氧化及不同離子強(qiáng)度下豬肉肌原纖維蛋白結(jié)合風(fēng)味物質(zhì)的研究

甘 瀟，趙 玲，吳 倩，陳希文,*

（1.綿陽師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 綿陽 621000；2.動(dòng)物疫病防控與健康養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，四川 綿陽 621000）

肉及肉制品風(fēng)味特點(diǎn)是衡量其品質(zhì)特征的重要指標(biāo)之一，在很大程度上影響了消費(fèi)者對(duì)肉及肉制品的接受情況。蛋白質(zhì)是繼脂肪組織外影響肉制品風(fēng)味的又一重要組分。肌肉蛋白對(duì)肉及肉制品風(fēng)味形成的貢獻(xiàn)主要表現(xiàn)在兩個(gè)方面：一是蛋白質(zhì)的降解氧化作用，在這個(gè)過程中蛋白質(zhì)可以降解為小肽、氨基酸和醛類等風(fēng)味前體物質(zhì)，而風(fēng)味前體物質(zhì)可以通過進(jìn)一步的Strecker 降解反應(yīng)或美拉德反應(yīng)生成風(fēng)味化合物[1]。這些風(fēng)味化合物與脂肪氧化形成的風(fēng)味物質(zhì)及非揮發(fā)性化合物等共同構(gòu)成肉及肉制品的整體風(fēng)味[2]。蛋白質(zhì)對(duì)風(fēng)味的影響更多的是通過物理或化學(xué)方式結(jié)合和釋放風(fēng)味物質(zhì)，從而影響肉品基質(zhì)呈現(xiàn)出來的整體風(fēng)味。國內(nèi)外學(xué)者通過研究初步了解肉品基質(zhì)結(jié)合與釋放風(fēng)味物質(zhì)的機(jī)制從而調(diào)節(jié)產(chǎn)品風(fēng)味，改變產(chǎn)品感官品質(zhì)特性[3]。大量的研究也表明肌肉蛋白質(zhì)本身是沒有味道的，之所以呈現(xiàn)出風(fēng)味是因?yàn)榈鞍着c風(fēng)味物質(zhì)的交互作用從而影響肉制品的風(fēng)味[4]。為了更加全面地了解蛋白質(zhì)-風(fēng)味物質(zhì)之間的相互作用機(jī)制，很多研究[5-6]報(bào)道了關(guān)于模型體系研究蛋白質(zhì)對(duì)風(fēng)味物質(zhì)結(jié)合的機(jī)理?？偨Y(jié)國內(nèi)外的研究報(bào)道可以看出，蛋白質(zhì)和風(fēng)味物質(zhì)本身的結(jié)構(gòu)及種類、反應(yīng)體系的離子強(qiáng)度、外部溫度、pH 等因素都會(huì)影響蛋白對(duì)風(fēng)味物質(zhì)的結(jié)合[7]。根據(jù)前期的研究發(fā)現(xiàn)，臘肉加工過程中蛋白質(zhì)經(jīng)歷了氧化和降解過程，而氧化降解的蛋白質(zhì)除了本身會(huì)產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)外，還會(huì)發(fā)生結(jié)構(gòu)改變從而改變對(duì)風(fēng)味物質(zhì)的結(jié)合能力，以至于呈現(xiàn)出不同的風(fēng)味[8]。在肉及肉制品的加工和貯藏過程中，隨著蛋白質(zhì)氧化過程的發(fā)生，其結(jié)構(gòu)也隨之發(fā)生變化。離子強(qiáng)度改變?nèi)缒壳俺珜?dǎo)的低鹽肉制品體系中，鈉離子的部分替代也導(dǎo)致肉品體系離子種類和強(qiáng)度的改變，這些都會(huì)影響蛋白質(zhì)與風(fēng)味物質(zhì)的結(jié)合。

