非變性質(zhì)譜相關(guān)技術(shù)的研究進(jìn)展

譚聰睿，徐 偉

(北京理工大學(xué)生命學(xué)院，北京 100081)

幾乎所有的生命活動(dòng)都受到蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPIs)和蛋白質(zhì)-配體相互作用(PLIs)的調(diào)控。蛋白質(zhì)的功能與其結(jié)構(gòu)緊密相關(guān)，檢測(cè)并表征蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)構(gòu)，闡明蛋白質(zhì)之間及其與其他分子之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)是從分子水平上理解生命過(guò)程的關(guān)鍵，因此，需要對(duì)蛋白質(zhì)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)以及結(jié)合動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)進(jìn)行研究。近年來(lái)，核磁共振(NMR)、X-射線晶體學(xué)(X-ray crystallography)和冷凍電鏡(cryoEM)等結(jié)構(gòu)生物學(xué)方法[1-2]能夠提供蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)復(fù)合物的高分辨結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，但難以直接描述蛋白質(zhì)組裝動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)。對(duì)于圓二色譜(CD)、熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)、表面等離子共振(SPR)及等溫滴定量熱法(ITC)等傳統(tǒng)生物物理實(shí)驗(yàn)方法[2-3]，較高的樣品純度是獲得可靠實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)。

質(zhì)譜(MS)技術(shù)可以獲得樣品組成和化學(xué)計(jì)量等信息，在蛋白質(zhì)復(fù)合物分析方面具有較大的應(yīng)用潛力。非變性質(zhì)譜(nMS)使用軟電離技術(shù)，在接近生理pH值和溫和的去溶條件下，可將部分由非共價(jià)弱結(jié)合的復(fù)合物從溶液中完整地轉(zhuǎn)移到氣相中[4]，獲得化學(xué)計(jì)量、結(jié)合形式、熱力學(xué)、動(dòng)力學(xué)和復(fù)合物拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)等信息[5-8]。檢測(cè)速度快、靈敏度高和樣品用量少的特點(diǎn)，使nMS成為表征蛋白質(zhì)復(fù)合物和蛋白質(zhì)相互作用的重要手段。

近年來(lái)，有報(bào)道[9-11]使用nMS闡明蛋白質(zhì)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，測(cè)定相互作用結(jié)合常數(shù)，推動(dòng)了nMS在醫(yī)藥研究、疾病診斷等領(lǐng)域的發(fā)展。本文將介紹nMS的技術(shù)特點(diǎn)及近年來(lái)的研究進(jìn)展，并展望未來(lái)的發(fā)展方向。

1 樣品制備與純化

樣品制備首先需要純化目標(biāo)蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)復(fù)合物，通常是在細(xì)胞內(nèi)過(guò)度表達(dá)，然后使用親和標(biāo)簽進(jìn)行純化，同時(shí)也可以從植物或器官組織等天然來(lái)源中獲得。但不同的純化方案需要特定優(yōu)化，以獲得足夠的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)復(fù)合物用于進(jìn)一步分析。在蛋白質(zhì)復(fù)合物的樣品制備過(guò)程中，會(huì)引入金屬陽(yáng)離子、無(wú)機(jī)離子、去垢劑、緩沖液等[12-13]干擾物質(zhì)。在nMS實(shí)驗(yàn)前，需要對(duì)樣品中的干擾物進(jìn)行稀釋或去除，再將純化后的蛋白質(zhì)復(fù)合物轉(zhuǎn)移至與質(zhì)譜兼容的揮發(fā)性鹽溶液中，通常選擇pH 6～8的醋酸銨水溶液以保留蛋白質(zhì)復(fù)合物的天然構(gòu)象[14]。

nMS樣品制備的難點(diǎn)在于樣品處理與質(zhì)譜檢測(cè)的聯(lián)用，既要保留蛋白復(fù)合物的天然結(jié)構(gòu)，又要制備與電噴霧質(zhì)譜兼容的緩沖液。在線樣品制備與純化技術(shù)(如尺寸排阻色譜(SEC)[15]和疏水相互作用層析法(HIC)[16])的發(fā)展有助于nMS的高通量檢測(cè)，并使其適用于檢測(cè)更復(fù)雜的樣品。最近，Sharon等[17]將過(guò)度表達(dá)的某種蛋白質(zhì)的細(xì)胞直接在醋酸銨溶液中裂解，離心取上清液，然后進(jìn)行nMS分析，顯著減少了樣品純化步驟。

