離子色譜-電導法檢測格瓦斯中痕量溴酸鹽

鄒沫君，吳 麗，王 正*

（樂山市食品藥品檢驗檢測中心，四川 樂山 614000）

溴酸鹽曾一度被烘焙業(yè)視為物美價廉的面團氧化劑而廣泛應用于食品行業(yè)[1-2]，在面團的發(fā)酵、醒發(fā)及焙烤工藝過程中起到一種緩慢氧化的作用，使用后面粉更白，發(fā)酵速度更快，制作的面包更蓬松更漂亮，更具彈性與韌性，可達到優(yōu)質(zhì)小麥面粉的效果[3-4]。然而必須指出的是，1992年世界衛(wèi)生組織確認溴酸鹽是一種氧化性致癌物，長期食用會大大增加患腎癌、甲狀腺和腹膜間皮瘤的發(fā)病率[5-6]，禁用為面粉處理劑，許多國家也停止使用[7]。我國衛(wèi)生部于2009年發(fā)布的《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑品種名單（第二批）》中明確規(guī)定，溴酸鹽屬于違法添加物質(zhì)，食品生產(chǎn)加工企業(yè)在生產(chǎn)過程中不得使用溴酸鹽生產(chǎn)食品[8]。

格瓦斯是一種盛行于俄羅斯、烏克蘭及其他東歐國家的[9]，含低度酒精的飲料，采用俄羅斯大列巴面包干利用傳統(tǒng)發(fā)酵工藝釀造而成，顏色近似啤酒而略呈紅色，富含多種營養(yǎng)成分，如各種維生素、蛋白質(zhì)、氨基酸、乳酸菌等[10-12]，不僅酸甜適度，清涼爽口，具有濃郁的面包味，口味極佳，而且能開胃、助消化、調(diào)節(jié)腸胃機能，具有增進機體新陳代謝，提高機體性能等保健功效[13-14]。隨著消費需求的不斷改變，格瓦斯作為一款營養(yǎng)健康的功能性飲品，受到我國許多消費者的喜愛，具有一定的市場潛力和發(fā)展空間[15]。

格瓦斯制作最主要的原料就是面包，可能會存在溴酸鹽的潛在風險。近年來開發(fā)了飲用水和面粉中溴酸鹽測定的多種儀器分析方法[16-18]，我國于2006年5月10日發(fā)布了GB/T20188—2006《小麥粉中溴酸鹽的測定離子色譜法》[19]。由此可見，溴酸鹽測定方法有多種，主要有氣相色譜法[20-21]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[22-24]、離子色譜法（ion chromatography，IC）[25]、離子色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[26-27]和離子色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法[28]等。前兩法均需對溴酸鹽進行衍生后檢測，較為繁瑣；而離子色譜與質(zhì)譜已越來越多地聯(lián)用，其突出優(yōu)點是檢出限低，分析速度快，但是由于設備昂貴、操作復雜，使其在常規(guī)分析中的應用受到了限制，不屬于常規(guī)設備，在基層單位很難推廣應用。離子色譜法分析食品中的溴酸鹽一直是研究的熱點，具有快速、方便、選擇性好、靈敏度高等特點，是近年來發(fā)展速度較快的分析方法之一[29]。目前，已廣泛應用于食品、藥物、環(huán)境、生物、農(nóng)業(yè)、工業(yè)等各個方面[30]。

本研究探索建立了格瓦斯中溴酸鹽的離子色譜-電導檢測法，試樣經(jīng)石油醚洗去油脂，用超純水振搖提取，依次過0.22 μm微孔濾膜、Dionex OnGuard II RP小柱及Dionex OnGuard II Ag/H小柱凈化后，用陰離子交換色譜柱IonPac AS 19（250 mm×4 mm）分離，電導檢測器檢測，測定格瓦斯中溴酸鹽的含量。旨在對格瓦斯中溴酸鹽快速靈敏的檢測提供參考，達到有效監(jiān)控格瓦斯中溴酸鹽含量的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

