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    基因組改組技術(shù)在微生物育種方面的應(yīng)用

    2022-12-11 08:12:26杜春梅李玉婷董錫文
    中國釀造 2022年11期
    關(guān)鍵詞:原生質(zhì)改組親本

    韓 笑,杜春梅,2,李玉婷,董錫文,2*

    (1.佳木斯大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,黑龍江 佳木斯 154007;2.佳木斯大學(xué) 應(yīng)用微生物研究所,黑龍江 佳木斯 154007)

    1 基因組改組技術(shù)的基本概念及發(fā)展歷史

    基因組改組技術(shù)是在脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)重組基礎(chǔ)上,結(jié)合傳統(tǒng)育種技術(shù),采用多親本之間的DNA重組和全基因組片段交換,將多個優(yōu)良表型重組在一起的過程。20世紀(jì)90年代中期,STEMMER W P[1]首次提出基因組改組的概念。2002年,ZHANG Y X等[2]在《Nature》雜志上發(fā)表了首篇應(yīng)用基因組改組技術(shù)改良微生物菌株的報道。僅用1年的時間,通過2輪原生質(zhì)體的遞歸融合,快速的增強(qiáng)了弗氏鏈霉菌(Streptomyces fradiae)合成泰樂菌素(Tylosin)的能力[2]。該基因組改組技術(shù)的改良成效,相當(dāng)于誘變育種工作20年的效果[2]。

    2 基因組改組技術(shù)的一般流程

    基因組改組技術(shù)的一般流程見圖1,包括親本庫的構(gòu)建、原生質(zhì)體的遞歸融合和目標(biāo)表型的篩選3個部分。

    圖1 基因組改組技術(shù)的一般流程Fig.1 General process of genome shuffling technique

    2.1 親本庫的構(gòu)建

    基因組改組的第一步是構(gòu)建一個基因多樣化的親本庫。首先要初步篩選具有良好的遺傳多樣性和表型變化明顯的原始菌株,然后對原始菌株進(jìn)行誘變處理,篩選出遺傳性狀優(yōu)良的不同類型的突變株,作為后續(xù)原生質(zhì)體融合的親本庫。目前,誘變?nèi)允浅R姷挠H本庫的構(gòu)建方法,通常用傳統(tǒng)的物理誘變(紫外(ultraviolet,UV)誘變)或化學(xué)誘變(亞硝基胍(nitrosoguanidine,NTG)誘變、甲基磺酸乙酯(ethyl methyl sulfonate,EMS)誘變)處理,經(jīng)過一輪或多輪誘變,從而獲得豐富基因型的正突變株[3]。例如,王灝等[4]通過紫外誘變和化學(xué)誘變對釀酒酵母f4、f5、f6進(jìn)行誘變,獲得具有耐高溫和耐乙醇能力的正突變株。但傳統(tǒng)的誘變方法具有誘變時間長和誘變效率低的局限性,為了提高親本菌株的突變效率,一些新興的誘變方法得到了發(fā)展和應(yīng)用,如常壓室溫等離子體(atmospheric room temperature plasma,ARTP)、常壓非平衡放電等離子體(atmospheric nonequilibrium discharge plasma,APNEDP)和低能離子注入(low energy ion implantation,LEII)等方法[5-6]。NIU F X等[7]利用ARTP誘變,獲得了9株莽草酸(shikimic acid,SA)滴度較高、16株生長速度較快、7株莽草酸滴度和生長速度均優(yōu)于親本的改良菌株。此外,根據(jù)隨機(jī)組合的策略,為了更加合理地構(gòu)建親本庫,如多重自動基因組工程(multiple automated genome engineering,MAGE)和真核生物多重自動基因組工程(eukaryotic multiplex genome engineering,eMAGE),可以引入到基因組改組中,篩選出具有更高多樣性和更多功能的大型親本庫[7]。

