非變性結構質譜在蛋白提取、離子源開發(fā)與構象解析方面的研究進展

許 霞，張晨傲，孫梓懿，鄭 珍，李功玉,3

(1.南開大學化學學院，分析科學研究中心，天津市生物傳感與分子識別重點實驗室，天津 300071；2.天津醫(yī)科大學藥學院，天津 300070；3.物質綠色創(chuàng)造與制造海河實驗室，天津 300192)

非變性條件下的蛋白質研究可以提供更具生物學意義的結構信息，為蛋白質“序列-結構-功能”關系提供分子基礎，以此揭示標志物蛋白在人類疾病發(fā)展過程中的作用，從而為疾病的精準治療提供潛在的藥物靶點。非變性質譜興起于20世紀90年代[1-3]，是一種使用特殊緩沖溶液(主要為醋酸銨)的蛋白質質譜分析技術。自2004年Leney等[4]首次提出非變性質譜(native mass spectrometry)概念至今，其已廣泛應用于結構生物學、質譜分析、生物制藥等領域，且起著不可替代的作用。

如何在分析蛋白質時使其保持近似自然生理環(huán)境中的非變性狀態(tài)，一直是結構生物學領域研究的熱點和難點。與X射線衍射晶體學、冷凍電鏡等傳統(tǒng)結構生物學手段相比，非變性質譜受益于質譜對分子質量的高分辨檢測，其可在使用極少量蛋白非結晶樣品的前提下，以超快的分析速度提供蛋白質相互作用的結合計量學和拓撲結構等信息。非變性質譜與離子淌度儀(ion mobility spectrometry)聯用可以快速分析蛋白質的高級構象，用于蛋白質和多肽的自組裝路徑解析追蹤與纖維化異質性分析等研究[5]。

非變性質譜分析時要求蛋白質盡量維持或者接近天然生理環(huán)境中的狀態(tài)。因此，與傳統(tǒng)的變性蛋白質質譜相比，非變性質譜可以在提供完整蛋白質分子質量信息的基礎上，盡可能保存非共價相互作用和拓撲結構等信息。非變性質譜要得到具有生物學意義的蛋白質結構信息，需至少滿足3個條件：1) 樣品制備條件溫和。在蛋白質離子化之前，盡可能通過控制溶液條件，如pH值、離子強度、緩沖液組成等參數，使處于非變性溶液中的蛋白質維持與正常生理條件下相近的折疊狀態(tài)[4,6]；2) 離子源條件溫和。蛋白質分子在離子化、相轉換過程中，需使用溫和的離子源種類，選取合適的離子化參數，盡可能維持蛋白質高級結構；3) 質譜儀條件溫和。非變性條件下生成的蛋白質離子在儀器內部傳輸、分離和檢測過程中，需要盡量減少高真空環(huán)境對高級結構的破壞作用，如使用低電壓模式并減少采樣時間。

本文將從蛋白提取、離子源開發(fā)以及蛋白構象解析新策略等3個方面，總結非變性結構質譜的研究現狀，并從化學測量學角度展望非變性結構質譜的發(fā)展前景。

1 非變性質譜蛋白提取方法

1.1 傳統(tǒng)的質譜分析蛋白質提取方法

蛋白質提取是蛋白質結構解析的第一步，也是決定蛋白質結構質譜解析成敗的關鍵步驟。傳統(tǒng)的蛋白質提取包括總蛋白提取、膜蛋白提取、細胞核蛋白提取等方面，基本原理是根據蛋白質的帶電性、極性和親疏水性等差異，設計特異性識別探針或色譜柱進行提取、富集與分離。目前常用的蛋白質純化方法有超速離心法、選擇性沉淀法、凝膠層析法和親和層析法等[7-8]，示于圖1a～1d。值得注意的是，對提取純化后的蛋白質進行質譜分析前，需要交換到合適的緩沖溶液中(如一系列濃度梯度的醋酸銨溶液)，使蛋白質恢復到非變性狀態(tài)。

