基于納米毛細(xì)管的非變性質(zhì)譜分析

胡 軍，陳 蕓，陳洪淵，徐靜娟

(1.南京大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，生命分析化學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210023；2.南京醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 211166)

以蛋白質(zhì)為代表的生物大分子是生命體內(nèi)各種生理功能的主要執(zhí)行者，其功能的實(shí)現(xiàn)和動(dòng)態(tài)調(diào)控通常取決于其三維結(jié)構(gòu)及與多種分子間的弱相互作用過(guò)程[1]。因此，對(duì)蛋白質(zhì)及其復(fù)合物結(jié)構(gòu)的精準(zhǔn)解析和復(fù)雜作用網(wǎng)絡(luò)的揭示，既是理解構(gòu)效關(guān)系的基礎(chǔ)，也是認(rèn)知各種生命活動(dòng)過(guò)程，乃至是攻克一系列重大疾病的關(guān)鍵。傳統(tǒng)的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究通常利用X射線晶體學(xué)(X-raycrystallography)、核磁共振(NMR)和冷凍電鏡(cryo-EM)技術(shù)實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)等生物大分子的三維結(jié)構(gòu)測(cè)定[2]。與之相比，質(zhì)譜(MS)雖不能提供原子級(jí)分辨的精細(xì)三維結(jié)構(gòu)，但能方便、快捷地解析復(fù)雜基質(zhì)條件下蛋白質(zhì)與其他分子(如代謝物、脂質(zhì)、輔因子、藥物分子等)間的弱相互作用，是上述幾種表征方法的極佳互補(bǔ)，已成為當(dāng)前結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究不可或缺的重要技術(shù)手段[3]。近年來(lái)，該領(lǐng)域的迅速發(fā)展也催生出一門新興學(xué)科—?dú)庀嘟Y(jié)構(gòu)生物學(xué)(gas-phase structural biology)[4]。

電噴霧電離質(zhì)譜(ESI-MS)是氣相結(jié)構(gòu)生物學(xué)的技術(shù)基礎(chǔ)，其應(yīng)用于蛋白復(fù)合物的研究始于20世紀(jì)90年代。作為一種軟電離方式，電噴霧電離(ESI)能將蛋白質(zhì)等生物大分子從溶液中完整地轉(zhuǎn)移至氣相環(huán)境，但經(jīng)由非共價(jià)弱相互作用結(jié)合在一起的蛋白復(fù)合物在離子化過(guò)程中能否維持結(jié)構(gòu)不變?cè)诋?dāng)時(shí)仍頗有爭(zhēng)議[5]。Chait等[6]最早展示了完整血紅蛋白(hemoglobin)的ESI-MS分析結(jié)果，表明血紅素(heme)和珠蛋白(globin)之間的非共價(jià)弱相互作用確實(shí)能在ESI過(guò)程中得以保持。之后，研究人員對(duì)ESI技術(shù)和質(zhì)譜儀硬件進(jìn)行了持續(xù)的優(yōu)化和改進(jìn)，研發(fā)出多種既能與質(zhì)譜兼容，又能在離子化過(guò)程中較好地維持蛋白質(zhì)及其復(fù)合物的立體結(jié)構(gòu)和相互作用信息的溶液體系，并逐漸形成了非變性質(zhì)譜(native MS)的概念[7]。Native MS一詞最早于2004年見(jiàn)諸文獻(xiàn)[8]報(bào)道，其中native的內(nèi)涵可以從與非變性凝膠電泳(native PAGE)的類比中得到部分闡釋。簡(jiǎn)而言之，native MS致力于使用ESI-MS技術(shù)解析非變性緩沖溶液中非共價(jià)復(fù)合物(如大型蛋白質(zhì)組裝體、蛋白質(zhì)-藥物復(fù)合物、核酸-配體復(fù)合物等)的組成、結(jié)構(gòu)、結(jié)合計(jì)量比、結(jié)合常數(shù)及動(dòng)力學(xué)等信息[7-9]。經(jīng)過(guò)20余年的發(fā)展，基于native MS的結(jié)構(gòu)生物學(xué)已被學(xué)界廣為接受，并成為2015年美國(guó)質(zhì)譜年會(huì)的主題[10]。之后，國(guó)內(nèi)逐漸開(kāi)始將native MS正式譯為“非變性質(zhì)譜”。

長(zhǎng)期以來(lái)，基于微米毛細(xì)管的納噴霧電離(nano-ESI)一直是native MS的核心。2013年，Baker等[11]首次將開(kāi)口直徑<100 nm的納米毛細(xì)管引入ESI-MS。雖然在ESI-MS中的應(yīng)用不足10年，但得益于納米毛細(xì)管極高的離子化效率、抗基質(zhì)干擾能力以及對(duì)非特異性加合物形成的抑制等諸多特性，使其在native MS領(lǐng)域獲得了廣泛關(guān)注。本文重點(diǎn)介紹納米毛細(xì)管的制備與表征技術(shù)、電離行為特性及其機(jī)理，并回顧近10年來(lái)納米毛細(xì)管電噴霧電離在蛋白質(zhì)、核酸及其非共價(jià)復(fù)合物的非變性質(zhì)譜分析中的應(yīng)用。

