蔬菜水果中腐霉利快速檢測方法的優(yōu)化

泮秋立，劉建華，張鴻雁，王 駿，，胡明燕，梁秀清，胡 梅*

（1.山東省食品藥品檢驗研究院 國家市場監(jiān)管重點實驗室（肉及肉制品監(jiān)管技術(shù)），山東 濟(jì)南 250101；2.山東師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250101）

腐霉利（procymidone，PCD）是一種低毒的殺菌劑，又名殺霉利、二甲菌核利、速克靈等，通過抑制菌絲頂端細(xì)胞壁合成殺死霉菌，被廣泛用于蔬菜及果樹的灰霉病防治[1-3]。研究表明，腐霉利可以在植物上蓄積，少量攝入體內(nèi)對人的身體沒有影響，但長期超標(biāo)食用，會影響人體健康，輕則刺激眼部和皮膚，重則可能在人體內(nèi)定量沉積，對人體的神經(jīng)、血液系統(tǒng)等造成危害[4-6]。國家衛(wèi)健委、農(nóng)業(yè)農(nóng)村部及市場監(jiān)管總局聯(lián)合發(fā)布的GB 2763—2021《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中明確規(guī)定了腐霉利在蔬菜水果中的使用范圍和最大殘留限量。但近年來，腐霉利在果蔬上的廣泛使用，仍使其成為農(nóng)藥殘留檢出率和超標(biāo)率較高的農(nóng)藥品種之一。2019年以來，在國家市場監(jiān)管總局和各省市抽檢通報中[7]，多次出現(xiàn)果蔬中腐霉利超標(biāo)的問題，因此，蔬菜水果中腐霉利的監(jiān)控檢測尤為重要。

腐霉利常用的檢測方法主要為儀器檢測法和免疫分析法。儀器檢測法主要包括氣相色譜法[8-9]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[10-11]和高效液相色譜法[12]等?，F(xiàn)行國標(biāo)方法中腐霉利的檢測方法為氣相色譜和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法。免疫分析法主要包括膠體金免疫層析法[13]和酶聯(lián)免疫法[14]等。儀器檢測法靈敏度高、重現(xiàn)性好，也是現(xiàn)階段我國監(jiān)控食品安全的常用方法，但前處理復(fù)雜，耗時、耗力，專業(yè)性強，檢測成本高[15]。免疫分析法是基于抗原抗體之間特異性結(jié)合的原理來測定農(nóng)藥殘留的方法，具有簡便、快速、成本低的優(yōu)點，適合大量樣品的初步篩選和現(xiàn)場檢測[16]，其中又以膠體金免疫層析法應(yīng)用最為廣泛[17-20]。

將儀器檢測法和免疫分析法結(jié)合，先用膠體金免疫層析法對大批量樣品進(jìn)行快速篩檢，然后用儀器檢測法對陽性樣本進(jìn)行確證，可大大縮短檢驗時間，減少人力、物力投入，提高檢驗效率[21-23]。目前市場上已有約上百家腐霉利快速檢測試紙條生產(chǎn)企業(yè)，但是由于不同品牌結(jié)果判讀、儀器性能差異、匹配的試劑來源不一、結(jié)果的判定存在差異等原因，腐霉利農(nóng)藥殘留快速檢測技術(shù)在實際應(yīng)用過程中出現(xiàn)了很多問題[24-25]。本研究通過優(yōu)化主流腐霉利快檢產(chǎn)品的前處理步驟，確定檢測方法的性能指標(biāo)，考察每種膠體金快檢產(chǎn)品在果蔬基質(zhì)樣品檢測中的靈敏度、特異性、假陽性率、假陰性率和交叉反應(yīng)，建立一種蔬菜水果中腐霉利的膠體金免疫層析快速檢測方法。旨在為基層監(jiān)管部門快速篩查和農(nóng)貿(mào)市場、餐飲單位、超市等把關(guān)蔬菜水果的進(jìn)貨提供快捷有效的方式。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蔬菜、水果樣品：購自濟(jì)南某大型超市，且經(jīng)參比方法GB 23200.113—2018《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)植物源性食品中208種農(nóng)藥及其代謝物殘留量的測定氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法》（定量限為0.01 mg/kg）檢測均不含腐霉利；陽性樣品韭菜（樣品A）、黃瓜（樣品B）和葡萄（樣品C）經(jīng)GB 23200.113—2018《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)植物源性食品中208種農(nóng)藥及其代謝物殘留量的測定氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法》測定的腐霉利含量分別為0.67 mg/kg、3.20 mg/kg、5.61 mg/kg。