    2.2 原生質(zhì)體的遞歸融合

    原生質(zhì)體的遞歸融合是基因組改組的關(guān)鍵步驟。來自親本的原生質(zhì)體經(jīng)歷混合、融合、再生等過程,將來自多個親本菌株的遺傳特征進(jìn)行融合,使不同基因組的基因整合到一個全新的基因組中。傳統(tǒng)融合方法主要使用化學(xué)試劑(聚乙二醇)或電脈沖誘導(dǎo)細(xì)胞融合,其融合效率較低[3];激光誘導(dǎo)、光學(xué)鑷子、飛秒激光和微流控芯片等新興融合方法顯著提高了原生質(zhì)體的融合速率,改善了傳統(tǒng)融合方法效率較低的問題[8-10]。例如,GONG J等[11]利用擁有超高時空分辨率的飛秒激光誘導(dǎo)紅發(fā)夫酵母(Phaffia rhodozyma)的原生質(zhì)體融合,約20 min之后能夠發(fā)現(xiàn)細(xì)胞融合,160 min之內(nèi)兩個細(xì)胞融合成一個較大的細(xì)胞,融合效率達(dá)到80%。

    原生質(zhì)體融合的效率受融合方法的影響,反過來融合方法又因菌株而異[12]。因此,在進(jìn)行原生質(zhì)體融合之前,首先需要對單個菌株的融合方法進(jìn)行優(yōu)化,以保證原生質(zhì)體的高效融合和再生,從而獲得所需的重組菌株[13]。除了優(yōu)化使用方法外,還可以從技術(shù)方面提高原生質(zhì)體的融合效率。目前,原核細(xì)胞和真核細(xì)胞已經(jīng)成功地通過高效的原生質(zhì)體制備和融合來快速篩選各種菌株[14]??傊?,融合速度越快,獲得目的表型的速度越快。

    2.3 目的表型的篩選

    基因組改組的最后一步是目的表型的篩選。篩選方法種類多樣,篩選技術(shù)由于菌株改良的目標(biāo)而有所不同。一般的篩選方法包括表型觀察篩選、產(chǎn)物理化特性篩選、基質(zhì)利用能力篩選、選擇性壓力篩選、高通量篩選(high throughputscreening,HTS)等[15]。例如,通過水解圈、透明圈和抑菌圈等篩選產(chǎn)量提高的優(yōu)良菌株[16];通過生長狀態(tài)和選擇培養(yǎng)基篩選耐受能力較好的優(yōu)良菌株[17];通過高通量篩選方法篩選所需的目的表型和底物利用率提高的菌株[18]。目前出現(xiàn)了一些新穎的篩選方法,例如,添加菌株產(chǎn)物類似物至培養(yǎng)基中,以便有效分離得到高產(chǎn)菌株[19];使用顏色或熒光篩選代謝物產(chǎn)量提高的菌株,通過識別和篩選色素或受熒光影響的產(chǎn)品來選擇目的菌株的理想表型[20-21]?;诠庾V裝置,可以建立檢測范圍廣泛的化學(xué)物質(zhì)的高通量篩選方法,通過合適的高通量篩選方法可以迅速的分析目的菌株的多種性狀,并且對目的菌株進(jìn)行多種方式的快速分類[22]。總之,目的表型的篩選方法越高效,那么目的表型所需的篩選時間越短。

    3 基因組改組技術(shù)在微生物育種方面的應(yīng)用

    基因組改組技術(shù)是一種快速改善細(xì)胞表型的新型全基因組工程技術(shù),該技術(shù)已經(jīng)被廣泛用于種內(nèi)、種間和屬間許多重要菌株的表型改良[5,21,23]。