1 納米毛細(xì)管的制備與表征

1.1 納米毛細(xì)管制備

通常使用微電極拉制儀對(duì)納米毛細(xì)管進(jìn)行次序加熱和拉制，基本原理示于圖1。以Sutter Instrument公司的Model P-2000激光拉制儀為例，其包含HEAT、FILAMENT、VELOCITY、DELAY和PULL等5項(xiàng)參數(shù)，分別對(duì)CO2激光加熱功率、加熱寬度、預(yù)拉制速度、硬拉延遲時(shí)間以及拉力大小進(jìn)行程序控制，且可使用多項(xiàng)參數(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)毛細(xì)管錐度、孔徑的精細(xì)調(diào)控。各項(xiàng)拉制參數(shù)對(duì)毛細(xì)管最終的錐度、孔徑等具體影響可參閱該公司的用戶手冊(cè)[12]。通常，在儀器狀態(tài)良好，且保持環(huán)境溫度、濕度恒定以及毛細(xì)管潔凈的情況下，毛細(xì)管孔徑的平均標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)可控制在5%以內(nèi)。常見(jiàn)的玻璃毛坯管材質(zhì)有硼硅酸鹽玻璃和石英玻璃2種，前者易于熔化加工、價(jià)格低廉，使用廣泛；后者質(zhì)地堅(jiān)硬、性質(zhì)穩(wěn)定，更易于制備尺寸極小的針尖，如孔徑小于20 nm的毛細(xì)管。

圖1 錐形納米毛細(xì)管的拉制示意圖[13]Fig.1 Fabrication of nanopipettes[13]

典型的納米毛細(xì)管結(jié)構(gòu)示于圖2，包含源自玻璃毛坯管的主干(stem)和逐漸縮小的肩部(shoulder)和脛部(shank)，以及微納尺度的針尖(tip)部分[14]。其中，主干部分的長(zhǎng)度通常在數(shù)厘米范圍，使這類微納毛細(xì)管的操縱和使用十分便捷；而錐形部分的尺寸則涵蓋了從毫米到微米、納米尺度的演變；除了改變拉制參數(shù)[12]，毛細(xì)管針尖的孔徑還可利用后期修飾或刻蝕進(jìn)行精細(xì)調(diào)控[15-16]。如Jin等[15]利用硅酸鈉水解法在針尖內(nèi)壁生長(zhǎng)SiO2(與石英玻璃同質(zhì))以進(jìn)一步減小其內(nèi)直徑，得到了開(kāi)口直徑僅為6.4 nm的納米毛細(xì)管。

1.2 納米毛細(xì)管表征

納米毛細(xì)管尖端的尺寸極小，已超出光學(xué)顯微表征的分辨極限，目前常用的表征方法主要包括掃描電子顯微鏡(SEM)、透射電子顯微鏡(TEM)和電化學(xué)。其中，SEM表征最常用，能直接獲得針尖的錐度、孔徑等形貌信息，但對(duì)樣品導(dǎo)電性有一定要求。常見(jiàn)的做法是在針尖濺射一層僅數(shù)納米厚度的金屬層(常用鉑、金等)以增強(qiáng)導(dǎo)電性。而TEM的空間分辨率更高，透射式的觀測(cè)模式甚至能獲得針尖內(nèi)壁鍍層的組成與形貌信息[17-19]。雖然TEM不嚴(yán)格要求導(dǎo)電性，但在高能電子束的轟擊下，玻璃針尖會(huì)迅速解構(gòu)變形，示于圖3，從而無(wú)法準(zhǔn)確獲得其幾何形貌信息。Watanabe等[20]發(fā)現(xiàn)使用導(dǎo)電碳膜包覆的銅網(wǎng)進(jìn)行制樣，同時(shí)使用TEM的低電子劑量(minimum dose)模式，可以有效避免針尖解構(gòu)畸變，實(shí)現(xiàn)超小針尖(<10 nm)的形貌表征，示于圖3。

注：a.錐形尖端的微觀結(jié)構(gòu)示意圖；b.錐形尖端的光學(xué)顯微照片；c.SEM顯微照片圖2 納米毛細(xì)管的形貌示意圖及其表征[14]Fig.2 Micrographs of nanopipettes[14]

圖3 納米毛細(xì)管針尖的TEM表征[20]Fig.3 Characterization of a nanopipettes via transmission electron microscope (TEM)[20]

基于電化學(xué)的電阻或電導(dǎo)測(cè)量也常用于毛細(xì)管孔徑的間接測(cè)算，且通常與電鏡表征結(jié)果有較好的一致性。納米毛細(xì)管內(nèi)的溶液電阻(R)與溶液電阻率(ρ)、針尖孔徑(rt)等關(guān)系示于式(1)[21-22]：

(1)

其中，rs、rt、θ等定義示于圖2a，通過(guò)簡(jiǎn)單的溶液電阻測(cè)量即可推算出針尖孔徑(rt)的大小。Moss等[23-24]的公式則更簡(jiǎn)潔，電阻(R)與溶液導(dǎo)電率(κ)、針尖孔徑(rt)及半錐角(θ)等的關(guān)系示于式(2)：

(2)

Unwin等[25]后續(xù)研究表明，基于該方程的有限元模擬結(jié)果與實(shí)驗(yàn)結(jié)果吻合度較好。因此，通過(guò)測(cè)量納米毛細(xì)管的電阻和錐角信息即可利用該方程推算出納米毛細(xì)管的孔徑。需要指出的是，上述2個(gè)方程在原理上無(wú)本質(zhì)區(qū)別，只是所選取的參數(shù)略有差異。