乙腈（純度≥99%）：霍尼韋爾貿(mào)易（上海）有限公司；丙酮、甲醇、Tris（純度均≥99%）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；腐霉利、百菌清、福美雙、多菌靈、啶酰菌胺、乙烯菌核利、異菌脲、五氯硝基苯、三唑酮、三氯殺螨醇、丙溴磷農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品（純度均≥99%）：曼哈格（上海）生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MS204TS/02電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；MS 3漩渦混合器：德國IKA公司；XMTD-7000電熱恒溫水浴鍋：北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司。

1.3 方法

本方法采用競爭抑制免疫層析原理。樣品中殘留的腐霉利經(jīng)提取后與膠體金標(biāo)記的特異性抗體結(jié)合，抑制抗體和試紙條中檢測線（T線）上抗原的結(jié)合，從而導(dǎo)致檢測線顏色深淺的變化。通過檢測線與控制線（C線）顏色深淺比較，對樣品中殘留的腐霉利進(jìn)行定性判定。

1.3.1 樣品前處理

稱取3 g（精確至0.01 g）搗碎后的蔬菜、水果樣品于50 mL離心管中，加入9 mL提取液（Tris-鹽酸-10%甲醇緩沖液，pH 9.0），渦旋振蕩提取1 min，過濾后備用。

1.3.2 樣品中腐霉利提取條件的優(yōu)化

（1）提取液的選擇

比較pH 9.0的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）、Tris-鹽酸緩沖液和Tris-鹽酸-10%甲醇緩沖液對不同樣品進(jìn)行處理后膠體金試紙條的顯色效果，選擇最佳提取液。

（2）提取液pH的優(yōu)化

比較當(dāng)提取液pH分別為7.0、8.0、9.0時，對模擬陽性樣本進(jìn)行測定后試紙條的顯色結(jié)果，選擇最佳的提取液pH。

（3）提取液中甲醇體積分?jǐn)?shù)的優(yōu)化

比較當(dāng)提取液中甲醇體積分?jǐn)?shù)分別為2%、4%、6%、8%、10%、12%時，對模擬陽性樣本進(jìn)行提取后的加標(biāo)回收率和試紙條的顯色效果，確定最佳的甲醇體積分?jǐn)?shù)。

（4）樣品提取液處理方式的優(yōu)化

比較將不同樣品提取后的樣液分別經(jīng)靜置、離心和過濾處理后試紙條的顯色效果，重復(fù)處理測定3次，選擇最佳的處理方式。

1.3.3 檢出限測定

由于本方法為定性檢測，判斷結(jié)果為陰性或陽性的依據(jù)就是樣品基質(zhì)的限量水平，GB 2763—2021《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中規(guī)定了蔬菜水果中腐霉利的最大殘留限量，其中限量水平最低的基質(zhì)為韭菜即0.2 mg/kg，因此確定本方法的最低檢出限為0.2 mg/kg。取不含腐霉利的韭菜空白基質(zhì)樣品，制成腐霉利質(zhì)量濃度為0.1 mg/kg、0.2 mg/kg、0.4 mg/kg的模擬樣品，將空白樣品和模擬樣品按照上述樣品前處理方法和分析步驟進(jìn)行處理，觀察試紙條的顯色效果。

1.3.4 試紙條測定

吸取待測液200 μL于金標(biāo)微孔中，抽吸5～10次混勻，3～5 min后將試紙條插入微孔中，8～9 min后進(jìn)行結(jié)果判定。

檢測線（T線）顏色比控制線（C線）顏色深或顏色相當(dāng)，表明樣品中腐霉利殘留量低于方法檢出限，判定為陰性；檢測線（T線）不顯色或檢測線（T線）顏色比控制線（C線）顏色淺，表明樣品中腐霉利殘留量高于方法檢出限，判定為陽性；控制線（C線）不顯色，表明操作不當(dāng)或試紙條無效。