通過(guò)修改噴霧過(guò)程中的恒定噴霧電壓，開(kāi)發(fā)了多種技術(shù)以簡(jiǎn)化樣品處理過(guò)程。黃光明課題組[18]以脈沖電壓在噴針中感生的微電泳效應(yīng)為基礎(chǔ)，開(kāi)發(fā)了適用于單步質(zhì)譜分析蛋白的微電泳技術(shù)，無(wú)需或僅需簡(jiǎn)單的樣品前處理即可實(shí)現(xiàn)直接原位分析活細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)-配體相互作用。此外，該技術(shù)通過(guò)減少離子化階段中蛋白質(zhì)與金屬離子非特異性結(jié)合的干擾，揭示了天然狀態(tài)下與細(xì)胞功能相關(guān)的蛋白質(zhì)-金屬離子相互作用[19]。張新榮課題組[20]在電噴霧電離過(guò)程中使用階躍電壓處理小體積樣品，在高電壓階梯進(jìn)行電泳分離，在低電壓階梯進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，可以顯著去除鹽類(lèi)等基質(zhì)干擾，提高復(fù)雜基質(zhì)小體積樣品的質(zhì)譜分析靈敏度。不需要預(yù)處理即可對(duì)尿液、淚液等復(fù)雜體系內(nèi)的蛋白質(zhì)進(jìn)行非變性分析，實(shí)現(xiàn)了高通量和快速分析。

2 離子源技術(shù)

2.1 納升電噴霧電離源

離子源將分析物完整地從液相轉(zhuǎn)移至氣相是nMS檢測(cè)的前提和關(guān)鍵。電噴霧(ESI)過(guò)程需要依賴高溫、助溶劑和有機(jī)酸等，不利于保留蛋白質(zhì)復(fù)合物的天然結(jié)構(gòu)[21]。納升電噴霧電離源(nESI)[22]的出現(xiàn)極大地推動(dòng)了質(zhì)譜技術(shù)在蛋白質(zhì)分析中的應(yīng)用，其產(chǎn)生的液滴尺寸較小，可以使用水溶液和耐受較高的鹽濃度，且所需的樣品量較少。在此基礎(chǔ)上，Wilm和Mann[23]于1994年設(shè)計(jì)了一種噴頭尺寸更小的nESI源，將電噴霧噴頭的直徑從0.5 mm縮小至1～2 μm，通過(guò)減小初始液滴的尺寸，減少每個(gè)液滴中的鹽離子數(shù)量，進(jìn)一步減少溶劑揮發(fā)后蛋白質(zhì)的鹽類(lèi)加合物，顯著降低了對(duì)樣品制備的要求[24]，示于圖1。Susa等[25-27]基于這種小尺寸噴頭nESI源的脫鹽方法，實(shí)現(xiàn)了含干擾成分的緩沖液中蛋白質(zhì)復(fù)合體甚至膜蛋白質(zhì)的分析。

2.2 解吸電噴霧電離源

2004年，Cooks課題組[28]提出了解吸電噴霧電離源(DESI)，通過(guò)將電噴霧產(chǎn)生的帶電液滴撞擊樣品表面產(chǎn)生攜帶樣品的次級(jí)液滴進(jìn)入質(zhì)譜儀檢測(cè)。DESI作為一種敞開(kāi)式軟電離技術(shù)基本不需要對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理，其最重要的應(yīng)用是質(zhì)譜成像[29]，能夠用于外科手術(shù)中腫瘤組織的實(shí)時(shí)檢測(cè)[30]，此外，DESI也被成功應(yīng)用于nMS研究。最近，Robinson課題組[31]使用DESI研究脂類(lèi)和藥物與膜蛋白的結(jié)合，展示了高通量篩選激動(dòng)劑的潛力；Cooper課題組[32]將nano-DESI應(yīng)用于nMS實(shí)驗(yàn)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)組織樣本中蛋白質(zhì)及蛋白質(zhì)復(fù)合物的成像，同時(shí)，該裝置還能夠用于定位的自上而下測(cè)序?qū)嶒?yàn)。目前，DESI用于非變性質(zhì)譜作為結(jié)構(gòu)生物學(xué)的重要工具已被廣泛接受，該技術(shù)對(duì)完整膜蛋白及其復(fù)合物的研究能力為在人工雙層膜或膜模擬物中進(jìn)行空間、時(shí)間甚至定向分析提供了進(jìn)一步的可能性。