因此，為了探究肉及肉制品的蛋白質(zhì)-風(fēng)味物質(zhì)結(jié)合機(jī)理，本文構(gòu)建了豬肉肌原纖維蛋白的氧化體系，了解氧化引起的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化，并采用頂空自動(dòng)進(jìn)樣（HS）結(jié)合氣相色譜（GC）法分析氧化后豬肉肌原纖維蛋白在不同離子強(qiáng)度下與特征風(fēng)味物質(zhì)的結(jié)合特性。本研究為肉及肉制品在加工及貯藏過程中風(fēng)味的保持，食鹽部分替代肉制品風(fēng)味分析機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豬里脊肉 購于綿陽市高薪區(qū)永輝超市；磷酸二氫鉀鈉、磷酸氫二鈉、疊氮化鈉、氯化鎂、氫氧化鈉、乙二胺四乙酸二鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、三氯乙酸等 均購于成都市科龍化工試劑廠；5,5'-二硝基（2-硝基苯甲酸）、2,4-二硝基苯肼（DNPH）、尿素、鹽酸胍、十二烷基硫酸鈉（以上試劑均為分析純）、三甲基丁醛、正己烷、己醛、辛醛、芳樟醇、苯乙酮（以上試劑均為GC 純）等 購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

XHF-D 內(nèi)切式勻漿機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；Avanti J-30I 冷凍離心機(jī) 美國貝克曼庫爾特公司；722 型可見分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司；F-2500 熒光分光光度計(jì)、UV-2450 紫外分光光度計(jì)、GC-2010 Plus 氣相色譜 日本島津公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 肌原纖維蛋白（MP）的提取 參考Wang 等[9]的方法適當(dāng)修改后提取MP。取10 g 絞碎的新鮮豬肉樣品，加入4 倍體積10 mmol/L 磷酸鹽緩沖液（含0.1 mol/L 的NaCl，1 mmol/L 的乙二胺四乙酸二鈉，2 mmol/L 的氯化鎂，pH7.0）7000 r/min 均質(zhì)30 s，暫停3 min 再均質(zhì)30 s，4 ℃ 2000×g 下離心15 min，去除上清液，重復(fù)上述操作3 次。沉淀中加入40 mL 0.1 mol/L 的NaCl 溶液，7000 r/min 均質(zhì)30 s，2000 g條件下離心15 min，重復(fù)操作2 次，最后一次離心用20 mmol/L 的pH6.0 磷酸鹽緩沖液離心，沉淀即為MP，以上操作均在冰浴條件下進(jìn)行。

1.2.2 MP 氧化體系的制備 提取的MP 最終用含0.6 mol/L NaCl 的20 mmol/L 磷酸鹽緩沖液（pH6.0）分散并稀釋至濃度為15 mg/mL（含0.5 mg/mL NaN3）并分成4 等份，然后添加2,2-偶氮二（2-甲基丙基咪）二鹽酸鹽（AAPH），使其在MP 中的濃度分別為0、10、20、50 mmol/L。將各MP 溶液在37 ℃反應(yīng)1.5 h。樣品溶液在冰浴中冷卻至4 ℃并離心（2000×g，10 min，4 ℃），使用蒸餾水將所得沉淀物洗滌兩次并在相同條件下離心終止反應(yīng)。不含MP 且未經(jīng)氧化處理的緩沖液試劑瓶為對(duì)照樣。

1.2.3 蛋白羰基的測(cè)定 參考Wang 等[10]的方法適當(dāng)修改后測(cè)氧化處理MP 的羰基含量。經(jīng)氧化處理的MP 用20 mmol/L 的緩沖液（pH6.0，含0.6 mol/L NaCl）調(diào)至5 mg/mL。分別取兩份400 μL 的MP 溶液，一份加入800 μL 的HCl （2 mol/L，內(nèi)含0.2% （w/v）的DNPH）處理，另一份樣品加入800 μL 的HCl（2 mol/L）處理后作為空白。放置30 min 后，加入400 μL 的三氯乙酸溶液（40%），在5000×g 條件下離心5 min。隨后沉淀中加入1 mL 乙醇-乙酸乙酯（1:1[v/v]）混合液并在10000×g 條件下離心處理5 min。重復(fù)上述操作3 次后，在沉淀中加入1.5 mL 的磷酸鹽溶液（pH6.5，20 mmol/L，含有6 mol/L 的鹽酸胍）。待蛋白質(zhì)溶解后在4 ℃條件下放置12 h，分別在280 和370 nm 處測(cè)定吸光度。按如下公式計(jì)算蛋白羰基值：