格瓦斯：市售；溴酸根（BrO3-）標準品（100 μg/mL）（編號GNM-SBRO3-002-2013）：國家有色金屬及電子材料分析測試中心；石油醚（沸程30～60 ℃）、氫氧化鉀（KOH）（均為分析純）、甲醇（色譜純）：天津市富宇精細化工有限公司；實驗室用水為超純水（電阻率為18.25 MΩ·cm）。

1.2 儀器與設備

Thermo ScientificTMICS-1100離子色譜系統(tǒng)、Dionex OnGuard II RP小柱（2.5 mL）、Dionex OnGuard II Ag/H小柱（2.5 mL）、IonPac AS 19分離柱（250 mm×4 mm）、IonPac AG 19保護柱（50 mm×4 mm）：美國Thermo SCIENTIFIC公司；TGL-16臺式高速冷凍離心機：四川蜀科儀器有限公司；DT-110X30水浴恒溫振蕩器：上海篤特科學儀器有限公司；STAR星系列超純水機：上海礫鼎水處理設備有限公司；0.22 μm水系進口聚醚砜（polyethersulfone resin，PES）濾膜：美國頗爾公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 色譜條件

IonPac AS 19分離柱（250 mm×4 mm）、IonPac AG 19保護柱（50 mm×4 mm）；淋洗液源：帶有連續(xù)-再生陰離子捕獲柱（continuously regenerated anion trap column，CR-ATC）的洗脫液發(fā)生器（eluent generator cartridge，EGC）II KOH；梯度淋洗條件：0～12.0 min，8 mmol/L KOH；12.1～18.0 min，45 mmol/LKOH；18.1～23.0 min，8 mmol/LKOH；檢測器：電導檢測；抑制器：ASRS ULTRA II 4 mm，自循環(huán)電抑制，電流89 mA；流速：1.0 mL/mm；柱溫：30 ℃；定量環(huán)：500 μL。

1.3.2 標準溶液的配制

準確移取一定量的溴酸根（BrO3-）標準品，用水逐級稀釋成質(zhì)量濃度分別為1.0 μg/L、5.0 μg/L、10.0 μg/L、25.0 μg/L、50.0 μg/L、100.0 μg/L的標準工作溶液。在1.3.1色譜條件下進行測定，以溴酸根（BrO3-）質(zhì)量濃度（x）為橫坐標，色譜峰面積（y）為縱坐標，繪制溴酸根BrO3-峰面積-質(zhì)量濃度標準曲線。

1.3.3 試樣制備

試樣提?。簻蚀_稱取2.5 g（精確至0.01g）試樣于100 mL具塞三角瓶中。加入20 mL石油醚洗去油脂，傾去石油醚，在50 ℃條件下干燥。加入50 mL超純水，迅速搖勻置振蕩器上振搖20 min，取下，靜置，轉(zhuǎn)入離心管中，10 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min，取上清液備用。

試樣凈化：取上述備用上清液依次通過0.22 μm水系進口聚醚砜PES濾膜、Dionex OnGuard II RP小柱和Dionex OnGuard II Ag/H小柱，棄去前10 mL流出液，收集其后流出液直接進行色譜分析。Dionex OnGuard II RP小柱使用前用5 mL甲醇和10 mL純水活化，Dionex OnGuard II Ag/H小柱用20 mL純水活化，均放置20 min備用。

2 結(jié)果與分析

2.1 試樣前處理條件的選擇

格瓦斯是用面包干發(fā)酵釀造而成，但需要使用傳統(tǒng)的俄羅斯大列巴面包，在該面包的整個工藝配方中加鹽而不加糖，利用面包中的淀粉水解轉(zhuǎn)化成葡萄糖，類似于傳統(tǒng)的糯米酒釀，富含多種有機物質(zhì)，其中不乏大分子物質(zhì)。若試樣不經(jīng)適當前處理程序，連續(xù)多次色譜分析后，此類大分子物質(zhì)因與色譜柱基質(zhì)間較強的親和作用，被吸附在柱內(nèi)，不易洗脫，將導致柱效急劇下降。本試驗選用石油醚洗去油脂，水浴振搖提取法提高溴酸根（BrO3-）提取率，依次通過0.22 μm水系濾膜、Dionex OnGuard II RP小柱，利用共價吸附作用，捕獲殘余的大分子有機物，減少對色譜柱的污染。再經(jīng)Dionex OnGuard II Ag/H小柱除去試樣提取液中Cl-，降低對溴酸根（BrO3-）測定的干擾，防止高濃度Cl-導致色譜柱過載。