1.2 基于萃取技術的蛋白提取方法

樣品預處理對于非變性質譜來說十分重要，良好的樣品預處理既可以維持蛋白質復合物內的非共價相互作用，又可以保持樣品溶液與質譜分析的兼容性，提高離子化效率。為了有效地從細胞、組織或血液中提取完整蛋白質，通常會將表面活性劑加入緩沖液中，有利于提取常規(guī)方法不易得到的膜蛋白。由于傳統(tǒng)的離子型表面活性劑會在離子化過程中產生離子抑制效應，極大地抑制蛋白質質譜信號，因此離子型表面活性劑的去除對于這些蛋白質樣品的質譜分析至關重要。但傳統(tǒng)的去除表面活性劑的方法往往不可避免地使蛋白質遭受損失甚至降解，制約了蛋白質提取效率的進一步提升。美國威斯康星大學麥迪遜分校Ge課題組[9]近年來開發(fā)了一種質譜兼容的光裂解陰離子表面活性劑——4-己基苯基偶氮磺酸鹽，其能有效溶解蛋白質，蛋白提取性能與十二烷基硫酸鈉(SDS)相當。同時，該表面活性劑可以通過紫外線照射快速降解，不會影響質譜檢測，可用于自上而下的完整蛋白質組學分析。

注：a.超速離心法；b.選擇性沉淀法；c.凝膠層析法；d.親和層析法；e.液體表面萃取[14]；f.納升解吸附電噴霧[14]；g.原位細胞蛋白提取質譜[13]圖1 適用于結構質譜解析的蛋白提取純化方法Fig.1 Native MS-compatible protein extraction and purification methods

除離線的蛋白質萃取提取方法，伯明翰大學Cooper課題組[10]利用液體表面萃取技術(liquid extraction surface analysis, LESA)從固體表面直接提取蛋白質復合物用于在線質譜分析，成功檢測到細胞內的親和素四聚體(～64 ku)、二硫化碳水解酶的八聚體(～190 ku)和十六聚體(～380 ku)、GroEL四聚體(～800 ku)以及AmtB膜蛋白三聚體等蛋白質復合物，證明該萃取方法具有較廣泛的適用性，示于圖1e。該課題組于2022年報道了一種納升解吸附電噴霧離子源(nano-desorption electrospray ionization, nanoDESI)，通過表面蛋白萃取，初步實現了約200 μm空間分辨率的原位蛋白質及其復合物成像分析，示于圖1f[11]。

1.3 原位蛋白分析

原位蛋白分析是指直接或僅需簡單處理后即可對細胞、組織或器官進行目標蛋白質分析的策略，其不需要嚴格的蛋白質提取和樣本制備過程，簡化了蛋白質提取處理步驟，作為一種新的蛋白分析方法逐漸受到關注。2016年，中國科學技術大學Huang課題組[12]提出了一種原位質譜分析策略，可以直接識別活細胞內分子質量相對較小的蛋白質和蛋白質-金屬離子復合物。有趣的是，該課題組在這項開創(chuàng)性的工作中發(fā)現了細胞內外金屬蛋白與金屬離子結合狀態(tài)的顯著差異。然而，由于配體、溶劑和其他細胞成分的大量非特異性結合，直接在細胞中識別更大的蛋白質和蛋白質/配體復合物仍然具有挑戰(zhàn)性。隨后，該課題組又提出了一種通用的一步質譜策略[13]，命名為“活細胞質譜”(In-cell MS)，該技術可用于直接從活細胞進行原位蛋白提取，并在毫秒級時間之后對提取的蛋白質及其復合物進行在線、實時鑒定和相互作用監(jiān)測。作者利用該策略成功實現了分子質量4～44 ku的17種蛋白質和蛋白質復合物的原位檢測，示于圖1g。與此同時，Cooper課題組[11]利用LESA和nanoDESI技術從腦、腎、肝等組織中直接鑒定了8種內源蛋白質聚集體，成功表征了亞基組成化學計量學等信息，并實現了蛋白質復合物在非變性質譜條件下的初步成像分析。這些研究表明，原位質譜技術可以最大程度地還原細胞內蛋白質及其復合物的真實生理狀態(tài)，有助于蛋白質結構和功能的研究。