圖1 微米級(jí)和納米級(jí)電噴霧噴頭生成的帶電液滴[24]Fig.1 Evolution of a charged droplet generated with microemitter and nanoemitter[24]

2.3 溫控電噴霧電離源

圖2 變溫電噴霧電離源裝置(vT-ESI)[39]Fig.2 Variable-temperature electrospray ionization (vT-ESI)[39]

溫控電噴霧電離源(TCESI)通過(guò)控制噴霧溶液的溫度，在噴霧前對(duì)溶液中的待測(cè)物進(jìn)行加熱或冷卻，結(jié)合MS用于研究生物分子的熱力學(xué)。相較于其他方法(如CD、ITC)，TCESI-MS能夠以較低的樣品消耗量提供更詳細(xì)的結(jié)構(gòu)信息，實(shí)現(xiàn)對(duì)復(fù)雜混合樣品的檢測(cè)分析[33]。將TCESI用于nMS能夠直接測(cè)定蛋白質(zhì)及其復(fù)合物的變性與非變性結(jié)構(gòu)，以及蛋白質(zhì)-配體相互作用的動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)[33]。目前，具有較寬工作溫控范圍的電離源包括溫控納升ESI[34-35]、冷噴霧ESI[36]、高壓ESI[37]和雙加熱模塊ESI[38]。在Robinson等[34]和Kaltashov等[35]研究溶菌酶、熱休克蛋白TaHSP16.9和抗凝血酶的熱致變性以及溫度誘導(dǎo)的抗體構(gòu)象轉(zhuǎn)變的前期工作基礎(chǔ)上，Russell等[39]開(kāi)發(fā)了一種變溫電噴霧電離源裝置(vT-ESI)，示于圖2。該裝置利用熱電芯片控制電噴霧溶液在-5～98 ℃溫度范圍內(nèi)以小于2 min的平衡時(shí)間變化，與質(zhì)譜及離子淌度譜相結(jié)合成功地用于研究蛋白折疊的熱力學(xué)和溫度依賴性配體結(jié)合過(guò)程。Zenobi課題組[38]開(kāi)發(fā)了一種編程溫控以及跳變溫區(qū)電噴霧電離源(T-jump ESI)，能夠在10～90 ℃溫度范圍內(nèi)進(jìn)行快速動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)(0.16～32 s)，并與質(zhì)譜結(jié)合，對(duì)肽段、蛋白質(zhì)以及DNA復(fù)合物進(jìn)行折疊和展開(kāi)動(dòng)力學(xué)研究。

3 質(zhì)量分析器

3.1 四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜

在nMS實(shí)驗(yàn)中，質(zhì)譜儀需要能夠傳輸并準(zhǔn)確識(shí)別具有較高質(zhì)荷比的復(fù)合物，通常使用飛行時(shí)間(TOF)質(zhì)譜和四極桿飛行時(shí)間(Q-TOF)質(zhì)譜。隨著nMS的不斷發(fā)展，需要對(duì)傳統(tǒng)的Q-TOF進(jìn)行改進(jìn)[40]，降低四極桿的射頻可傳輸具有更高質(zhì)荷比的離子，增大壓強(qiáng)可優(yōu)化高質(zhì)荷比離子的傳輸與去溶，示于圖3。此外，通過(guò)優(yōu)化碰撞活化室出入孔可傳輸前體離子和產(chǎn)物離子，減小碰撞活化室入口和出口孔徑大小可允許更高的碰撞壓力[40]。