此外，針尖孔徑也可以根據(jù)液/液界面上的極限擴(kuò)散電流(id)進(jìn)行間接測(cè)算[26-27]，示于式(3)：

id=4f(θ)zFDCrt

(3)

其中，F(xiàn)、z、D、C分別是法拉第常數(shù)、發(fā)生界面轉(zhuǎn)移的離子電荷數(shù)、擴(kuò)散系數(shù)、濃度，f(θ)是半錐角θ的列表函數(shù)，具體可參考文獻(xiàn)[26-27]。與電鏡(SEM或TEM)表征相比，電化學(xué)表征無(wú)需復(fù)雜且耗時(shí)的制樣過(guò)程，且理論上對(duì)針尖孔徑大小沒(méi)有限制。例如，孔徑僅約1 nm的毛細(xì)管已遠(yuǎn)超電鏡方法的極限，只能通過(guò)電化學(xué)方法進(jìn)行間接測(cè)算[28]，但電化學(xué)方法使用的高濃度電解質(zhì)溶液難以完全清洗去除，通常表征后不再適合用于質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)。所幸的是，經(jīng)1次拉制即可得到2根幾何尺寸幾乎完全相同的毛細(xì)管，因此可將其中的1根用于表征，另1根用于具體實(shí)驗(yàn)。

2 納米毛細(xì)管電噴霧電離的基本特性

與傳統(tǒng)的微米毛細(xì)管相比，亞微米或者納米尺度的毛細(xì)管用作ESI噴針時(shí)，其電離行為表現(xiàn)出獨(dú)特的尺寸效應(yīng)，體現(xiàn)在噴霧起始電壓、噴霧流量、初始液滴尺寸、離子電荷分布、基質(zhì)耐受性、分子構(gòu)象、電遷移等方面，對(duì)這些尺寸效應(yīng)的認(rèn)知及其機(jī)理闡釋有助于評(píng)估納米毛細(xì)管電噴霧對(duì)特定研究體系的適用性。

2.1 起始電壓

納米毛細(xì)管的電噴霧起始電壓通常顯著低于開(kāi)口尺寸更大的微米毛細(xì)管，這可以從Smith等[29]推導(dǎo)的公式得到解釋，其指出了電噴霧起始電壓(Von)和噴針半徑(rt)、溶液表面張力(γ)、噴針尖端與質(zhì)譜入口距離(d)之間的關(guān)系，示于式(4)：

(4)

其中，ε0為真空介電常數(shù)，β為泰勒錐(Taylor cone)的半錐角(通常為49.3°)[30]。非變性質(zhì)譜分析中的溶劑通常為水，其在負(fù)離子模式下容易發(fā)生電暈放電(corona discharge)，進(jìn)而降低目標(biāo)分子的離子化效率；此外，電暈放電產(chǎn)生的活性氧還會(huì)造成生物分子的氧化損傷[31]。噴霧電壓的降低可有效避免電暈放電對(duì)離子化過(guò)程的不利影響，這也是納米毛細(xì)管噴霧的優(yōu)點(diǎn)之一。玻璃毛細(xì)管的結(jié)構(gòu)脆弱性要求不宜使用過(guò)高的電壓進(jìn)行噴霧，特別是納米毛細(xì)管尖端的玻璃壁僅幾十甚至幾納米厚，噴霧電壓的大小對(duì)其結(jié)構(gòu)的維持至關(guān)重要[32]。如，Baker等[11]發(fā)現(xiàn)使用相對(duì)較低的電壓(0.9 kV)時(shí)，噴霧前后的石英納米毛細(xì)管孔徑無(wú)明顯變化；而當(dāng)電壓提高至1.8 kV時(shí)，僅2 min后，孔徑即可從37 nm擴(kuò)大至65 nm。

2.2 噴霧流量

納米毛細(xì)管的噴霧流量通常顯著低于微米毛細(xì)管的噴霧流量。直徑1～2 μm毛細(xì)管的噴霧流量通常小于100 nL/min，即納噴霧(nanospray)[33]；而直徑 <100 nm毛細(xì)管的噴霧流量可低至皮升流量(< 1 nL/min)，即皮噴霧(picospray)[34]。Williams等[33]使用稱重法測(cè)量了噴霧一定時(shí)間后毛細(xì)管內(nèi)溶液的質(zhì)量變化，測(cè)得直徑約1 465 nm毛細(xì)管的噴霧流量約為54.78 nL/min，而直徑約244 nm毛細(xì)管的噴霧流量則僅約2.88 nL/min。然而，利用稱重法實(shí)現(xiàn)皮升級(jí)流量的準(zhǔn)確測(cè)定十分困難，這是因?yàn)樵谄婌F中，1 μL樣品的質(zhì)量?jī)H1 mg，但其噴霧時(shí)間卻長(zhǎng)達(dá)數(shù)十小時(shí)。因此，常用體積法測(cè)定皮噴霧流量，即通過(guò)顯微鏡拍攝、測(cè)算噴霧前后毛細(xì)管內(nèi)溶液的體積變化。如，Li等[34]利用該方法實(shí)現(xiàn)了納米毛細(xì)管中超低噴霧流量(< 10 pL/min)的測(cè)定。對(duì)于極微量樣品而言，納米毛細(xì)管的超低流量是有益的，其延長(zhǎng)的噴霧時(shí)間有利于串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)的采集，以實(shí)現(xiàn)復(fù)合物組成的解析。