2 非變性質譜的蛋白質離子化方法

2.1 傳統(tǒng)蛋白質質譜離子源

目前，生物質譜分析常用的2種主要離子源是電噴霧離子源(electrospray ionization, ESI)和基質輔助激光解吸離子源(matrix-assisted laser desorption ionization, MALDI)。由于在MALDI基質中(通常是酸性和變性環(huán)境)保存大分子復合物并維持非變性結構的難度較大，其在非變性結構質譜領域的應用較少[15-16]。而ESI不需要使用額外基質，也可以不加激光和熱量等，是目前最溫和的離子源，也是非變性結構質譜的首選離子源。

在滿足蛋白質非變性構象與四級結構兼容的條件下，ESI仍受到靈敏度和樣品利用率等方面的制約。在傳統(tǒng)ESI中，溶液流速較快(>1 μL/min)，管噴嘴直徑較大，以致產生的初始液滴尺寸較大(往往大于25 μm)，需要噴嘴與取樣口之間有足夠長的距離以支持液滴完成向氣相離子的演化[17]，形成的氣相離子僅有少部分進入質譜被檢測，導致浪費大量樣品的同時，很多低豐度的蛋白質分子離子也在這一過程中丟失，使靈敏度降低。相比于常規(guī)電噴霧，納升電噴霧(nanoelectrospray ionization, nESI)使用更小內徑的噴針毛細管(1～5 μm)，噴霧流速可降至100 nL/min[18]，由此產生的液滴尺寸較小，離子化效率較高，一定程度上解決了離子抑制效應的問題，更有利于分析蛋白質等生物大分子。因此，nESI是目前非變性質譜領域最常用的離子化方法[4]。

2.2 新型高性能結構質譜離子源

在非變性質譜分析時，通常通過添加非揮發(fā)性高鹽溶液的方式模擬細胞內環(huán)境，并穩(wěn)定蛋白質和蛋白質復合物的天然結構，維持蛋白質-蛋白質、蛋白質-配體、酶-輔助因子的相互作用[19]。然而，復雜樣品帶來的基質效應會干擾分析物的質譜檢測，產生離子抑制現象[20-22]，同時增加基線噪音，導致靈敏度顯著降低[23]；難揮發(fā)鹽會與蛋白質離子形成加合物，多種蛋白質-鹽加合離子的產生使質譜信號分布變寬，蛋白質信號分布到多個離子峰上，降低了蛋白質和蛋白質復合物的信號強度、質量測量的準確性以及檢測復合物中質量相近蛋白質翻譯后修飾的能力[19]。為減少復雜樣品分析時的離子抑制干擾，通常在非變性質譜分析前使用透析[24]、滲濾[25]、離子色譜[23]、液相色譜[26-29]、毛細管電泳[30-34]或固相微萃取[35-36]等方法離線去除非揮發(fā)性鹽，提高質譜分析的靈敏度，減少基質干擾。但該過程相對繁瑣，分離過程中對樣品的稀釋也使其不適合分析信號強度較低的樣品，且對于離子色譜而言，蛋白質分析物與色譜柱之間的相互作用可能會導致蛋白質構象變化。因此，近年來一些實驗室在納升電噴霧的基礎上進行改進，取得了一系列重要進展。

2.2.1感應納升電噴霧 美國普渡大學Cooks課題組[37]開發(fā)的感應納升電噴霧離子化(induced nanoESI, InESI)為蛋白質等生物大分子的高通量測定提供了新方法。它不僅減弱了基質效應，而且避免了電極和噴霧溶劑之間的物理接觸，實現了蛋白質的高效檢出。感應納升電噴霧裝置在噴霧毛細管外放置一平面電極并施加交流電，利用其誘導產生的感應電場產生溶液噴霧將分析物離子化，示于圖2a。所施加的交流電可以使InESI中的溶液噴霧交替生成正、負離子，對基質效應有較強的耐受性，電離效率高，噴霧毛細管不易堵塞，可以在沒有任何預處理的情況下分析蛋白質樣品，使復雜樣品的高通量分析成為可能[38]。

