克羅諾桿菌屬快速檢測技術(shù)的研究進展

◎ 林 杰

（廈門市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗院，福建 廈門 361004）

克羅諾桿菌是一種危險性極高的致病菌。有研究表明，嬰幼兒奶粉、奶酪、腌肉、飲用水和蔬菜等多種日常食品中均可能檢測出此種致病菌[1]。在一些新生兒克羅諾桿菌感染事件的調(diào)查結(jié)果中，這些受感染的新生兒都是食用了嬰幼兒奶粉后才出現(xiàn)了相關(guān)癥狀，經(jīng)檢測確定為克羅諾桿菌感染。近年來，隨著一系列與此種病菌相關(guān)的奶粉召回以及其他重大事件的爆發(fā)，克羅諾桿菌污染問題已經(jīng)受到了全世界的廣泛關(guān)注?；诖耍接懭绾慰焖偻瓿蓪κ称分惺欠窈锌肆_諾桿菌檢測的必要性。

1 克羅諾桿菌

克羅諾桿菌原名阪崎腸桿菌，在人和動物的腸道內(nèi)生活，屬于兼性厭氧革蘭氏陰性桿菌，隸屬于腸桿菌科?？肆_諾桿菌是一種致病劑量較低的食源性致病菌，廣泛存在于嬰幼兒奶粉、肉類、飲用水和蔬菜中。寄生在人和動物的腸道之后（是一種有周生鞭毛，能運動的無芽孢桿菌），可引起菌血癥、腦膜炎、壞死性小腸結(jié)腸炎等疾病。近年來發(fā)生的多起克羅諾桿菌感染事件表明，嬰幼兒是該菌感染的高危人群，一旦引發(fā)相關(guān)疾病，致死率最高可達80%。目前，已經(jīng)探明的克羅諾桿菌共有7個菌種，分別為阪崎克羅諾桿菌、丙二酸鹽克羅諾桿菌、蘇黎世克羅諾桿菌、莫金斯克羅諾桿菌、康帝蒙提克羅諾桿菌、尤尼沃斯克羅諾桿菌和都柏林克羅諾桿菌（可進一步分為都柏林亞種、奶粉亞種、洛桑亞種）。

目前，世界各國已經(jīng)從分類、分型、檢測、生化特性、致病性和污染源等方面對克羅諾桿菌進行研究，結(jié)果表明，與其他食源性致病菌相比，該菌對絕大多數(shù)人都不存在致病性，即使攝入人體內(nèi)，也能夠在腸道內(nèi)與其他菌群“和諧相處”。但對包含嬰幼兒在內(nèi)的一些特定人群，克羅諾桿菌的致病率和致死率卻較高，而目前學界尚未探明克羅諾桿菌因何原因致特定人群感染嚴重疾病?；诖耍荒懿扇　耙坏肚小闭?，即對各類可能與人類、動物（主要是家養(yǎng)寵物、養(yǎng)殖牲畜、家禽等）密切接觸的物品進行檢測時，將克羅諾桿菌作為一項重點檢測內(nèi)容。

2 基于分子生物學的快速檢測技術(shù)

2.1 聚合酶鏈式反應技術(shù)

聚合酶鏈式反應技術(shù)英文全稱Polymerase Chain Reaction，簡稱PCR，可被視為“生物體外特殊DNA復制”。此種鏈式反應的過程如下。①將一種物質(zhì)的DNA自生物體內(nèi)取出，放置于95 ℃的高溫環(huán)境下，此時，DNA會“變性”成單鏈狀態(tài)。②降低環(huán)境溫度（一般控制在60 ℃左右）后，單鏈與引物的堿基會自動完成“互補配對”。③再次升高環(huán)境溫度（此時無需升高至步驟①的程度，只需控制在72 ℃左右即可，而該溫度是最適合DNA聚合酶反應的溫度），此時，DNA聚合酶會沿著磷酸到五碳糖的方向完成互補鏈的合成。總體而言，PCR技術(shù)可視為“模擬DNA天然復制的過程”，特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物，經(jīng)過上述3個階段后，會合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈重復循環(huán)變性--退火--延伸3過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需2～4 min，2～3 h就能將待擴增目的基因擴增放大幾百萬倍[2]。由此可見，使用PCR技術(shù)監(jiān)測克羅諾桿菌時，即使按照最傳統(tǒng)、最原始的PCR合成方法，只需數(shù)個小時便可確定被檢測物品內(nèi)是否含有克羅諾桿菌。

2.2 實時熒光定量聚合酶鏈式反應技術(shù)