2.3 離子電荷分布

利用納米毛細(xì)管分析蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子時(shí)，其產(chǎn)生的離子平均電荷數(shù)通常顯著高于尺寸更大的微米毛細(xì)管[11,35]。事實(shí)上，這種伴隨噴針直徑減小而離子平均電荷數(shù)增加的現(xiàn)象在微米尺度亦同樣適用。如Cole等[36]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)使用直徑5 μm噴針時(shí)，血管緊張素Ⅰ的離子以1+和2+的低電荷分布為主；當(dāng)噴針直徑減小至1 μm時(shí)，則以3+的高電荷分布為主。而尺寸更小的納米毛細(xì)管用于蛋白質(zhì)ESI-MS分析時(shí)，其產(chǎn)生的蛋白離子電荷態(tài)更高，甚至可與以對(duì)硝基苯甲醇(m-NBA)為代表的超級(jí)充電試劑(supercharging reagent)的效果相媲美[37-38]。離子電荷態(tài)越高，通常其碎裂所需的能量越低，且更易于產(chǎn)生豐富的碎片離子，因此有利于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析。

一般認(rèn)為，電噴霧產(chǎn)生的初始液滴尺寸與噴針開(kāi)口直徑相關(guān)，當(dāng)使用微米毛細(xì)管時(shí)，前者通常不到后者的1/10[39-42]。雖然目前尚無(wú)精準(zhǔn)測(cè)定的報(bào)道，但納米毛細(xì)管電噴霧產(chǎn)生的初始噴霧液滴尺寸通常被認(rèn)為應(yīng)遠(yuǎn)小于傳統(tǒng)微米毛細(xì)管產(chǎn)生的初始噴霧液滴尺寸[34-35,40]。初始帶電液滴的尺寸越小，其荷電量與體積的比值越大，這也是納米毛細(xì)管電噴霧中離子具有較高電荷態(tài)的原因之一。

2.4 非特異性加合

圖4 納米毛細(xì)管對(duì)蛋白質(zhì)和鈉離子非特異性加合物形成的抑制效應(yīng)[35]Fig.4 Effect of nanoemitters on suppressing the non-specific metal adduction to protein[35]

得益于極小的初始液滴尺寸，納米毛細(xì)管能顯著減少甚至完全避免電噴霧電離過(guò)程中蛋白質(zhì)與金屬離子、配體等分子間的非特異性結(jié)合，示于圖4[35]。以常見(jiàn)于各種緩沖溶液中的鈉離子為例，其對(duì)蛋白質(zhì)ESI-MS分析的不利影響來(lái)自多個(gè)方面[43]：1) 作為非揮發(fā)性鹽，Na+具有離子抑制效應(yīng)，能顯著抑制蛋白質(zhì)等目標(biāo)分子的離子化，降低其總信號(hào)強(qiáng)度[43]；2) 在去溶劑過(guò)程中，Na+能與蛋白質(zhì)中的負(fù)電性基團(tuán)(如天冬門氨酸、谷氨酸以及肽鏈羧基端的R—COO-)通過(guò)靜電相互作用形成加合物[43-44]，使得蛋白質(zhì)的質(zhì)譜峰分散，進(jìn)一步降低信號(hào)強(qiáng)度與信噪比；3) 高濃度的非揮發(fā)性鹽還易形成鹽簇峰，嚴(yán)重干擾甚至完全掩蓋蛋白質(zhì)的質(zhì)譜峰[45]。納米毛細(xì)管能從多方面改善非揮發(fā)性鹽溶液中目標(biāo)蛋白質(zhì)分子的ESI-MS分析性能。首先，得益于更小的初始液滴尺寸，蛋白質(zhì)與Na+等金屬陽(yáng)離子的非特異性加合能被顯著抑制。以150 mmol/L NaCl、5 μmol/L蛋白質(zhì)的水溶液為例，平均直徑85 nm的液滴在概率上剛好包含1個(gè)蛋白質(zhì)分子，此時(shí)Na+數(shù)量約為30 000；而當(dāng)液滴尺寸減少至30 nm時(shí)，雖然大部分液滴中都不含有蛋白質(zhì)分子(即平均每22個(gè)液滴才含有1個(gè)蛋白質(zhì)分子)，但恰好含有1個(gè)蛋白質(zhì)分子液滴的Na+數(shù)量?jī)H約為1 400[40]，這是納米毛細(xì)管能顯著減少電噴霧中蛋白質(zhì)與金屬陽(yáng)離子間的非特異性加合的原因之一。此外，尺寸較大的帶電液滴需經(jīng)歷多個(gè)“溶劑蒸發(fā)”和“液滴碎裂”過(guò)程才能最終形成氣相離子，伴隨著的是非揮發(fā)性鹽的顯著濃縮，這也是電噴霧中蛋白質(zhì)易與金屬離子形成非特異性加合物的重要原因[35,44,46]。而在納米毛細(xì)管電噴霧中，由于初始帶電液滴尺寸極小，Williams等[47]甚至推測(cè)蛋白質(zhì)分子能從納米毛細(xì)管直接噴射出來(lái)，因此由于多步“溶劑蒸發(fā)”和“液滴碎裂”過(guò)程導(dǎo)致的溶質(zhì)濃縮效應(yīng)在納米毛細(xì)管電噴霧中不顯著，這也是其能抑制非特異性加合物形成的重要原因[35,40]。