2.2.2梯度電壓納升電噴霧 清華大學Zhang課題組[39]提出的梯度電壓納升電噴霧(step-voltage nano electrospray ionization method, SV-nano-ESI)可顯著消除微量樣品分析中的基質干擾，示于圖2b。在發(fā)射器的尖端區(qū)域，可通過離子電遷移實現分析物和基質之間的有效分離。在2.4 kV電壓下分析樣品，強電場使基質中的陽離子與陰離子在尖端區(qū)迅速向相反方向遷移形成前導帶和拖尾帶，由于目標蛋白質具有較低的電遷移率，幾乎保持在中間條帶，從而實現目標分析物在不受基質干擾的情況下獲得較高的信噪比。SV-nano-ESI施加在噴霧毛細管上的高壓是去除基質的關鍵因素，該電壓必須高于發(fā)生分離的臨界電壓，基質去除率與高電壓的持續(xù)時間(即放電時間)高度相關。因此，通過控制電壓與放電時間，可以實現蛋白質分析物與復雜基質的分離。SV-nano-ESI將分離過程與離子化過程相結合，不需預處理即可實現微量樣品的高通量快速分析。

注：a,b.感應納升電噴霧電離[38]與梯度電壓納升電噴霧法[39]裝置示意圖(改變對nESI的施加電壓)；c.亞微米噴針的脫鹽效應[19](減小nESI尖端尺寸)；d.紙噴霧離子化法[62]圖2 新型非變性結構質譜離子源Fig.2 Emerging ion sources for native mass spectrometry

2.2.3亞微米電噴霧 加州大學伯克利分校Williams課題組[19]使用尺寸更小的噴霧毛細管尖端，即亞微米電噴霧，更好地分辨了蛋白質的電荷態(tài)分布，降低了鹽加合離子峰的豐度，示于圖2c。相較于尖端直徑大于1 μm的傳統(tǒng)噴針，尖端直徑0.5 μm的亞微米噴針在電噴霧過程中產生的初始液滴更小，含有的蛋白質數目不多于1個。他們發(fā)現液滴中含有的鹽離子隨液滴尺寸的縮小而減少，當液滴含有少于1個蛋白質分子時，每個含有蛋白質分子的液滴中鹽與蛋白質的比例降低，大部分鹽離子被包裹在不包含蛋白質分子的液滴中。通過產生低鹽含量的初始液滴和在尖端處施加高強度電場，亞微米噴針可降低鹽離子的加合，直接從各種常用的高濃度非揮發(fā)性鹽緩沖液中分析蛋白質和蛋白質復合物，節(jié)省了離線脫鹽等樣品預處理步驟。普渡大學Cooks課題組和新罕布什爾大學Li課題組[40-41]使用亞微米噴針分別開發(fā)了流速低至pL/min和fL/min(<10 pL/min)的電噴霧離子化方法。

2.2.4解吸電噴霧 普渡大學Cooks課題組[42-43]開發(fā)的解吸電噴霧離子源(desorption electrospray ionization, DESI)技術無需樣品前處理和預分離即可實現質譜采樣分析。 DESI實驗中，表面分子的提取和去溶劑化的時間極短，在小分子分析領域取得了較廣泛的應用，但由于萃取效率等原因，在復雜表面提取蛋白質進行質譜分析的應用較少。2017年，劍橋大學Robinson課題組[44]通過移除離子轉移管使DESI可直接定位于質譜采樣錐下方，完成了第一個完整蛋白質復合物的DESI分析，初步嘗試了DESI針對水溶性蛋白和膜蛋白及其復合物的天然結構分析方面的應用。隨后，帝國理工大學Bunch課題組[45]使用DESI檢測出了完整的血紅蛋白。

在傳統(tǒng)DESI實驗中，液滴和氣體會與樣品發(fā)生碰撞，利用溶劑與分析物的濺射實現離子解吸附，但不定向的濺射會導致檢測效率降低。因此，Laskin課題組[46]提出了nanoDESI技術，使用自吸毛細管替代原有的氣路輔助解吸方法，有效消除離子飛濺，提高采樣效率。

