件下，通過添加白砂糖分別調整初始糖度為17°Bx、19°Bx、21 °Bx、23°Bx、25°Bx進行發(fā)酵。發(fā)酵結束后，對果酒進行感官評定并測定糖度和酒精度。

酵母接種量優(yōu)化：在拐棗漿和山楂漿質量比1∶1，初始糖度21°Bx，發(fā)酵時間7 d，發(fā)酵溫度22 ℃的條件下，設置酵母接種量為0.1 g/L、0.2 g/L、0.3 g/L、0.4 g/L、0.5 g/L進行發(fā)酵。發(fā)酵結束后，對果酒進行感官評定并測定糖度和酒精度。

發(fā)酵時間優(yōu)化：在拐棗漿和山楂漿質量比1∶1，初始糖度21°Bx，酵母接種量0.3 g/L，發(fā)酵溫度22 ℃的條件下，設置發(fā)酵時間為4 d、5 d、6 d、7 d、8 d進行發(fā)酵。發(fā)酵結束后，對果酒進行感官評定并測定糖度和酒精度。

1.3.3 正交試驗

在單因素試驗的基礎上，設計4因素3水平正交試驗，考察拐棗漿和山楂漿質量比（A）、初始糖度（B）、酵母接種量（C）及發(fā)酵時間（D）對拐棗山楂果酒感官評分的影響，正交試驗因素水平設計見表1。

表1 拐棗山楂果酒發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for Hovenia acerba-hawthorn wine fermentation condition optimization

1.3.4 測定方法

（1）感官評價

參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》制定感官評分細則[20]。感官評定小組由10名經過培訓的人員組成，要求對拐棗山楂果酒的外觀、香氣、滋味和典型性進行評價，評分標準詳見表2，取平均值作為最終感官評分，滿分為100分。

表2 拐棗山楂果酒感官評分標準Table 2 Sensory evaluation standards of Hovenia acerba-hawthorn wine

續(xù)表

（2）理化和微生物指標的測定

參照NY/T 1508—2017《綠色食品 果酒》[19]，對果酒的酒精度、總酸、揮發(fā)酸、總糖[20]、菌落總數[21]及大腸菌群[22]分別進行測定；總黃酮含量的測定參照文獻[23-24]方法，采用紫外可見分光光度法。

（3）抗氧化性的測定

測定拐棗山楂果酒和對照果酒（市面上所售的拐棗露酒和山楂露酒，均為高度酒泡制制成）的體外抗氧化能力。參考文獻中的方法，測定并計算樣品和市售果酒的DPPH自由基清除能力[25]以及羥基自由基清除能力[26]，以維生素C作為陽性對照，對果酒進行體外抗氧化性分析。

1.3.5 數據分析

試驗數據采用SPSS 19.0和Excel 2013軟件進行分析，用Origin8.6制圖。所有試驗均平行測定3次，結果以“平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 原料配比的確定

原料配比對果酒品質的影響見圖1。由圖1可知，隨著山楂漿比例的增加，果酒的總糖呈現下降趨勢，酒精度和感官評分呈現先升高后降低的趨勢。新鮮拐棗含糖量基本是山楂的2倍，隨著其在原料比例中的減少，發(fā)酵醪的含糖量隨之減少，發(fā)酵結束時，果酒中總糖減少。拐棗加入量過大會掩蓋山楂風味，果酒顏色較淡，且略帶澀味。山楂加入量大則果酒顏色鮮亮，但酸度較高，酸甜比例失調。綜合考慮，選拐棗漿和山楂漿最佳質量比為1∶2。

圖1 原料配比對拐棗山楂果酒品質的影響Fig.1 Effect of raw material ratio on the quality of Hovenia acerbahawthorn wine

2.1.2 初始糖度的確定

不同初始糖度對果酒品質的影響見圖2。由圖2可知，果酒中總糖隨著初始糖度的增加而增加，酒精度和感官評分呈現先上升后下降的趨勢。當初始糖度為17°Bx時，經過酵母菌的轉化之后殘?zhí)橇枯^低，拐棗山楂果酒甜味不足，酸味明顯，口感不協調；當初始糖度為25°Bx時，含糖量較高影響酵母菌的發(fā)酵，導致酒精度下降，同時酒液穩(wěn)定性差，口感較甜膩。初始糖度為21°Bx時，所得果酒純凈有光澤，有明顯的拐棗和山楂果香，酸甜比協調，感官評分達到91分。綜合考慮，最佳初始糖度為21°Bx。

2.1.3 酵母接種量的確定

酵母接種量對果酒品質的影響見圖3。由圖3可知，隨著接種量的增加，拐棗山楂果酒的總糖呈現下降趨勢，酒精度和感官評分呈現先上升后下降的趨勢。當酵母接種量為0.1 g/L時，發(fā)酵醪中酵母菌數量少，發(fā)酵周期長，增加了有害微生物污染的風險，發(fā)酵后果酒香氣不明顯，有異味，口感不協調；增加酵母接種量可縮短發(fā)酵周期，但加入量過大則由于酵母菌自身生長繁殖需要消耗發(fā)酵醪中大量糖分，最終會影響果酒的整體協調性，酒香不夠自然；當酵母接種量為0.3 g/L時，果酒酸甜協調，有明顯的拐棗和山楂果香，酒香自然，風格明顯，感官評分最高。故選擇最佳酵母接種量為0.3 g/L。