1.3.5 檢測方法學(xué)研究

（1）性能指標(biāo)的測定

稱取以韭菜、黃瓜和葡萄為代表的空白基質(zhì)樣品，制成腐霉利質(zhì)量濃度為相應(yīng)限量水平的0.5倍、1.0倍和2.0倍的盲樣樣品各50份，共計450份樣本，按照優(yōu)化后的方法進(jìn)行測定，鑒于GB 2763—2021《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中黃瓜的腐霉利限量為2 mg/kg，葡萄的腐霉利限量為5 mg/kg，所以其樣品過濾液需稀釋后測定，考慮到不同品牌產(chǎn)品之間的差異，可參照廠家試劑盒說明書中的稀釋倍數(shù)進(jìn)行稀釋后測定，以考察方法的靈敏度、特異性、假陽性率和假陰性率。

（2）交叉反應(yīng)

在韭菜空白基質(zhì)樣品中分別加入百菌清、福美雙、多菌靈、啶酰菌胺、乙烯菌核利、異菌脲、五氯硝基苯、三唑酮、三氯殺螨醇、丙溴磷等10種農(nóng)藥，每種農(nóng)藥質(zhì)量濃度水平為最低檢出限的1 000倍即200 mg/kg，按照優(yōu)化后的測定方法考察交叉反應(yīng)。

（3）環(huán)境溫度的影響

利用腐霉利添加量為0.1 mg/kg、0.2 mg/kg的模擬樣品在10～40 ℃范圍進(jìn)行環(huán)境溫度適應(yīng)性考察，每份濃度樣品進(jìn)行5次平行測試。

（4）與參比方法的一致性

稱取以韭菜、黃瓜和葡萄為代表的空白基質(zhì)樣品，制成腐霉利添加量為相應(yīng)限量水平的0.5倍、1倍和2倍的盲樣樣品各20份。分別用本研究建立的快速檢測方法和標(biāo)準(zhǔn)參比方法GB 23200.113—2018《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)植物源性食品中208種農(nóng)藥及其代謝物殘留量的測定氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法》進(jìn)行檢測，對方法一致性進(jìn)行考察。

（5）真實陽性樣品驗證

韭菜（樣品A）、黃瓜（樣品B）和葡萄（樣品C）腐霉利真實陽性樣品，經(jīng)GB 23200.113—2018《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)植物源性食品中208種農(nóng)藥及其代謝物殘留量的測定氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法》測定的腐霉利含量分別為0.67 mg/kg、3.20 mg/kg、5.61 mg/kg，按照優(yōu)化后的測定方法進(jìn)行驗證。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取液的選擇

選取經(jīng)參比方法GB 23200.113—2018《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)植物源性食品中208種農(nóng)藥及其代謝物殘留量的測定氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法》檢測后的3個樣品：模擬陰性樣本1、模擬陰性樣本2和韭菜真實陽性樣本（樣品A）。對比考察了3種提取液（pH 9.0的PBS緩沖液、Tris-鹽酸緩沖液、Tris-鹽酸-10%甲醇緩沖液）對腐霉利農(nóng)藥的提取效果，用膠體金試紙條平行測定3次，結(jié)果見表1。由表1可知，3種提取液對模擬陰性樣本1和模擬陰性樣本2的試紙條檢測結(jié)果均為陰性，與參比方法一致。樣品A分別經(jīng)PBS緩沖液和Tris-鹽酸緩沖液提取后，試紙條測定結(jié)果與參比方法結(jié)果不一致；經(jīng)Tris-鹽酸-10%甲醇緩沖液的提取后，試紙條測定結(jié)果與參比方法結(jié)果一致，試紙條結(jié)果重復(fù)性好。因此，選擇Tris-鹽酸-10%甲醇緩沖液為提取液。

表1 不同提取液對腐霉利的提取效果比較Table 1 Comparison of extraction effects of different extracts on procymidone