2.3 非變性高氣壓電噴霧產生超電荷離子

由于大部分質量分析器對質荷比響應靈敏度呈指數級反比關系，因此提高蛋白質分析物的電荷態(tài)可以提升質量分析器的檢測效率[47]，加深對非變性蛋白質離子氣相結構的理解，優(yōu)化基于電子或碰撞的離子活化方法中的解離效率、碎片離子數、序列覆蓋率等[48-50]信息。電噴霧中高壓氣流的引入可以產生極微小的噴霧液滴[51]，不僅可以提高樣品的除鹽效果，從總體上增加信號強度[52-55]，而且可以增加高電荷態(tài)離子的信號強度[56]，提高蛋白質離子的電荷態(tài)。中山大學Li課題組[57]應用這一原理，使用高氣壓電噴霧(high-pressure ESI)產生了最高電荷態(tài)超過瑞利極限的超電荷離子。通過非變性質譜和離子淌度碰撞截面積(collision cross-section, CCS)測定，證實高氣壓電噴霧在蛋白結構分析時的優(yōu)勢。與固定電荷基團化學衍生化[58]、亞微米噴射尖端[59]、超電荷試劑[60-61]等提高電荷態(tài)的方法相比，高氣壓電噴霧是一種快捷簡單且可控的超電荷方法。

2.4 紙噴霧用于非共價蛋白質復合物離子化

紙噴霧離子化(paper spray ionization, PS)是2010年由普渡大學Cooks課題組提出[62]，是一種迅速直接的敞開式離子化方法，兼具ESI與敞開式離子化方法的特點，其原理是將樣品溶液點樣于紙上，然后對濕潤的紙張施加高電壓產生離子，示于圖2d。俄亥俄州立大學Wysocki課題組[63]將PS應用于非共價蛋白復合物的質譜分析，觀察到PS產生了與nESI相似的質譜圖，初步表明其可以保存蛋白質分析物中的非共價作用；進一步的離子淌度質譜實驗提供的CCS數據也證明了其非變性質譜的兼容性，表明PS具有作為蛋白復合物非變性質譜分析離子化方法的潛力。

3 蛋白質構象的結構質譜解析

3.1 基于離子淌度質譜的蛋白質結構分析方法

離子淌度質譜(ion mobility-mass spectrometry, IM-MS)整合了離子淌度儀對離子進行尺寸和形貌分離以及質譜對分子質量和電荷進行分離的優(yōu)勢，根據離子淌度儀中離子漂移時間的長短區(qū)分不同離子，可以實現對相同質荷比(m/z)離子的二維構象分離分析。通過整合漂移時間與物理模型可計算蛋白質離子的CCS，用于定量描述蛋白質離子的大小與形狀。離子淌度與質譜的聯用使蛋白質離子的分析增加了反映離子尺寸與形狀的CCS這一維度，實現在相同m/z下分辨同一蛋白質離子的不同折疊狀態(tài)、蛋白質聚集體的不同聚集狀態(tài)等，提供了更豐富的氣相蛋白質離子結構信息。

非變性離子淌度質譜呈現的是蛋白質離子的靜態(tài)構象信息。受限于儀器分辨率，蛋白質的微小差異構象在多種商業(yè)化儀器上往往無法實現有效分辨。鑒于此，開發(fā)了一種動態(tài)蛋白構象分析方法——碰撞誘導去折疊(collision-induced unfolding, CIU)，即在離子淌度分析器前增加碰撞激發(fā)池，在電場加速作用下，蛋白質離子在碰撞激發(fā)池與惰性氣體發(fā)生碰撞，蛋白質的動能轉化為內能而被激發(fā)，進而被誘導發(fā)生構象去折疊過程。這種去折疊引起的構象變化可以用CCS表征，通過逐步提高碰撞能量，蛋白質不斷去折疊，CCS逐步增大，結構不同的蛋白質離子會出現不同的特征去折疊反應路徑，原本通過CCS無法區(qū)分的蛋白質構象，通過不同CIU路徑可以進行有效分辨。因此，與單獨CCS測量相比，基于CIU的非變性離子淌度結構質譜在具備捕獲蛋白質動態(tài)結構能力的同時，還展示出更高的結構分辨率，可以用來比較特定殘基、結構域和翻譯后修飾對蛋白質結構和功能的影響[64-66]、評價特定蛋白質靶向的配體分子結合效果以開發(fā)蛋白質篩選工具[67]。