圖3 酵母接種量對拐棗山楂果酒品質的影響Fig.3 Effect of yeast inoculum on the quality of Hovenia acerbahawthorn wine

2.1.4 發(fā)酵時間的確定

發(fā)酵時間對拐棗山楂果酒品質的影響見圖4。由圖4可知，隨著發(fā)酵時間的延長，拐棗山楂果酒的總糖呈現下降趨勢，酒精度呈現先上升后穩(wěn)定的趨勢，感官評分呈現先上升后下降的趨勢。發(fā)酵時間短，果酒中殘?zhí)橇枯^高，偏甜，口感不協調，澄清度也較差；發(fā)酵時間過長，由于發(fā)酵醪中含糖量的下降及酒精度的升高導致果酒不夠柔和爽口，酸甜比不協調；在發(fā)酵時間為7 d時感官評分達到最大值92分，此時拐棗山楂果酒酸甜協調，有自然優(yōu)雅的拐棗和山楂香，酒香濃郁。

圖4 發(fā)酵時間對拐棗山楂果酒品質的影響Fig.4 Effect of fermentation time on the quality of Hovenia acerbahawthorn wine

2.2 果酒發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗

以感官評分為評價指標，進行4因素3水平正交試驗，結果見表3。由表3可知，用感官評分作為評價指標時，影響拐棗山楂果酒品質的主次因素為A＞C＞D＞B，即拐棗漿和山楂漿質量比＞酵母接種量＞發(fā)酵時間＞初始糖度，最優(yōu)組合為A2B2C2D3，最佳工藝條件為拐棗漿和山楂漿質量比1∶2，初始糖度21 °Bx，酵母接種量0.3 g/L，發(fā)酵時間8 d。在此條件下進行驗證試驗，得到的果酒感官評分達到93.1分，酒精度為8.4%vol，糖度為7.9 g/L。

表3 拐棗山楂果酒發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗結果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for Hovenia acerba-hawthorn wine fermentation technology optimization

2.3 拐棗山楂果酒成品檢測結果及分析

拐棗山楂果酒澄清透明，顏色淺寶石紅色有光澤，無懸浮物及沉淀；有明顯的拐棗和山楂果香，酒香自然；酸甜協調，柔和爽口，風格明顯。理化和微生物指標檢測結果見表4。由表4可知，按最佳工藝條件制作的拐棗山楂果酒的理化指標及微生物限量均符合食品安全國家標準GB2758—2012《發(fā)酵酒及其配制酒》。

表4 拐棗山楂果酒理化及微生物指標檢測結果Table 4 Determination results of physiochemical and microbiological indexes of Hovenia acerba-hawthorn wine

2.4 抗氧化性檢測結果

不同濃度樣品對DPPH自由基和羥基自由基的清除能力測定結果見圖5。由圖5可知，拐棗山楂果酒、拐棗露酒及山楂露酒對DPPH自由基、羥基自由基的清除作用都隨著濃度的增加而增強，具有良好的量效關系。VC、拐棗山楂果酒、拐棗露酒和山楂露酒清除DPPH自由基的半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）值分別為4.9 μg/mL、0.36 mL/mL、0.45 mL/mL和0.63 mL/mL，即對DPPH自由基的清除能力為VC＞拐棗山楂果酒＞拐棗露酒＞山楂露酒；清除羥基自由基IC50值分別為410 μg/mL、1.89 mL/mL、3.10 mL/mL和4.09 mL/mL，即羥基自由基的清除能力為VC＞拐棗山楂果酒＞拐棗露酒＞山楂露酒，拐棗山楂果酒抗氧化能力高于泡制的露酒。主要原因可能是拐棗和山楂中的黃酮類化合物通過原料破碎及微生物發(fā)酵作用更多的溶入發(fā)酵液中，起到抗氧化作用。

圖5 不同濃度樣品清除DPPH自由基（A）以及羥基自由基（B）的能力Fig.5 DPPH free radical (A) and hydroxyl free radical (B) scavenging ability of samples with different concentrations

3 結論

該研究在單因素試驗基礎上，通過正交試驗對拐棗山楂果酒進一步優(yōu)化，確定最佳工藝條件為拐棗漿和山楂漿質量比1∶2，初始糖度21 °Bx，酵母接種量0.3 g/L，22 ℃條件下發(fā)酵8 d，所制得的果酒澄清透明，顏色呈淺寶石紅色，有明顯的拐棗和山楂果香，酸甜協調，風格明顯，感官評分達到93.1分，各項理化及微生物指標均符合食品安全國家標準。成品果酒富含黃酮，對DPPH自由基和羥基自由基清除能力均高于拐棗露酒和山楂露酒，具有良好的保健功效，可為高品質果酒的開發(fā)提供依據。