2.5 基質(zhì)耐受性

除了對(duì)非特異性加合物形成的抑制效應(yīng)，納米毛細(xì)管電噴霧還具備極佳的抗基質(zhì)干擾能力。通常，溶液中除目標(biāo)分子以外的其他成分都可稱為基質(zhì)，其對(duì)目標(biāo)分子電離的不利影響可統(tǒng)稱為基質(zhì)干擾。納米毛細(xì)管實(shí)現(xiàn)高靈敏分析的原因：一方面源自其產(chǎn)生的初始液滴尺寸極小，具有較高的電荷/體積比，有利于目標(biāo)蛋白分子的離子化，因而能改善非揮發(fā)性鹽等的離子抑制效應(yīng)[11]；另一方面，小尺寸初始液滴中非揮發(fā)性鹽等基質(zhì)的絕對(duì)含量更低，鹽簇峰的形成顯著減少，其對(duì)目標(biāo)分子的譜峰干擾和掩蓋更少，有利于實(shí)現(xiàn)復(fù)雜基質(zhì)環(huán)境下蛋白質(zhì)等生物分子的高靈敏檢測(cè)[40]。通常，大型蛋白質(zhì)組裝體、蛋白質(zhì)-藥物復(fù)合物結(jié)合狀態(tài)的維系往往需要生理或者近生理的離子強(qiáng)度和pH值環(huán)境[48]，所使用的高濃度非揮發(fā)性緩沖鹽對(duì)ESI-MS的分析性能影響極大[40,49]。對(duì)基質(zhì)尤其是非揮發(fā)性鹽的耐受能力是納米毛細(xì)管電噴霧最重要的特性，為這些極具挑戰(zhàn)的樣品分析提供有效的技術(shù)基礎(chǔ)，是其在native MS領(lǐng)域廣受關(guān)注的根本原因。

2.6 蛋白質(zhì)與玻璃內(nèi)壁的相互作用

納米毛細(xì)管的諸多特性對(duì)native MS亦非總是有利，如前文提及的蛋白離子高電荷態(tài)現(xiàn)象。ESI-MS中，蛋白離子的電荷態(tài)通常被認(rèn)為是反映蛋白質(zhì)構(gòu)象狀態(tài)的指針[33,50-51]。以細(xì)胞色素c(cyt c)為例，其在中性pH值下呈緊湊折疊的球狀構(gòu)象，非變性質(zhì)譜分析所得的質(zhì)譜峰通常應(yīng)為介于6+～10+的低電荷分布。然而，納米毛細(xì)管電噴霧所得的cyt c離子常為大于10+的高電荷分布，意味著其通過(guò)毛細(xì)管時(shí)構(gòu)象發(fā)生了改變，從緊湊折疊部分轉(zhuǎn)變?yōu)槿フ郫B構(gòu)象[11,35,52]。Mortensen等[52]對(duì)該現(xiàn)象進(jìn)行了細(xì)致的研究，指出cyt c等正電性蛋白質(zhì)分子通過(guò)納米毛細(xì)管時(shí)與帶負(fù)電玻璃內(nèi)壁的靜電相互作用導(dǎo)致了去折疊過(guò)程，示于圖5。類似的靜電相互作用還體現(xiàn)在正電性蛋白質(zhì)在玻璃內(nèi)壁上的吸附，結(jié)果是cyt c等正電性蛋白質(zhì)在界面吸附飽和之前完全無(wú)法測(cè)得任何質(zhì)譜信號(hào)[53]。通過(guò)對(duì)玻璃內(nèi)壁的界面修飾、改性，可有效避免上述靜電相互作用的不利影響[54]。

圖5 蛋白與玻璃內(nèi)壁的相互作用導(dǎo)致蛋白發(fā)生去折疊[52]Fig.5 Surface-induced protein unfolding in submicron electrospray emitters[52]

2.7 濃差極化

在靜電場(chǎng)下，玻璃毛細(xì)管中的物質(zhì)輸運(yùn)方向取決于電泳和電滲流(EOF)的矢量和。但與常規(guī)EOF有所不同，伴隨著噴霧的進(jìn)行，毛細(xì)管內(nèi)體相溶液的運(yùn)動(dòng)總是朝向針尖(質(zhì)譜入口)方向。而由于荷電離子的電遷移方向和速率(離子淌度)不同，在微納毛細(xì)管電噴霧中，常能在針尖觀察到顯著的濃差極化現(xiàn)象，體現(xiàn)為不同荷電性分子的質(zhì)譜信號(hào)隨時(shí)間增強(qiáng)或減弱的變化[55]。依據(jù)不同溶質(zhì)分子電遷移速率的不同，可在電噴霧過(guò)程中實(shí)現(xiàn)在線分離。如Wei等[45,56]利用梯度電場(chǎng)實(shí)現(xiàn)了基質(zhì)尤其是非揮發(fā)性鹽與蛋白質(zhì)、多肽等分子的有效分離，能在高濃度的緩沖鹽溶液中實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)、多肽等高靈敏質(zhì)譜檢測(cè)。納米毛細(xì)管電噴霧的流量較微米毛細(xì)管要低很多，因此由荷電離子的電泳運(yùn)動(dòng)引起的濃差極化現(xiàn)象通常更顯著，示于圖6，進(jìn)而有可能造成相對(duì)定量、蛋白質(zhì)-藥物復(fù)合物的結(jié)合狀態(tài)等分析結(jié)果的誤差，應(yīng)在相關(guān)的定量研究中予以考慮與評(píng)估。