然而，由于電噴霧產生的蛋白質離子不可避免地存在一定寬度的電荷態(tài)分布[68-69]，傳統(tǒng)的CIU在實際操作過程中為簡化數據分析，常依賴于四極桿篩選，對單一電荷態(tài)離子進行分析。值得注意的是，一方面，溶液相的電荷態(tài)和氣相的電荷態(tài)之間的關聯性并不強；另一方面，不同電荷態(tài)的蛋白質離子往往會產生不同的去折疊路徑，表現出不同的結構信息，所選取的單一電荷態(tài)并不一定能反映溶液相非變性結構信息。由于目前預測具有最接近非變性狀態(tài)結構的蛋白質離子電荷態(tài)仍存在困難，任意指定單一電荷態(tài)離子的分析不可避免地會產生電荷偏差效應。綜上，選擇單一電荷態(tài)的CIU構象分析策略不能全面提供溶液相蛋白質的結構特征，為避免單一電荷態(tài)的電荷偏差效應，需要付出更多的時間成本以篩選目標電荷態(tài)或逐個收集所有電荷態(tài)的數據。因此，本課題組[70]提出一種針對CIU策略的改進方案，即非靶向構象解析，包含全離子構象去折疊技術(all ion unfolding, AIU)和全構象表征方案(CCS accumulation, CCSacc)。

圖3 非靶向構象解析策略示意圖[70]Fig.3 Schematic illustration of non-targeted conformational interrogation strategy[70]

非靶向構象快速、高通量解析的示意圖示于圖3，對比性地闡述了CIU與AIU數據采集及其可視化方式的差異流程圖。其中，AIU技術不再依賴前級四極桿篩選離子，而是將所有的蛋白質離子全部引入碰撞池進行構象去折疊操控，并利用離子淌度質譜追蹤所有電荷態(tài)下的去折疊路徑。為進一步消除電荷偏差效應，在引入AIU操控技術的基礎上，開發(fā)了一個全新的全構象表征參數CCSacc，即通過將不同電荷態(tài)離子的CCS按相對豐度累積，考慮不同電荷態(tài)下的構象貢獻，組成一個能代表蛋白質全局結構的構象參數CCSacc。AIU技術與CCSacc全局構象表征的有機結合，助力蛋白質結構質譜分析從傳統(tǒng)的低通量靶向分析發(fā)展成為新型的高通量非靶向構象解析。這種新型的非靶向構象分析不僅保留了每個電荷態(tài)所攜帶的靜態(tài)構象及其動態(tài)變化信息，而且能夠更全面地揭示從溶液到氣相中所有蛋白的全局結構信息。數據證明，這種方法受ESI產生的電荷態(tài)分布變化影響更小，對于結構相似蛋白質，非靶向方法更能表征出其中的細微結構差異。非靶向的構象解析技術已經被用于蛋白質種屬差異鑒定[70]和低豐度不穩(wěn)定翻譯后修飾的構效關系[71]，并有望用于更多蛋白質高級結構對比性研究。

3.2 溶液相構象分析手段——離子遷移電泳法

與上述氣相分析方法相比，溶液相的構象分析方法是一種更直接表征蛋白質結構的手段，可以提供更真實可信的結構數據，獲取與非變性質譜相對應的構象信息，二者相互印證。北京理工大學Xu課題組[72-75]基于傳統(tǒng)電泳技術開發(fā)出全新的溶液相離子遷移電泳(mobility capillary electrophoresis, MCE)策略，嘗試建立溶液相與氣相蛋白質結構之間的關聯。MCE保留了傳統(tǒng)電泳方法的分離電場，具有一定的復雜樣品分離能力，可以通過蛋白質離子的保留時間測定其等效帶電量。在此基礎上，MCE使用Laminar流取代傳統(tǒng)電泳的電滲流，實現了高穩(wěn)定性、精準可控的離子遷移；泰勒擴散分析的引入使蛋白質離子流體動力學半徑的測定可以通過峰形分析實現。綜上，MCE同時實現了復雜組分分離、離子等效帶電量測定與離子流體動力學半徑測定，但這些信息仍然無法反映蛋白質的立體形貌。