    3.1 應(yīng)用基因組改組技術(shù)提高代謝物產(chǎn)量

    基因組改組最重要的應(yīng)用就是提高代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量(見表1)。代謝產(chǎn)物的高產(chǎn)性狀在遺傳水平上主要受多個基因的調(diào)控,利用傳統(tǒng)的誘變育種方法都難以實(shí)現(xiàn)代謝物產(chǎn)量的提高[24]?;蚪M改組技術(shù)可以成功操縱復(fù)雜表型,快速獲得所需表型的高產(chǎn)菌株。例如,安絲菌素具有較高的抗腫瘤活性和抗菌活性,能夠抑制人腫瘤細(xì)胞的分裂,是一種很有前途的藥物前體[25]。親本菌株束絲放線菌(Actinosynnema pretiosum)ATCC 31565的安絲菌素產(chǎn)量較低,限制了其市場供應(yīng),LI J等[26]通過3輪基因組改組,使改良菌株G3-96的安絲菌素產(chǎn)量達(dá)到410.1 mg/L,比親本菌株的安絲菌素產(chǎn)量提高44.5%,比野生菌株的安絲菌素產(chǎn)量提高93.8%。表面活性肽(surfactin)是一種很有前途的微生物脂肽,在食品、環(huán)境、農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用,由于表面活性肽的生產(chǎn)效率較低,成本較高,其商業(yè)應(yīng)用受到了很大限制。CHEN L等[27]采用基因組改組技術(shù)對貝萊斯芽孢桿菌(Bacillus velezensis)進(jìn)行改良,經(jīng)過3輪基因組改組,獲得了高產(chǎn)、基因穩(wěn)定的改良菌株F34,其表面活性肽產(chǎn)量從229.6 mg/L提高到908.15 mg/L,在30 L發(fā)酵罐中產(chǎn)量達(dá)到917.05 mg/L,是原始菌株的3.99倍。

    表1 基因組改組技術(shù)提高代謝物產(chǎn)量的應(yīng)用現(xiàn)狀Table 1 Application status of genome shuffling technique to increase metabolite production

    3.2 應(yīng)用基因組改組技術(shù)提高改良菌株耐受能力

    微生物菌株的最重要性狀之一就是對環(huán)境條件具有一定的耐受性,這些環(huán)境脅迫會嚴(yán)重影響微生物菌株的代謝活性和生產(chǎn)力[42]。許多耐受性的表型受基因組中分布的多基因調(diào)控,難以用傳統(tǒng)育種、代謝工程或其他遺傳操作方法進(jìn)行修飾[43]。近年來,利用基因組改組技術(shù)提高微生物菌株對這些脅迫條件的耐受能力已經(jīng)有了廣泛的研究,如耐熱性、耐糖性、耐酸性、耐鹽性、乙醇耐受性和異丙醇耐受性(見表2)。例如:SHI D等[12]對釀酒酵母(S.cerevisiae)進(jìn)行3輪基因組改組,獲得的改良菌株SM-3能在55 ℃條件下的平板培養(yǎng)基上生長,提高了菌株SM-3的耐熱性、乙醇耐受性和乙醇產(chǎn)量,緩解了溫度對于釀酒酵母的發(fā)酵生產(chǎn)限制。YU L等[44]對鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)進(jìn)行2輪基因組改組后,改組菌株的乳酸產(chǎn)量、細(xì)胞生長和葡萄糖消耗分別較野生型提高71.4%、44.9%和62.2%?;蚪M改組提高了菌株耐受葡萄糖能力的同時提高了L-乳酸的產(chǎn)量。TIAN K等[45]通過基因組改組技術(shù)提高了改良菌株G423耐酸性的同時也提高了Nisin的產(chǎn)量,使得菌株G423可以在pH3.7培養(yǎng)基上存活,且Nisin效價(4543 IU/mL)比原始菌株F44高59.9%。CAO X等[46]通過基因組改組技術(shù)提高了魯氏酵母(Zygosaccharomyces rouxii)的耐鹽性,篩選到的改良菌株S3-2不僅在高鹽的培養(yǎng)基中生長狀態(tài)良好,而且對氯化鉀和氯化鋰表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗逆性,同時能夠加速醬油的風(fēng)味形成和提高醬油的品質(zhì)。SNOEK T等[47]對釀酒酵母(S.cerevisiae)的親本菌株進(jìn)行了3輪基因組改組,淘汰了乙醇耐受性較低的改良菌株,得到了具有最大乙醇產(chǎn)量和乙醇耐受性提高7%的釀酒酵母改良菌株。DE GéRANDO H M等[48]利用基因組改組技術(shù)對拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)進(jìn)行改良,最終得到3株異丙醇耐受能力提高的改良菌株,其異丙醇耐受能力最高達(dá)50 g/L,比原始菌株提高42.85%。CHENG C等[49]通過基因組改組技術(shù)提高了釀酒酵母(S.cerevisiae)對木質(zhì)纖維素水解物中存在的一種或多種抑制副產(chǎn)物的耐受能力,改組之后的釀酒酵母菌株對存在于木質(zhì)纖維素生物質(zhì)水解物中的抑制性副產(chǎn)物的耐受性增加。以上研究表明通過基因組改組技術(shù)不僅可以提高微生物菌株的單一性狀,而且可以同時改善微生物菌株的多種性狀,充分展示了該項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用潛力。