圖6 高壓電場(chǎng)下納米毛細(xì)管內(nèi)離子的濃差極化現(xiàn)象[55]Fig.6 Ion concentration (depletion or enrichment) in a nanoscale electrospray emitter under high-voltage field[55]

3 納米毛細(xì)管電噴霧在非變性質(zhì)譜中的應(yīng)用

非變性質(zhì)譜要求在電噴霧電離中盡可能地保持蛋白質(zhì)及其復(fù)合物的三維構(gòu)象和結(jié)合狀態(tài)，這是納米毛細(xì)管用于非變性質(zhì)譜分析的前提。Wysocki等[57]利用離子遷移譜和表面誘導(dǎo)解離等技術(shù)，詳細(xì)對(duì)比了直徑分別為80 nm和9 μm毛細(xì)管產(chǎn)生的蛋白質(zhì)離子的電荷態(tài)分布、碰撞截面積和碎裂模式，發(fā)現(xiàn)納米毛細(xì)管和常規(guī)微米毛細(xì)管產(chǎn)生的蛋白質(zhì)離子在結(jié)構(gòu)上具有高度的相似性，表明使用合適的緩沖溶液體系時(shí)，納米毛細(xì)管電噴霧能在離子化過(guò)程中較好地保持蛋白質(zhì)及其復(fù)合物的三維構(gòu)象和結(jié)合狀態(tài)。近年來(lái)，基于納米毛細(xì)管的ESI-MS已廣泛用于生理或近生理緩沖溶液中蛋白質(zhì)的直接檢測(cè)、蛋白質(zhì)-配體親和力的直接測(cè)量、大規(guī)模潛在成藥分子的快速篩選、寡核苷酸的直接質(zhì)譜分析等領(lǐng)域。

3.1 生理或近生理緩沖溶液中蛋白質(zhì)的直接檢測(cè)

目前，native MS中常用的醋酸銨緩沖溶液雖能提供足夠的離子強(qiáng)度，但有研究[58]指出，醋酸銨并不具備中性pH值范圍內(nèi)的緩沖能力。而傳統(tǒng)生化緩沖體系中的非揮發(fā)性鹽對(duì)蛋白質(zhì)的離子化存在極大的抑制效應(yīng)，因此不經(jīng)除鹽處理的直接質(zhì)譜分析難度極大。此前，本課題組首次報(bào)道了～120 nm毛細(xì)管噴針能有效減少ESI-MS中多肽、蛋白質(zhì)與金屬陽(yáng)離子間的非特異性加合，顯著改善ESI-MS的基質(zhì)耐受性[35]。Williams等[40]利用～0.5 μm毛細(xì)管實(shí)現(xiàn)了離子強(qiáng)度100～200 mmol/L生理緩沖溶液中蛋白質(zhì)的直接檢測(cè)，無(wú)需任何除鹽操作。與之相比，～1.6 μm微米噴針?biāo)玫馁|(zhì)譜圖中幾乎全是鹽簇峰，少有可辨別的蛋白質(zhì)信號(hào)。隨后，該課題組[49]將可分析的溶液體系進(jìn)一步拓展至磷酸鹽(PBS)、哌嗪-1,4-二乙磺酸(PIPES)、3-(N-嗎啉基)丙磺酸(MOPS)、4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)、三羥甲基氨基甲烷(TRIS)、2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)等生化實(shí)驗(yàn)常用的緩沖體系(示于圖7)，除水溶性蛋白外，還利用～0.5 μm噴針實(shí)現(xiàn)了膜蛋白的直接分析[47]。通常，膜蛋白的水溶性較差，常使用表面活性劑輔助溶解。然而，離子型和非離子型表面活性劑對(duì)膜蛋白的離子化存在顯著的抑制效應(yīng)，同時(shí)表面活性劑與膜蛋白的加合還會(huì)使蛋白質(zhì)的譜峰展寬，進(jìn)一步降低其信噪比。因此，使用傳統(tǒng)微米毛細(xì)管噴針通常無(wú)法實(shí)現(xiàn)復(fù)雜基質(zhì)中膜蛋白的直接質(zhì)譜分析。與之相比，～0.5 μm亞微米噴針則成功實(shí)現(xiàn)了從含有150 mmol/L NaCl、25 mmol/L Tris-HCl以及1.1%辛烷基葡糖苷溶液中直接檢出膜蛋白，無(wú)需任何除鹽或分離等前處理步驟[47]。

圖7 生理或近生理緩沖溶液中蛋白質(zhì)的直接質(zhì)譜檢測(cè)[49]Fig.7 Mass spectra of proteins from solutions at or near physiological ionic strength[49]

需要指出的是，上述研究雖然實(shí)現(xiàn)了生理或近生理緩沖溶液中蛋白質(zhì)分子的直接檢測(cè)，但僅是實(shí)現(xiàn)了蛋白譜峰的電荷分辨，金屬離子、表面活性劑等對(duì)蛋白的非特異性加合仍十分嚴(yán)重，表現(xiàn)為所測(cè)得的蛋白分子質(zhì)量通常遠(yuǎn)大于其理論值。