2.2 提取液pH的優(yōu)化

圖1為模擬陽性樣本的試紙條測定結(jié)果。由圖1可知，試紙條C線顯色正常，T線顏色隨著提取液pH的增加由深變淺，當(dāng)pH為9.0時，樣本的檢測結(jié)果為明顯陽性，C、T線顏色對比明顯，結(jié)果重復(fù)性好。因此，選擇提取液的pH值為9.0。

圖1 不同pH的提取液下模擬陽性樣本的試紙條測試結(jié)果Fig.1 Test results of test strip of simulated positive samples under different pH extracts

2.3 提取液中甲醇體積分?jǐn)?shù)的優(yōu)化

利用膠體金試紙條和參比方法GB 23200.113—2018《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)植物源性食品中208種農(nóng)藥及其代謝物殘留量的測定氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法》對比考察不同甲醇體積分?jǐn)?shù)的提取液對模擬陽性樣品中腐霉利的提取效果，結(jié)果見表2。由表2可知，隨著提取液中甲醇體積分?jǐn)?shù)不斷增大，回收率隨之增加。當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)為2%、4%和6%時，模擬陽性樣品的檢測結(jié)果為陰性；當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)為8%和12%時，試紙條測試結(jié)果重復(fù)性不好；當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)為10%時，回收率為77.8%，試紙條測定結(jié)果為陽性，且重復(fù)性好。因此，考慮到腐霉利加標(biāo)回收率、試紙條顯色結(jié)果和環(huán)保低毒等要求，選擇提取液中甲醇體積分?jǐn)?shù)為10%。

表2 不同甲醇體積分?jǐn)?shù)對腐霉利試紙條的測試結(jié)果Table 2 Test results of different methanol volume fraction on procymidone test strip

2.4 樣品提取液處理方式的優(yōu)化

選取經(jīng)參比方法GB 23200.113—2018《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)植物源性食品中208種農(nóng)藥及其代謝物殘留量的測定氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法》檢測后的模擬陰性樣本和韭菜真實陽性樣本（樣品A），用試紙條進(jìn)行測定。將樣品提取液分別經(jīng)靜置、離心和過濾處理后試紙條的顯色結(jié)果見表3。由表3可知，三種不同處理方式，陰性樣本的測試結(jié)果與參比方法一致。樣品A的提取液經(jīng)靜置或離心處理后，試紙條檢測結(jié)果存在檢出陰性的情況；經(jīng)過濾處理后，試紙條檢測結(jié)果與參比方法檢測結(jié)果一致，重復(fù)性和穩(wěn)定性好?？紤]到本方法中樣品制備方式為搗碎，樣品比較細(xì)，為降低提取后的樣品液中基質(zhì)對檢測結(jié)果的影響，保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，選擇過濾的處理方式。

表3 不同樣液處理方式對試紙條顯色結(jié)果的影響Table 3 Effect of different liquid treatment methods on color development results of test strip

2.5 檢出限的測定

圖2為試紙條檢出限的測定結(jié)果，從左到右依次為空白基質(zhì)樣品和腐霉利質(zhì)量濃度分別為0.1 mg/kg、0.2 mg/kg、0.4 mg/kg的模擬樣品的平行檢測結(jié)果。由圖2可知，試紙條C線均顯色正常，T線顏色隨著腐霉利含量上升由深變淺，當(dāng)腐霉利質(zhì)量濃度為0.2 mg/kg時，T線顏色明顯弱于C線，為陽性結(jié)果，因此本方法的檢出限為0.2 mg/kg。

圖2 試紙條檢出限結(jié)果Fig.2 Detection limit results of test strip

2.6 產(chǎn)品方法性能指標(biāo)的測定

由表4可知，韭菜、黃瓜、葡萄基質(zhì)陽性樣品均檢出50個陽性結(jié)果，假陰性率均為0；韭菜、黃瓜、葡萄基質(zhì)陰性樣品均檢出100個陰性結(jié)果，假陽性率均為0；優(yōu)化后的檢測方法測定的不同基質(zhì)樣品的靈敏度、特異性均為100%。上述性能指標(biāo)均符合《食品快速檢測方法評價技術(shù)規(guī)范》（食藥監(jiān)辦科[2017]43號）[26]的技術(shù)要求。

表4 方法性能指標(biāo)的計算結(jié)果Table 4 Calculation results of the method performance indexes