3.2 軌道離子阱質(zhì)譜

nMS中質(zhì)量分析器的改進(jìn)幾乎都是基于TOF或Q-TOF，基于軌道離子阱(Orbitrap)[41](示于圖4)和傅里葉變換離子回旋共振(FTICR)的質(zhì)譜儀也展現(xiàn)出在nMS分析中的潛力。2012年，為開(kāi)發(fā)基于Obritrap的高分辨質(zhì)譜儀，Rose等[42]改裝了允許探測(cè)高達(dá)m/z24 000離子的軟件，施加最大電壓于所有傳輸高質(zhì)量離子的射頻多極，增加了高能碰撞解離室(HCD)的壓力。后續(xù)對(duì)Q Exactive組合型四極桿-軌道阱質(zhì)譜儀[43]和Q Exactive超高質(zhì)量范圍質(zhì)譜儀[44]進(jìn)行開(kāi)發(fā)。

3.3 離子活化方法

在nMS實(shí)驗(yàn)中，串聯(lián)質(zhì)譜分析采用多種離子活化方法使蛋白質(zhì)復(fù)合物的前體離子活化碎裂，形成1個(gè)帶電的單體離子以及剩余亞基組成的蛋白質(zhì)復(fù)合物，從而提供蛋白質(zhì)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)和相互作用信息[8]。通常采用的離子活化方式是碰撞誘導(dǎo)解離(CID)[45]，碰撞氣體將攜帶的部分能量通過(guò)碰撞轉(zhuǎn)化為前體離子的內(nèi)能，使前體離子解離產(chǎn)生產(chǎn)物離子。CID是幾乎所有串聯(lián)質(zhì)譜平臺(tái)的常規(guī)功能，至今仍是離子活化方法的金標(biāo)準(zhǔn)[46]，但CID會(huì)產(chǎn)生過(guò)多的重排反應(yīng)，不利于獲取復(fù)合物的四級(jí)結(jié)構(gòu)[47]。表面誘導(dǎo)解離(SID)是一種頗具前景的活化方法，主要用于分解蛋白質(zhì)復(fù)合物[48]，通過(guò)離子與固體表面碰撞，能夠在結(jié)合力最弱的亞基處優(yōu)先解離，保留剩余復(fù)合物的天然構(gòu)象，從而表征蛋白質(zhì)復(fù)合物的四級(jí)結(jié)構(gòu)。此外，用于研究蛋白質(zhì)復(fù)合物的離子活化方法還有：1) 基于電子的解離方法(如電子捕獲解離(ECD)和電子轉(zhuǎn)移解離(ETD))不會(huì)導(dǎo)致翻譯后修飾的損失，可用于定位修飾的位點(diǎn)，已廣泛用于肽和蛋白質(zhì)的分析[49]；2) 用不同波長(zhǎng)的激光代替碰撞氣體為離子提供能量的解離方法，如紫外光解離(UVPD)和紅外多光子解離(IRMPD)，其中UVPD產(chǎn)生碎片的途徑廣泛多樣，具有范圍較廣的序列覆蓋，被用于多種蛋白質(zhì)組學(xué)研究[50]。以上離子活化方法均能夠在蛋白質(zhì)復(fù)合物的研究中保留復(fù)合物的非共價(jià)相互作用[51]，可用于在商用或改裝的質(zhì)譜儀上進(jìn)行串聯(lián)nMS分析[46]。

發(fā)揮地質(zhì)調(diào)查技術(shù)優(yōu)勢(shì) 推進(jìn)土地管理服務(wù)支撐體系建設(shè)（董巖翔） ...........................................................12-42

圖3 改進(jìn)的Q-TOF質(zhì)譜裝置示意圖[41]Fig.3 Schematic of a modified Q-TOF mass spectrometer[41]

圖4 Q Exactive組合型四極桿-軌道阱質(zhì)譜儀示意圖[41]Fig.4 Schematic of Q Exactive hybrid quadrupole-Orbitrap mass spectrometer[41]

4 質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)