此種技術(shù)的本質(zhì)仍然是PCR技術(shù)，是指在DNA擴增反應的過程中，使用熒光化學物質(zhì)，對PCR循環(huán)后產(chǎn)物的總量進行測量，并通過內(nèi)參法或外參法，對檢測樣品中特定的DNA序列進行定量分析。具體而言，在PCR擴增的指數(shù)時期，檢測模板的CT值（循環(huán)閾值）以及其拷貝數(shù)之間存在一種線性關(guān)系，而此種關(guān)系可以作為定量的依據(jù)。采用熒光定量PCR技術(shù)檢測克羅諾桿菌的具體方法分為2種。①SYBRGreen I法。在PCR反應過程中，加入過量的SYBR熒光染料，該染料具有特異性，摻入DNA的雙鏈后，能夠發(fā)射熒光信號，而沒有摻入鏈中的染料分子不會發(fā)射熒光信號。因此，SYBR熒光信號增加速度與PCR產(chǎn)物增加速度完全一致，只需繪制出SYBR定量PCR擴增熒光曲線圖，并與克羅諾桿菌DNA天然復制的曲線圖進行比對，即可判斷檢測樣本中是否含有克羅諾桿菌。②TaqMan探針法。此種方法的本質(zhì)與SYBRGreen I法并無二致，同樣需要使熒光信號的積累（增長）與PCR產(chǎn)物的形成保持同步。實現(xiàn)方法為：在探針的完整程度尚未被破壞時，報告基團發(fā)射的熒光信號會被淬滅基團吸收；當PCR處于擴增階段時，Taq酶的5′-3′外切酶的活性將受探針酶的“切割”，進而降解。此時，報告熒光基團和淬滅熒光基團將會分離，之后便可使熒光監(jiān)測系統(tǒng)收到相應的（熒光）信號。而隨著一條DAN鏈的形成，一個新的熒光分子也會同時間形成。

2.3 等溫擴增技術(shù)

等溫擴增技術(shù)全稱“基于恒溫擴增的核酸擴增技術(shù)”，包含環(huán)介導等溫擴增、交叉引物擴增、鏈替代擴增、重組酶聚合酶擴增、依賴核酸序列的擴增、依賴解旋酶的擴增和滾環(huán)擴增共7種具體類型[3]。受篇幅所限，本文以環(huán)介導等溫擴增為例進行介紹。使用該技術(shù)檢測克羅諾桿菌等病原菌的過程如下。①將內(nèi)引物與目的基因相結(jié)合，在BstDNA聚合酶的作用下，可延伸為雙鏈。②外引物與雙鏈DNA的5′端會相互結(jié)合，并在一端形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。另一端經(jīng)歷的過程與此相同，最終會形成“兩端都有環(huán)狀結(jié)構(gòu)，類似一個啞鈴”的結(jié)構(gòu)形態(tài)。③啞鈴狀結(jié)構(gòu)形態(tài)的單鏈DNA兼具模板和引物的功能，一旦受到Bst聚合酶的催化作用，便可延伸。④內(nèi)引物同樣能夠與環(huán)狀結(jié)構(gòu)相結(jié)合，并在聚合酶催化作用下延伸。相較于PCR技術(shù)，環(huán)介導等溫擴增技術(shù)無需模板的熱變形、溫度循環(huán)等過程，在30～60 min內(nèi)，即可完成對檢測樣本的核酸擴增反應，檢測過程簡單、快速且特異性較強。

2.4 其他技術(shù)

從克羅諾桿菌本身的特性出發(fā)，可針對其特點制定出一種專用于檢測該菌的分子生物檢測技術(shù)。比如克羅諾桿菌具有革蘭氏陰性、α-葡萄糖苷酶活性、可產(chǎn)生黃色素等特性?；诖?，有學者創(chuàng)設(shè)了一種只適用于克羅諾桿菌的檢測過程。①使用必不可少的重要物質(zhì)——萬古霉素（一種糖肽類抗生素）和月桂基硫酸鹽，目的在于：檢測樣本中可能含有多種真菌、細菌（其中的很多菌種并不具有致病性，但在檢測過程中有可能影響對克羅諾桿菌的檢測結(jié)果），需要抑制陽性細菌的生長，從而保證克羅諾桿菌等革蘭氏陰性菌有較大的生長優(yōu)勢。②使用顯色培養(yǎng)基對經(jīng)過初步處理的樣本進行培養(yǎng)，原理在于：克羅諾桿菌內(nèi)獨有的α-葡萄糖苷酶被活性水解后，會使培養(yǎng)基的第五顏色出現(xiàn)明顯的變化。而考慮到檢測樣本中可能同時存在不止一種腸桿菌科細菌，故需借助硝基苯-α-葡萄糖吡喃苷等物質(zhì)加以區(qū)分（體現(xiàn)在顏色方面，上文提到，克羅諾桿菌能夠產(chǎn)生黃色素，故與硝基苯-α-葡萄糖吡喃苷等反應之后，培養(yǎng)基底物的顏色變化會產(chǎn)生明確的指向性，有助于檢測人員判斷）。③根據(jù)培養(yǎng)基底物顏色變化，進一步提出其他革蘭氏陰性菌等雜菌之外，便可以根據(jù)克羅諾桿菌的發(fā)酵特性、氧化酶活性、檸檬酸水解活性等生化特性，再一次確定檢測樣本中是否真正含有克羅諾桿菌。該檢測方式基于克羅諾桿菌的特性而設(shè)定，從原理上來說，只要有一個過程并不符合對應的結(jié)果，比如培養(yǎng)基底物顏色變化環(huán)節(jié)，如果并未出現(xiàn)克羅諾桿菌與硝基苯-α-葡萄糖吡喃苷反應后對應的顏色，實際上已經(jīng)說明檢測樣本中不含有該菌。從相反方向進行分析，進入最后一個環(huán)節(jié)——基于發(fā)酵特性、氧化酶活性進行檢測時，是為了對最終檢測結(jié)果進行“定性”。