2.7 交叉反應(yīng)

選取與腐霉利用途相同或復(fù)配使用或與腐霉利結(jié)構(gòu)相似以及比較容易檢出的10種農(nóng)藥：百菌清、福美雙、多菌靈、啶酰菌胺、乙烯菌核利、異菌脲、五氯硝基苯、三唑酮、三氯殺螨醇、丙溴磷等，考察其與腐霉利是否會產(chǎn)生交叉反應(yīng)，結(jié)果見圖3。

圖3 交叉反應(yīng)試紙條顯色結(jié)果Fig.3 Color development results cross-reaction test strip

由圖3可知，當(dāng)空白韭菜基質(zhì)樣品中加入腐霉利濃度水平為檢出限的1 000倍（即200 mg/kg）時，試紙條顯色結(jié)果均為陰性。因此本方法試紙條與百菌清、福美雙、多菌靈、啶酰菌胺、乙烯菌核利、異菌脲、五氯硝基苯、三唑酮、三氯殺螨醇、丙溴磷10種農(nóng)藥均無交叉反應(yīng)。

2.8 環(huán)境溫度的影響

由表5可知，當(dāng)環(huán)境溫度為15～35 ℃，測定5次的快檢結(jié)果與國標(biāo)結(jié)果均相符，符合率為100%，因此，最佳環(huán)境溫度為15～35 ℃。

表5 溫度耐變性實驗結(jié)果Table 5 Experimental results of temperature resistance

2.9 與參比方法一致性分析

分別用本研究建立的快速檢測方法與參比方法GB 23200.113—2018《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)植物源性食品中208種農(nóng)藥及其代謝物殘留量的測定氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法》測定3種不同基質(zhì)的果蔬陰性樣品和模擬陽性樣品。結(jié)果表明，依據(jù)《食品快速檢測方法評價技術(shù)規(guī)范》（食藥監(jiān)辦科[2017]43號）的要求，兩種方法的符合率為100%，通過卡方檢驗得出χ2=0.8＜3.84，表明本方法與參比方法的陽性確證比率在95%的置信區(qū)間內(nèi)沒有顯著性差異，能夠用于蔬菜水果中腐霉利的檢測。

2.10 真實陽性樣品驗證

利用膠體金試紙條對韭菜（樣品A）、黃瓜（樣品B）和葡萄（樣品C）的真實陽性樣品進(jìn)行驗證，平行測定3次，結(jié)果見表6。

表6 真實陽性樣品驗證結(jié)果Table 6 Verification results of true positive sample

由表6可知試紙條檢測結(jié)果均為陽性，與參比方法檢測結(jié)果一致。

3 結(jié)論

選用韭菜、黃瓜、葡萄作為研究對象，通過對市場上主流腐霉利膠體金快速檢測產(chǎn)品進(jìn)行方法優(yōu)化和性能指標(biāo)考察，結(jié)果表明，采用pH 9.0的Tris-鹽酸-10%甲醇緩沖溶液作為提取液，解決了單純緩沖液提取樣品中腐霉利提取不完全的問題，并通過對樣品提取液進(jìn)行過濾處理，降低了基質(zhì)對檢測結(jié)果的影響，保證了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。在優(yōu)化的前處理條件下，腐霉利膠體金快速檢測方法的檢出限可以達(dá)到0.2 mg/kg。經(jīng)過驗證，本方法各項性能指標(biāo)均符合要求，即方法的靈敏度為100%、特異性100%、假陽性率為0、假陰性率為0；交叉反應(yīng)結(jié)果顯示本方法試紙條與百菌清、福美雙、多菌靈、啶酰菌胺、乙烯菌核利、異菌脲、五氯硝基苯、三唑酮、三氯殺螨醇、丙溴磷均無交叉反應(yīng)；與參比方法進(jìn)行一致性分析比較，結(jié)果表明，本方法與參比方法的陽性確證比率在95%的置信區(qū)間內(nèi)沒有顯著性差異，建立的方法可行。綜上所述，本研究建立的腐霉利快速檢測方法，可用于蔬菜水果中腐霉利的現(xiàn)場檢測，能有效保障蔬菜水果的安全性。