4.1 離子淌度質(zhì)譜

近年來(lái)，離子淌度譜與高分辨質(zhì)譜聯(lián)用的離子淌度質(zhì)譜(IM-MS)發(fā)展快速，已作為一種分析完整蛋白質(zhì)復(fù)合物的技術(shù)被應(yīng)用于nMS研究，獲取蛋白質(zhì)復(fù)合物高階結(jié)構(gòu)和相互作用動(dòng)力學(xué)特征[52-53]。早期研究表明[54]，蛋白質(zhì)復(fù)合物液相結(jié)構(gòu)可以部分保留在氣相中，其中一項(xiàng)關(guān)鍵的發(fā)現(xiàn)是觀察到tRNA結(jié)合蛋白TRAP的環(huán)狀結(jié)構(gòu)能夠保持在氣相中[6]，證明了IM-MS應(yīng)用于nMS研究蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)構(gòu)的可行性。目前，用于IM-MS技術(shù)的有漂移時(shí)間離子遷移譜(DTIMS)、行波離子遷移譜(TWIMS)和捕集離子遷移譜(TIMS)、場(chǎng)不對(duì)稱(chēng)波形離子遷移譜(FAIMS)和差分電遷移率分析儀(DMA)等，其中DTIMS是最傳統(tǒng)的方式，TIMS則代表了最新的技術(shù)。Dodds等[55]比較了上述5種遷移譜技術(shù)在結(jié)構(gòu)和功能上的差異，示于圖5。DTIMS、TWIMS和TIMS的遷移區(qū)均由環(huán)形電極組成，DTIMS在遷移區(qū)內(nèi)施加均勻電場(chǎng)，是唯一能直接測(cè)定離子碰撞截面積(CCS)的技術(shù)；TWIMS在遷移區(qū)內(nèi)施加振蕩電場(chǎng)，顯著提高了分辨率；TIMS在遷移區(qū)內(nèi)施加緩慢降低的掃描電場(chǎng)與反向緩沖氣流，實(shí)現(xiàn)了選擇性地洗脫目標(biāo)離子。FAIMS和DMA在平行極板間形成遷移區(qū)，遷移區(qū)內(nèi)電場(chǎng)與緩沖氣流方向相互垂直，F(xiàn)AIMS利用非對(duì)稱(chēng)射頻高壓疊加直流低壓使非目標(biāo)離子遷移至平行極板被中和，提高了目標(biāo)離子的信噪比；DMA的檢測(cè)電極分布在平行極板的一側(cè)，離子根據(jù)遷移率在平行極板上進(jìn)行分離，常用于大分子的檢測(cè)。

質(zhì)譜與IM的聯(lián)用為nMS檢測(cè)分析提供了離子橫截面作為與MS正交的分離維度，由蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)復(fù)合物的漂移時(shí)間可獲得對(duì)應(yīng)的CCS信息，通過(guò)建模分析IM-MS實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，可以得到蛋白質(zhì)復(fù)合物相對(duì)精細(xì)的結(jié)構(gòu)模型作為額外的形狀分析維度[56]。另外，IM與離子活化技術(shù)(如碰撞誘導(dǎo)展開(kāi)(CIU)[57-59]、SID)相結(jié)合，可以提供更豐富的結(jié)構(gòu)信息，用于配體影響蛋白質(zhì)復(fù)合物構(gòu)象穩(wěn)定性的研究，如底物與輔助因子[59]或脂類(lèi)與蛋白[60]結(jié)合的穩(wěn)定性。

近年來(lái)，IM-MS在儀器、標(biāo)準(zhǔn)和方法建立等方面均取得了進(jìn)展。Gadkari等[61]和Jeanne等[62]分別研發(fā)了商用DTIMS(示于圖6)和TIMS儀器用于更大生物分子的非變性分析。Mortensen等[63]和Stiving等[64]提出了IM標(biāo)準(zhǔn)，并在有無(wú)校準(zhǔn)劑的情況下通過(guò)TWIMS計(jì)算CCS，但對(duì)于不同IM儀器實(shí)驗(yàn)結(jié)果之間的比較，以及不同實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)重復(fù)性和CCS計(jì)算結(jié)構(gòu)之間比較的研究不足[65-66]。

IM-MS用于蛋白質(zhì)復(fù)合物的nMS研究范圍很廣泛，從結(jié)構(gòu)建模到功能性研究，其中最近頗受關(guān)注的是抗原表位測(cè)定，利用IM分離識(shí)別抗原表位復(fù)合物[67]或纖維和淀粉樣蛋白的形成[68]。

4.2 毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜

毛細(xì)管電泳(CE)與質(zhì)譜聯(lián)用接口的發(fā)展[69-71]，使CE-nMS成為一種用于檢測(cè)完整蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)復(fù)合物的有力工具[72]。一方面，常規(guī)CE與nMS聯(lián)用可用于區(qū)分不同的蛋白質(zhì)；另一方面，新開(kāi)發(fā)的CE-nMS可用于測(cè)定蛋白質(zhì)高階結(jié)構(gòu)信息。