    表2 基因組改組技術(shù)提高菌株耐受能力的應(yīng)用現(xiàn)狀Table 2 Application status of genome shuffling technique to improve strain tolerance

    3.3 應(yīng)用基因組改組技術(shù)提高底物利用效率

    高效的底物利用能力是微生物菌株改良中所期望獲得的目的表型之一,通過基因組改組的方法,可以獲得底物利用率提高的菌株(見表3)。例如,JETTI K D等[51]利用釀酒酵母(S.cerevisiae)和樹干畢赤酵母(Pichia stipitis)進(jìn)行基因組改組,獲得了一株底物的利用率明顯高于親本菌株的改良菌株SP2-18,該菌株能夠利用木糖;JOHN R P等[23]使用德氏乳桿菌(Lactobacillus delbrueckii)和解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)作為親本菌株,從淀粉廢物中生產(chǎn)L-乳酸,3輪基因組改組之后,改良菌株F2從83 g/L木薯甘蔗渣(淀粉含量50%)中直接生產(chǎn)40 g/L乳酸,使淀粉轉(zhuǎn)化率達(dá)到96%;趙晨等[58]以枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)SFR-3A作為原始菌株,通過基因組改組技術(shù)篩選到具有高抗逆性D-核糖高產(chǎn)菌株SFRCP-100,該菌株在5 L發(fā)酵罐中的D-核糖產(chǎn)量達(dá)到38.2 g/L,其轉(zhuǎn)化率達(dá)到35%。

    表3 基因組改組技術(shù)提高菌株對底物轉(zhuǎn)化率的應(yīng)用現(xiàn)狀Table 3 Application status of genome shuffling technique to improve substrate conversion rate of strain

    此外,通過基因組改組提高底物利用率也可以用于降解環(huán)境污染成分[59-62]。生物系統(tǒng)天生具有將復(fù)雜底物轉(zhuǎn)化為簡單分子的能力,使其能夠?qū)Νh(huán)境污染成分進(jìn)行生物降解。由于從環(huán)境中分離出的野生菌株的降解速度較慢,因此,需要提高微生物降解高分子底物的能力。LEE B U等[59]通過基因組改組技術(shù)對具有降解2,4,6-三硝基甲苯(2,4,6-trinitrotoluene,TNT)能力的嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)OK-5進(jìn)行4輪基因組改組后,改良菌株對TNT的降解作用比原始菌株提高6倍;YI L等[60]利用紫外誘變和亞硝基胍誘變結(jié)合基因組改組技術(shù),提高了假單胞菌(Pseudomonas parafulva)YAB-1對于持久性有機(jī)污染物全氟辛酸(perfluorooctanoic acid,PFOA)的降解能力,改良菌株對PFOA的降解率達(dá)到58.6%,比原始菌株提高1.8倍[60]。

    以上研究結(jié)果不僅表明了基因組改組技術(shù)在提高底物利用率方面的成功應(yīng)用,而且證明了該項(xiàng)技術(shù)可以有效地促進(jìn)微生物菌株對于有毒化合物的降解以及該項(xiàng)技術(shù)在改善環(huán)境微生物污染中的廣闊的應(yīng)用前景。