2.2 色譜條件的選擇

2.2.1 色譜柱的選擇

格瓦斯中常含有多種營養(yǎng)成分，因此在測定其中溴酸鹽時，需要選用柱容量較高的分析柱。IonPac AS 19離子色譜柱專為測定痕量溴酸鹽（一種臭氧消毒的毒副產(chǎn)物）設計，高柱容量和選擇性有助于測定μg/L質(zhì)量濃度水平的溴酸鹽；該色譜柱是Dionex在聚合物鍵合技術方面的新進展，用高容量樹脂（60.240 ueq/column，4 mm）優(yōu)化了柱子對溴酸鹽的選擇性，確保在使用抑制性電導檢測的情況下，即使存在超高濃度的氯化物、硫酸鹽和碳酸鹽，也能通過使用KOH梯度實現(xiàn)對低濃度溴酸鹽的定量測定。同時，這種聚合物親水性非常好，對KOH淋洗液選擇性很好，可以使用較低濃度的淋洗液。因此選用IonPac AS19作為分析住。

2.2.2 淋洗液系統(tǒng)選擇

CO32-型和OH-型是離子色譜分析陰離子常用的兩種淋洗液。其中，在色譜分析中應用范圍最廣的為CO32-型，但因其經(jīng)抑制器轉(zhuǎn)化后為碳酸，碳酸部分電離出碳酸根離子與氫離子，導致背景電導較高，水負峰較大，靈敏度降低，需要對試樣進行濃縮等前處理，不適合大體積直接進樣與梯度淋洗。然而，OH-型淋洗液克服了上述不足，在線產(chǎn)生系統(tǒng)電解水生成高純KOH，經(jīng)抑制器轉(zhuǎn)化為水，沒有碳酸鹽污染，具有較小的水負峰與較高的靈敏度，可以得到較好的保留時間重現(xiàn)性與較低檢出限。因此，選擇OH-型體系。

2.2.3 淋洗液濃度選擇

格瓦斯為面包汁發(fā)酵釀造，其制品中往往存在大量無機陰離子和有機酸。淋洗液濃度的選擇關系到待測組分BrO3-與試樣中無機陰離子及有機酸的分離效果評價與出峰時間的確定。由于BrO3-屬于親水性陰離子，在分析柱上保留相對較弱，因此一般情況下需要濃度較低的淋洗液進行梯度淋洗，從而得到良好分離效果。經(jīng)過試驗摸索，綜合考慮試樣分離度和分析時間，本試驗最終選擇了8 mmol/L KOH作為初始濃度進行淋洗，待BrO3-出峰后，再使用高濃度45 mmol/L KOH淋洗液沖洗6 min分析柱，將吸附在柱上的強保留性物質(zhì)（疏水性陰離子）洗脫下來，然后經(jīng)平衡回到起始濃度。因此選用KOH梯度淋洗作為試驗條件，實現(xiàn)溴酸鹽的準確定量。

2.2.4 流速和柱溫耐受性考察

分別考察采用不同流速及柱溫進行測定時色譜行為的變化，見表1。以溴酸鹽質(zhì)量濃度計，不同流速條件下相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）值為0.51%，不同柱溫條件下RSD值為0.53%。由表1可知，在實際檢測過程中色譜條件（流速及柱溫）有微小變化時，溴酸鹽含量測定條件較寬，結(jié)果基本不受影響，系統(tǒng)具有較好的耐受性。因此，流速可選0.9～1.1 mL/min、柱溫可選29～31 ℃。