圖5 不同離子遷移譜的結(jié)構(gòu)、加電方式及主要功能[55]Fig.5 Variations of IMS technology with representative descriptions of applied field and gas dynamics[55]

圖6 用于nMS的安捷倫6560 DTIM-QTOF改裝[61]Fig.6 Agilent 6560 DTIM-QTOF modified for native mass spectrometry[61]

1999年，He等[76]提出通過(guò)CZE-MS能夠分離還原和氧化形式的細(xì)胞色素C，并進(jìn)行準(zhǔn)確的定量分析。Taverna等[77]將CZE-nMS應(yīng)用于分離和表征抗凝血酶的各種構(gòu)象，其中只有天然構(gòu)象具有生物活性，因此，通過(guò)CZE-nMS將天然構(gòu)象與其他構(gòu)象分離，檢測(cè)其他構(gòu)象的存在，可以確定抗凝血酶藥物的療效。同時(shí)，有報(bào)道[79-80]應(yīng)用CZE-nMS技術(shù)對(duì)治療性單克隆抗體進(jìn)行表征，并實(shí)現(xiàn)了其變體及聚合物的鑒定。最近，Joo?等[81]對(duì)如何獲取高質(zhì)量CZE-nMS數(shù)據(jù)給出了詳細(xì)的教程以及優(yōu)化的操作程序。

4.2.2淌度電泳-非變性質(zhì)譜 2019年，本課題組[83]基于毛細(xì)管電泳和離子淌度提出了一種液相“IM”技術(shù)——淌度電泳 (MCE)。MCE使用壓力驅(qū)動(dòng)的恒流取代傳統(tǒng)毛細(xì)管電泳的電滲流(EOF)作為驅(qū)動(dòng)力，并施加與毛細(xì)管內(nèi)形成層流場(chǎng)反向的分離電場(chǎng)，根據(jù)離子的有效電荷與流體動(dòng)力學(xué)半徑之比進(jìn)行分離。

MCE-nMS聯(lián)用技術(shù)能夠提供新的分離維度，MCE可將泰勒擴(kuò)散分析(TDA)和電動(dòng)擴(kuò)散(EKD)與毛細(xì)管電泳結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了與蛋白質(zhì)高階結(jié)構(gòu)相關(guān)參數(shù)(有效電荷與流體動(dòng)力學(xué)半徑)的測(cè)定[82,84-85]。研究表明[74-75]，質(zhì)譜圖中蛋白質(zhì)的電荷態(tài)分布能夠反映其溶劑可及表面積(SASA)和電噴霧電離前在溶液中的折疊構(gòu)象，因此MCE-nMS還可用于測(cè)定液相中蛋白質(zhì)的SASA。將MCE-nMS實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與蛋白質(zhì)橢球近似結(jié)構(gòu)的算法相結(jié)合，可以進(jìn)一步得到蛋白質(zhì)的三維形狀和半徑，示于圖7。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)還可作為分子動(dòng)力學(xué)仿真的限制條件，用來(lái)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)可能的構(gòu)象[82,84-85]。與IM-nMS相比，MCE-nMS可直接在液相中測(cè)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)參數(shù)，其結(jié)果更能反映蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象，有利于在近生理?xiàng)l件下研究蛋白質(zhì)相互作用。

Zhang等[85]應(yīng)用MCE-nMS監(jiān)測(cè)了胰島素二硫鍵還原過(guò)程，還原產(chǎn)物A鏈、B鏈和胰島素通過(guò)MCE分離，隨后進(jìn)行nMS檢測(cè)，計(jì)算得到三者的流體動(dòng)力學(xué)半徑，結(jié)合分子動(dòng)力學(xué)仿真給出胰島素還原后最可能的構(gòu)象，驗(yàn)證了鏈內(nèi)二硫鍵不易被還原。Wu等[82]引入了蛋白質(zhì)3D橢球近似的理論與方法，進(jìn)一步拓展了MCE-nMS表征蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)復(fù)合物高階結(jié)構(gòu)的能力，并測(cè)定其橢球模型尺寸，結(jié)果與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(PDB)的晶體結(jié)構(gòu)一致。MCE-nMS能通過(guò)測(cè)定結(jié)合常數(shù)和化學(xué)計(jì)量來(lái)表征蛋白質(zhì)相互作用[86-88]。Hong等[89]探索了應(yīng)用MCE-nMS研究蛋白質(zhì)與配體結(jié)合的可行性，以三乙酰殼三糖與溶菌酶和細(xì)胞色素C的結(jié)合為例，測(cè)定了無(wú)結(jié)合蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)復(fù)合物的尺寸差異，并結(jié)合分子動(dòng)力學(xué)仿真預(yù)測(cè)了蛋白質(zhì)復(fù)合物最可能的構(gòu)象。