    3.4 基因組改組技術(shù)在微生物菌株改良中其他方面的應(yīng)用

    研究發(fā)現(xiàn)通過基因克隆、突變或原生質(zhì)體融合等技術(shù)可能會激活基因組中的沉默基因,從而產(chǎn)生新的活性代謝產(chǎn)物[63]。在這方面,一些研究人員已經(jīng)證明了基因組改組在激活某些代謝方面也很有效(見表4),因此,基因組改組技術(shù)可以作為一項(xiàng)探索新基因和代謝產(chǎn)物的新方法。WANG M等[64]通過基因組改組得到的改良菌株G-444產(chǎn)生的18個新化合物,與原始菌株瘤座孢屬(Tuberculariasp.)TF5的化合物在結(jié)構(gòu)類型和代謝物上都有所不同,表明通過基因組改組之后一些沉默基因被激活;CAO X等[46]利用基因組改組技術(shù)篩選出的改良菌株S3-2在高鹽液體發(fā)酵中,提升了醬油風(fēng)味,而且減少了香氣形成所需的總時間。此外,改良菌株S3-2具有較高的氨基酸氮含量,其中乙酸乙酯含量為對照的2.38倍,并且改良菌株S3-2使4-羥基-2-乙基-5-甲基-3-呋喃酮(4-hydroxy-2-ethyl-5-methyl-3-furanone)的生成率提高75%,同時產(chǎn)生了4-乙基愈創(chuàng)木酚(4-ethylguaiacol)這一重要的風(fēng)味成分。

    此外,通過基因組改組技術(shù)使微生物菌株的其他目的表型也得到了顯著提高(見表4),如提高了植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)163的抑菌活性,提高了乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)對雞沙門氏菌(Salmonella gallinarum)的抑菌活性,提高了植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)C88的粘附力,提高了鏈霉菌(Streptomyces bikiniensis)對黃瓜枯萎病菌(Cucumber fusarium)的生防活性[65-68]。充分說明了基因組改組技術(shù)是一種范圍廣泛、功能強(qiáng)大的微生物菌株改良技術(shù)。

    表4 基因組改組技術(shù)在微生物育種其他方面的應(yīng)用現(xiàn)狀Table 4 Application status of genome shuffling technique in other aspects of microbial breeding

    4 結(jié)論與展望

    基因組改組作為一種快速改良微生物菌株全基因組的技術(shù),既可以對多個親本的全基因組進(jìn)行改良,又不需要十分了解改良菌株的遺傳背景,成功地完成了許多微生物菌株的表型改良,其中包括藥用微生物菌株,農(nóng)業(yè)微生物菌株和工業(yè)微生物菌株的改良,具有極大的應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)的潛力,促進(jìn)了微生物菌種選育工作的技術(shù)方法和路線上的變革,開創(chuàng)了菌種改良和改造工作的新局面[69]。但是基因組改組技術(shù)仍有較大的發(fā)展空間,首先,基因組改組技術(shù)可以與合理的基因工程相結(jié)合,可以提前將具有明確遺傳背景的單個基因、代謝途徑或代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行定向改造,然后用于進(jìn)一步的基因組改組。而且,隨著基因組學(xué)和生物信息學(xué)的發(fā)展,基因組改組作為連接其他技術(shù)的重要橋梁,將為闡明代謝網(wǎng)絡(luò)和調(diào)控機(jī)制提供更大的機(jī)會。此外,根據(jù)自動化裝置和快速檢測方法的發(fā)展,高通量篩選方法也將隨之更新。因此,建立普適的高通量篩選方法仍然存在較大困難。

    相信隨著多元策略創(chuàng)造遺傳多樣性、先進(jìn)的原生質(zhì)體誘導(dǎo)技術(shù)和高效的高通量篩選方法的應(yīng)用,基因組改組技術(shù)將在未來的微生物菌株改良中發(fā)揮出更加重要的作用,創(chuàng)造出更大的社會價值和經(jīng)濟(jì)價值。

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