3.2 蛋白質(zhì)-配體親和力的直接測(cè)量

非揮發(fā)性鹽常用于穩(wěn)定蛋白質(zhì)-配體復(fù)合物的結(jié)構(gòu)與結(jié)合狀態(tài)。得益于基質(zhì)耐受性以及對(duì)非特異性加合的抑制，基于亞微米和納米毛細(xì)管的ESI-MS可用于蛋白質(zhì)與配體分子間親和力(解離常數(shù)Kd)的直接測(cè)量。Donald等[59]發(fā)現(xiàn)毛細(xì)管直徑從～2 μm逐步減小至～250 nm時(shí)，蛋白質(zhì)及其與配體復(fù)合物的譜峰質(zhì)量得到顯著改善，可滿足定量分析要求。而得益于質(zhì)譜的多組分同時(shí)檢測(cè)能力，實(shí)現(xiàn)了從1張質(zhì)譜圖中直接測(cè)算碳酸酐酶與多達(dá)6種配體分子的親和力數(shù)據(jù)。Klassen等[60]利用直徑～50 nm毛細(xì)管進(jìn)一步將蛋白質(zhì)與配體間親和力的直接精準(zhǔn)測(cè)量從此前的μmol/L級(jí)拓展至更弱的mmol/L級(jí)，此項(xiàng)定量研究表明納米毛細(xì)管電噴霧能在離子化過(guò)程中很好地保持蛋白質(zhì)-配體間僅mmol/L級(jí)的非共價(jià)弱相互作用。但值得指出的是，這些工作仍使用了醋酸銨部分或全部替換常規(guī)生化緩沖體系中的非揮發(fā)性鹽，以改善質(zhì)譜峰的質(zhì)量，對(duì)于生理或近生理溶液中蛋白質(zhì)-配體間親和力的直接測(cè)算仍存在困難。

3.3 潛在成藥分子的快速篩選

天然產(chǎn)物是指從自然界的動(dòng)物、植物及微生物中分離、提純得到的代謝物，其種類繁多、結(jié)構(gòu)多樣，是藥物研發(fā)中獲得先導(dǎo)化合物的重要來(lái)源[61]。水楊苷、奎寧、青蒿素、紫杉醇等一系列結(jié)構(gòu)新穎、生物活性強(qiáng)的天然產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)和利用是現(xiàn)代藥學(xué)發(fā)展過(guò)程中重要的里程碑，對(duì)人類健康產(chǎn)生了深遠(yuǎn)影響。然而，天然產(chǎn)物浩如煙海，其中活性組分的快速、高通量篩選充滿挑戰(zhàn)[62]。最近，Donald課題組[63]利用非變性質(zhì)譜技術(shù)開(kāi)發(fā)了從天然產(chǎn)物中快速篩選活性分子的方法，其流程示于圖8a。該方法直接利用天然植物的提取物作為分子庫(kù)，將其與靶蛋白(如碳酸酐酶)混合，隨后利用凝膠過(guò)濾法除去提取物中未與靶蛋白結(jié)合的組分，再利用基于納米毛細(xì)管的非變性質(zhì)譜對(duì)新形成的復(fù)合物進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)，利用串聯(lián)質(zhì)譜還可方便地鑒定復(fù)合物中的活性小分子。該方法無(wú)需對(duì)提取物進(jìn)行復(fù)雜且耗時(shí)的分離提純，1次實(shí)驗(yàn)即可從包含上千種分子的天然產(chǎn)物提取物中快速鑒定出可能的活性分子，極大地提升了潛在藥物分子的篩選效率。

圖8 天然產(chǎn)物中活性分子的快速native MS篩選[63]Fig.8 Multiplexed screening of thousands of natural products for protein-ligand binding via native MS[63]

3.4 高濃度非揮發(fā)性鹽溶液中核苷酸的直接質(zhì)譜分析

與蛋白質(zhì)分子類似，核苷酸的三維結(jié)構(gòu)及其與配體(藥物分子、輔因子等)間的弱相互作用同樣廣泛受到溶液中金屬離子的調(diào)控[64]。一方面，正電性的金屬陽(yáng)離子(如Na+、K+等)能通過(guò)與核苷酸骨架上負(fù)電性的磷酸基團(tuán)間的靜電相互作用，削弱核苷酸分子內(nèi)及分子間的靜電排斥，促進(jìn)分子折疊以形成發(fā)卡(hairpin)、雙螺旋(duplex)、三螺旋(triplex)、G-四鏈體(G-quadruplex)、i-Motif等高級(jí)結(jié)構(gòu)；另一方面，金屬陽(yáng)離子也能通過(guò)與核酸分子的配位相互作用促進(jìn)高級(jí)結(jié)構(gòu)(特別是G-四鏈體)的形成并使其穩(wěn)定化[65]。此外，Mg2+等還能在磷酸基團(tuán)間形成鹽橋(salt bridge)，實(shí)現(xiàn)對(duì)核酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的長(zhǎng)程調(diào)控[66]。由于核酸分子含有大量的磷酸基團(tuán)，其在中性pH值下整體帶負(fù)電，因此常使用負(fù)離子模式進(jìn)行質(zhì)譜分析，這與蛋白質(zhì)分析時(shí)常使用正離子模式有所不同。然而，即便是在負(fù)離子模式下，溶液中的金屬陽(yáng)離子對(duì)核酸分子的檢測(cè)仍存在極大的干擾和抑制。Fabris等[67]對(duì)比研究了1.4 μm和0.6 μm噴針?lè)治龈邼舛确菗]發(fā)性鹽(1～20 mmol/L NaCl)溶液中寡核苷酸時(shí)的性能表現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)亞微米噴針?biāo)玫馁|(zhì)譜圖中不僅鹽簇峰極大地減少，寡核苷酸的信號(hào)強(qiáng)度以及譜峰信噪比也較微米噴針有數(shù)倍的提升。此外，寡核苷酸與金屬陽(yáng)離子(Mg2+和Na+等)間的非特異性加合在亞微米噴針下也得以顯著減少，這對(duì)Mg2+與核酸之間特異性結(jié)合的識(shí)別十分有益。這些現(xiàn)象與正離子模式下分析蛋白質(zhì)時(shí)十分類似，表明了小尺寸噴針在改善基質(zhì)抑制效應(yīng)、減少非特異性加合等方面的普適性。