圖7 MCE-nMS表征球狀蛋白質(zhì)的橢球近似模型[82]Fig.7 MCE-nMS procedures to characterize the ellipsoid shape of a globular protein[82]

5 總結(jié)與展望

本文綜述了近年來(lái)非變性質(zhì)譜在儀器方面的突破。目前，nMS已成為研究蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)復(fù)合物的重要工具，除了能夠提供基本的化學(xué)計(jì)量信息，還能夠提供蛋白質(zhì)復(fù)合物的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)相互作用信息。nMS可以研究其他方法難以表征的蛋白質(zhì)復(fù)合物，或結(jié)合核磁共振、X-射線晶體學(xué)和冷凍電鏡等技術(shù)對(duì)原表征不足的蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)構(gòu)模型進(jìn)行改進(jìn)完善[90]。同時(shí)，nMS與IM的結(jié)合顯著提高了研究蛋白質(zhì)復(fù)合物構(gòu)象的能力[6,54,91]，也為解釋蛋白質(zhì)復(fù)合物的液相天然結(jié)構(gòu)特征能否在氣相中保持不變這一問(wèn)題提供了新思路。MCE技術(shù)能夠直接在液相環(huán)境中獲取蛋白質(zhì)復(fù)合物的天然結(jié)構(gòu)信息，其高效的分離能力與MS準(zhǔn)確的測(cè)量能力相結(jié)合，極大地推動(dòng)了nMS對(duì)蛋白質(zhì)復(fù)合物和相互作用的研究。

盡管nMS取得了顯著進(jìn)展，但其發(fā)展仍面臨較多挑戰(zhàn)。在分析復(fù)雜樣品時(shí)，某些蛋白質(zhì)復(fù)合物需要高濃度添加物(如金屬離子、脂類(lèi)或其他與nMS不兼容的成分)來(lái)維持結(jié)構(gòu)的完整性，且在繁瑣的樣品純化過(guò)程中可能會(huì)造成蛋白質(zhì)復(fù)合物的低親和力或瞬時(shí)相互作用的丟失。比如在分析膜蛋白過(guò)程中，由于膜蛋白需要脂質(zhì)環(huán)境或去垢劑才能在水溶液中保持可溶，這樣的要求通常會(huì)影響膜蛋白的電離。近年來(lái)，通過(guò)質(zhì)譜儀內(nèi)的去垢劑膠束釋放，能夠?qū)ν暾牡鞍踪|(zhì)-脂類(lèi)復(fù)合物進(jìn)行檢測(cè)并研究其相互作用[60]；得益于納米尺寸nESI噴頭的出現(xiàn)，使用nMS技術(shù)能夠研究膜蛋白和配體的相互作用[92]。此外，進(jìn)一步提高IM分辨率也是未來(lái)的挑戰(zhàn)，這將有利于更好地分離和表征蛋白質(zhì)復(fù)合體及亞基的不同構(gòu)象，識(shí)別在質(zhì)荷比維度重合的離子，用于監(jiān)測(cè)動(dòng)態(tài)非共價(jià)相互作用中微小的構(gòu)象變化[53,59]。同時(shí)，提高nMS分析通量和易行性也是未來(lái)的研究方向。nMS作為研究蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)復(fù)合物的重要技術(shù)，連接并互補(bǔ)著結(jié)構(gòu)生物學(xué)和蛋白質(zhì)相互作用，有望將多種研究技術(shù)集成至單個(gè)儀器平臺(tái)對(duì)同一樣品進(jìn)行多項(xiàng)技術(shù)檢測(cè)。