表1 系統(tǒng)耐受性試驗考察結(jié)果Table 1 Results of systematic tolerance test

2.3 色譜行為

經(jīng)試驗探索，綜合考慮溴酸鹽保留時間及峰分離度等因素，最終選用1.3.1項色譜條件，實現(xiàn)了格瓦斯試樣中溴酸鹽的準確定量。溴酸鹽標準溶液、陰性試樣溶液以及陰性加標試樣溶液色譜圖見圖1。由圖1可知，該方法選擇性高，分離效果好，加標試樣出峰良好。

圖1 溴酸鹽標準溶液（A）、陰性試樣（B）及陰性加標試樣（C）離子色譜圖Fig.1 Ion chromatogram of bromate standard solution (A),negative sample (B) and negative spiked sample (C)

2.4 方法學考察

2.4.1 線性關系、方法檢出限和定量限

取溴酸鹽系列標準工作溶液，按1.3.1中色譜條件進樣，以溴酸鹽峰面積對質(zhì)量濃度計算線性回歸方程，確定相關系數(shù)。比較溴酸鹽色譜信號峰與基線信號，確定儀器最低檢出限（S/N=3），按試樣制備過程，得出方法檢出限與定量限，結(jié)果見表2。由表2 可知，溴酸鹽在1.0～100.0 μg/L范圍內(nèi)線性關系良好（R2=0.9998），且該方法檢出限為0.048μg/g，定量限為0.16 μg/g，能完全滿足分析檢測要求。

表2 溴酸鹽的回歸方程、相關系數(shù)、檢出限及定量限Table 2 Regression equation,correlation coefficient,limit of detection and quantitation of bromate

2.4.2 精密度試驗

取50.0 μg/L溴酸鹽標準溶液，在上述條件下重復進樣6次，計算精密度試驗結(jié)果RSD，結(jié)果見表3。

表3 精密度試驗結(jié)果Table 3 Results of precision tests

由表3可知，溴酸鹽的保留時間和峰面積檢測結(jié)果的RSD分別為0.21%和0.44%。結(jié)果表明該檢測方法精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗

取制備好的格瓦斯供試品溶液，按“1.3.1”項色譜條件每間隔4 h進樣1次，測定溴酸鹽質(zhì)量濃度，結(jié)果見表4。

表4 穩(wěn)定性試驗結(jié)果Table 4 Results of stability tests

由表4可知，穩(wěn)定性試驗結(jié)果RSD為0.49%，表明該檢測方法穩(wěn)定性良好。

2.4.4 回收率試驗

分別精密稱取3份格瓦斯試樣，加入低（2.5 μg/L）、中（5.0 μg/L）、高（25.0 μg/L）3種質(zhì)量濃度的溴酸鹽標準溶液。按上述方法提取、凈化后，進行色譜分析，對每個添加水平做3次平行試驗，計算各組分的平均回收率及其RSD，以考察方法的準確性，結(jié)果見表5。由表5可知，溴酸鹽的平均回收率在93.08%～98.05%范圍內(nèi)，RSD為0.85%～1.16%。結(jié)果表明，該檢測方法準確度良好，符合分析檢測要求。

表5 加標回收率試驗結(jié)果Table 5 Results of standard recovery rate tests

2.5 實際試樣分析

利用本試驗所建立的方法，對市面上幾款格瓦斯飲品中痕量的溴酸鹽進行測定，結(jié)果見表6。由表6可知，該方法對這些試樣均具有良好的適用性，色譜無干擾，不同品牌格瓦斯中溴酸鹽本底含量存在一定的差異。

表6 格瓦斯試樣中溴酸鹽含量分析結(jié)果Table 6 Analysis results of bromate content in Kvass samples

3 結(jié)論

本實驗建立了離子色譜法測定格瓦斯中痕量溴酸鹽的方法：試樣經(jīng)水浴振搖提取，采用固相萃取小柱凈化，以IonPac AS19陰離子交換色譜柱（250 mm×4 mm）分離，8～45 mmol/L KOH溶液梯度淋洗，抑制性電導檢測。該方法分離效果良好，操作簡便，靈敏度高，精密度、準確度及穩(wěn)定性均能滿足實際檢測工作要求，值得推廣應用。