Donald等[68]使用～250 nm噴針進(jìn)一步研究了紡錘菌素(netropsin)和發(fā)卡DNA間的結(jié)合機(jī)理。紡錘菌素是第一個(gè)被鑒定的能特異性結(jié)合在DNA小溝區(qū)(minor groove)的小分子[69]，但其與DNA分子的結(jié)合模式存有一定爭(zhēng)議，文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)合模式主要包括與發(fā)卡結(jié)構(gòu)結(jié)合的2M機(jī)理(two modes (2M) mechanism)[70]以及結(jié)合誘導(dǎo)發(fā)卡結(jié)構(gòu)向雙螺旋轉(zhuǎn)變的HD機(jī)理(hairpin-to-duplex (HD) transition mechanism)[71]。得益于亞微米噴針的使用，他們從高質(zhì)量的質(zhì)譜數(shù)據(jù)中定量分析紡錘菌素與發(fā)卡DNA的結(jié)合情況，并發(fā)現(xiàn)了紡錘菌素的結(jié)合并不會(huì)顯著改變發(fā)卡與雙螺旋結(jié)構(gòu)的比例等不符合2M和HD機(jī)理的現(xiàn)象。據(jù)此提出了紡錘菌素與發(fā)卡結(jié)構(gòu)、雙螺旋結(jié)構(gòu)同時(shí)結(jié)合的SB機(jī)理(“simultaneously” bind (SB) mechanism)，表明了非變性質(zhì)譜在核酸與配體相互作用機(jī)理研究中的重要價(jià)值。

雖然亞微米毛細(xì)管能顯著提升高濃度非揮發(fā)性鹽溶液中核酸的質(zhì)譜檢出性能，但仍不足以完全抑制金屬陽(yáng)離子與核酸分子間的非特異性加合現(xiàn)象，因而限制了對(duì)諸如G-四鏈體等復(fù)合物中金屬陽(yáng)離子(如K+等)配位情況的準(zhǔn)確解析。針對(duì)這一挑戰(zhàn)，本課題組提出了一種聯(lián)合策略，即同時(shí)利用～70 nm納米毛細(xì)管、低流量干燥氣流以及使用乙酸三甲基銨部分替代非揮發(fā)性鹽，最終實(shí)現(xiàn)了對(duì)非特異性加合的完全抑制，能直接從生理或近生理離子強(qiáng)度溶液中準(zhǔn)確識(shí)別G-四聯(lián)體內(nèi)K+、Na+配位數(shù)及其配位模式[72]。

4 總結(jié)與展望

基于納米毛細(xì)管的非變性質(zhì)譜技術(shù)可以直接從生理或近生理的緩沖溶液中，在不破壞完整蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)構(gòu)和結(jié)合狀態(tài)的情況下，從分子層面獲取其組成、結(jié)合動(dòng)力學(xué)等信息，已廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)-配體間的弱相互作用、潛在藥物分子的快速篩選等領(lǐng)域。納米毛細(xì)管的引入為電噴霧電離質(zhì)譜帶來(lái)了前所未有的基質(zhì)耐受性，極大地拓寬了非變性質(zhì)譜的應(yīng)用范圍，是該領(lǐng)域近年來(lái)最重要的技術(shù)進(jìn)步。然而，濃差極化、蛋白與玻璃內(nèi)壁的界面相互作用(蛋白質(zhì)的去折疊、吸附等)造成的不利影響仍需要在具體研究中予以考慮并設(shè)法避免。此外，當(dāng)前基于納米毛細(xì)管的非變性質(zhì)譜在通用性上仍存在較大的局限。首先，納米毛細(xì)管的小尺寸特性使其極易發(fā)生堵塞；其次，納米毛細(xì)管的噴霧流量極低，難以與液相色譜、毛細(xì)管電泳等分離技術(shù)結(jié)合；此外，納米毛細(xì)管電噴霧的電離行為對(duì)所使用的電離參數(shù)(電壓、溫度、距離、干燥氣流量等)極為敏感，實(shí)際操作中往往需要進(jìn)行細(xì)致調(diào)優(yōu)才能獲得較好的分析性能。納米毛細(xì)管的尺寸效應(yīng)和界面性質(zhì)是其電離行為特性的根源，通過(guò)精準(zhǔn)的尺寸控制、界面修飾與功能化，有望進(jìn)一步優(yōu)化納米毛細(xì)管電噴霧電離質(zhì)譜的分析性能，促進(jìn)其在大型蛋白質(zhì)組裝體、蛋白質(zhì)-藥物復(fù)合物等樣品分析中的應(yīng)用研究。