MCE與非變性質譜聯用可以實現橢球狀蛋白質三維結構的初步確定，示于圖4[76-77]。通過對橢球狀蛋白質進行簡單建?？芍?，確定其三維形狀即確定橢球的半徑(a、b、c)；蛋白質離子在非變性質譜中表現出的電荷態(tài)分布反映了溶劑可及表面積(solvent accessible surface area, SASA)的大小，包含了半徑a的信息；MCE實驗提供的流體動力學半徑Rh與蛋白質體積V可以確定半徑b、c。綜上，MCE與非變性質譜聯用可以確定溶液相蛋白質離子的三維尺寸信息，以反映其折疊狀態(tài)等構象信息。將上述設計成果應用于一系列長球狀、扁平狀蛋白質良好的三維形狀測定，結果與標準數據庫具有較好的一致性。

4 總結與展望

非變性質譜的出現使通過質譜手段在近似生理狀態(tài)下分析蛋白質組成及變化成為現實，在蛋白質翻譯后修飾、蛋白結構與功能、蛋白質非共價相互作用以及蛋白復合物的化學計量學研究中發(fā)揮著不可替代的作用。離子淌度技術的引入以及多種構象分析手段的開發(fā)使得非變性質譜在蛋白質高級結構分析方面有了新的應用前景，尤其是在局部細節(jié)結構解析技術及分子模擬技術的融合策略下，非變性結構質譜技術可輔助構建蛋白質高精度三維結構模型。

雖然非變性質譜研究已經取得了長足的進展，結構質譜領域仍面臨挑戰(zhàn)：1) 局限于離線檢測，缺乏原位蛋白質結構信息。如目前大多數非變性質譜的分析對象都是重組蛋白或者表達純化后的蛋白復合物體系，然而重組蛋白脫離了蛋白質發(fā)揮功能的原有天然生物環(huán)境，缺少天然翻譯后修飾與伴侶分子，可能使相關結構解析信息失真[5，78]。這一問題的關鍵在于結構質譜環(huán)境兼容性，即質譜檢測環(huán)境(要求中性、無非揮發(fā)性鹽的緩沖體系)與蛋白生存的生物環(huán)境(多種不同pH值條件、高鹽條件)之間的兼容性問題，本質原因在于結構質譜離子源的靈敏度不高。原位質譜技術的開發(fā)有望解決這一問題，將對蛋白質的分析從純品發(fā)展到細胞及局部組織環(huán)境水平。Sharon課題組[78-80]在內源性蛋白復合物的非變性質譜檢測方面做了重要工作。此外，馬斯特里赫特大學Heeren課題組[81]開發(fā)的微通道板(microchannel plate)檢測器技術與近些年商業(yè)化的電荷探測質譜(charge detection MS, CDMS)技術代表了結構質譜硬件的最新進展[82-83]。隨著離子源和檢測方法的不斷提升和優(yōu)化，非變性質譜技術將推動蛋白質功能性結構原位分析的進一步發(fā)展。2) 結構分辨率無法匹配其他結構生物學技術。本文聚焦的基于離子淌度的結構分析技術，目前折算的結構分辨率上很難突破10埃，顯然無法滿足結構生物學對于超高分辨的結構解析需求。已有報道將離子淌度結構質譜與非變性結構質譜領域其他結構表征手段如化學交聯[84]、氫氘交換以及分子動力學模擬等技術相結合[85]，使結構質譜分辨率得到了有效提高，可以整合全局以及局部細節(jié)的結構信息，構建可靠的蛋白質動態(tài)結構模型。當然，結構分辨率的提升最終還是依賴于提升儀器硬件性能及對應的儀器應用方法，包括新型構象分辨離子淌度技術以及新型蛋白質結構化學探針等[86-88]。

注：a.MCE同時實現復雜樣品分離、等效帶電量測定、流體動力學半徑測定[72,74]；b.MCE與native MS聯用建立橢球狀蛋白三維模型流程[76]圖4 MCE測定蛋白結構的工作流程Fig.4 Workflow of MCE-based protein structure probing