3 基于免疫學的快速檢測技術(shù)

3.1 免疫磁珠檢測技術(shù)

免疫磁珠是一種新型免疫學檢測技術(shù)，是指將固化試劑的優(yōu)點與免疫反應的高度特異性相結(jié)合，并基于免疫學開展的檢測技術(shù)。具體原理為：運用核-殼的合成方法，完成含有超順磁性物質(zhì)高分子表面覆蓋的復合材料，以及具有較強穩(wěn)定性，能夠進行后期標記物質(zhì)的合成。在檢測過程中，利用這些物質(zhì)表面的功能集團（主要有氨基、羧基等），實現(xiàn)抗體的共價或非共價偶聯(lián)。在此基礎(chǔ)上，將特定的抗原或抗體（可視為檢測樣本）與上述物質(zhì)相結(jié)合之后，在外加磁場的吸引作用下，檢測樣本中的很多物質(zhì)會發(fā)生定向移動，進而完成分離、監(jiān)測、基因純化等目的。采用此種方法檢測樣本中是否含有克羅諾桿菌的原理為：克羅諾桿菌抗體能夠與磁珠相結(jié)合，形成一種“抗克羅諾桿菌免疫磁珠”，可明顯提升核酸檢測靈敏度[4]。

3.2 酶聯(lián)免疫吸附檢測技術(shù)

該技術(shù)是指利用抗體分子、抗原分子特異性相結(jié)合的特點，使處于游離狀態(tài)的雜蛋白和結(jié)合于固相載體的目的蛋白相結(jié)合。在此基礎(chǔ)上，利用經(jīng)過特殊標記的標記物，對檢測樣本進行定性、定量分析。具體而言，抗原或抗體會吸附在檢測樣本固相的表面，且免疫活性在很長一段時間內(nèi)都能有效留存。此時向其中加入酶，可通過共價鍵形成酶結(jié)合物，并保持各自的免疫活性與酶活性。此時再加入檢測底物，根據(jù)顏色的變化情況，可確定免疫反應是否發(fā)生。從一定程度上來看，此種技術(shù)與上文提到的克羅諾桿菌特定生物化學檢測技術(shù)有部分相似之處。

3.3 重組酶等溫擴增試紙條檢測技術(shù)

此種技術(shù)是將重組酶聚合酶等溫擴增技術(shù)與免疫層析試紙條技術(shù)相結(jié)合，形成一種能夠在20 min內(nèi)確定檢測樣本中是否含有克羅諾桿菌的技術(shù)。具體的檢測過程如下。①將檢測樣本從-80 ℃的環(huán)境中取出，置于冰盒上，取100 μL加入10 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r·min-1過夜培養(yǎng)。次日取出，按照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取細菌DNA，DNA于-20 ℃保存?zhèn)溆?。②完成膠體金試紙條的制備。③選擇NC膜，完成樣品展開液的優(yōu)化處理之后，重點針對檢測樣本的特異性和靈敏度進行檢測。具體方法遵照GB/T 4789.40—2016標準。將檢測結(jié)果與標準參照表進行對比，即可了解樣本中是否存在克羅諾桿菌[5]。

4 結(jié)語

克羅諾桿菌對特定人群有較強的致病性，而感染人群（主要是嬰幼兒）的途徑包含多種食品（主要是嬰幼兒奶粉）。從保證食品安全角度來看，針對流入市場的食品進行全方位檢測是必要的，也是無可置疑的。但從行業(yè)發(fā)展及管理的角度來看，檢測過程耗時同樣是大問題。如一些新鮮的果蔬，如果檢測時間較長，新鮮度便會降低，導致賣不上價。基于此，必須找到能夠在短時間內(nèi)精準確定樣本中是否含有克羅諾桿菌的方法。本文介紹的PCR技術(shù)，針對克羅諾桿菌的特定檢測技術(shù)都能夠產(chǎn)生良好的效果，可推廣應用。