式中：A 代表吸光度；22000 表示摩爾吸光系數(shù)，L/(mol·cm)。

1.2.4 蛋白巰基的測(cè)定 參考Wang 等[11]的方法適當(dāng)修改后測(cè)定氧化處理MP 總巰基含量。經(jīng)氧化處理的MP 用20 mmol/L 的緩沖液（含0.6 mol/L NaCl，pH7.0）調(diào)至4 mg/mL。取1 mL 處理的MP 加入9 mL磷酸鹽緩沖液（50 mmol/L，pH7.0，內(nèi)含8 mol/L 的尿素、10 mmol/L 的EDTA 和0.6 mol/L 的NaCl）。在10000 r/min 條件下冷凍離心15 min 后，取3 mL離心上清液，加入400 μL 的50 mmol/L 乙酸鈉溶液（內(nèi)含10 mmol/L DTNB），在40 ℃條件下加熱處理25 min，冷卻后在412 nm 處測(cè)定吸光度。按如下公式計(jì)算蛋白總巰基值：

式中：D 代表稀釋倍數(shù)；C 代表MP 濃度，mg/mL；13600 為摩爾吸光系數(shù)，L/(mol·cm)。

1.2.5 蛋白內(nèi)源熒光的測(cè)定 參照J(rèn)iang 等[12]的方法適當(dāng)修改測(cè)定MP 內(nèi)源熒光。將MP 用0.6 mol/L NaCl 溶液溶解為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5 mg/mL 的蛋白溶液。0.6 mol/L NaCl 溶液作為空白，對(duì)蛋白溶液進(jìn)行熒光光譜檢測(cè)。儀器參數(shù)設(shè)置為：激發(fā)波長295 nm，發(fā)射光譜范圍300～400 nm，掃描范圍300～400 nm，掃描速度1500 nm/min，激發(fā)和發(fā)射狹縫均為2.5 nm，掃描3 次。

1.2.6 蛋白表面疏水性的測(cè)定 參照Chelh 等[13]的方法測(cè)定MP 表面疏水性。將MP 用0.02 mol/L、pH7.0 的磷酸鹽緩沖液配制成質(zhì)量濃度為5 mg/mL的蛋白溶液。取1 mL 蛋白樣液和200 μL 1 mg/mL溴酚藍(lán)（蒸餾水溶解）溶液于離心管中，同時(shí)做對(duì)照（1 mL 0.02 mol/L 磷酸鹽緩沖液和200 μL 1 mg/mL溴酚藍(lán)于離心管中），室溫下振蕩10 min，在8000×g條件下離心l0 min，取上清液400 μL 稀釋10 倍，用分光光度計(jì)在595 nm 處測(cè)定吸光度值，空白為0.02 mol/L、pH7.0 的磷酸鹽緩沖液，肌原纖維蛋白質(zhì)表面疏水性以結(jié)合溴酚藍(lán)的量表示，其計(jì)算公式如下：

1.2.7 蛋白溶解度的測(cè)定 參照曹云剛等[14]的方法修改測(cè)定蛋白溶解度。用50 mmol/L 磷酸鹽緩沖液（含0.6 mol/L NaCl，pH6.25）冰浴條件下2800 r/min均質(zhì)處理氧化的MP，制成蛋白濃度2.5 mg/mL 的MP 溶液。4 ℃條件下放置1 h，4 ℃，8000 r/min 離心15 min，取上清測(cè)MP 濃度（雙縮脲法測(cè)定），空白為磷酸鹽緩沖液。

1.2.8 HS-GC 檢測(cè)氧化對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)合風(fēng)味物質(zhì)能力的影響 將選定風(fēng)味物質(zhì)溶于正己烷制成儲(chǔ)備液。在含AAPH 濃度分別為10、20、50 mmol/L 的氧化體系中，用20 mmol/L 磷酸鹽緩沖液（含0.6 mol/L NaCl，pH6.0）稀釋到9 mg/mL，并添加風(fēng)味物質(zhì)儲(chǔ)備液，使得各風(fēng)味物質(zhì)（2-甲基丁醛、3-甲基丁醛、己醛、辛醛和壬醛）在MP 中的終濃度均為2.5 mg/mL，然后分別檢測(cè)不同程度氧化蛋白對(duì)風(fēng)味物質(zhì)結(jié)合能力的影響。五種風(fēng)味物質(zhì)的選擇是基于其在干腌發(fā)酵肉制品中的特殊貢獻(xiàn)[15-16]。風(fēng)味物質(zhì)的檢測(cè)參照Estévez 等[17]的方法有所改進(jìn)。取5 mL 樣品于20 mL的頂空萃取瓶中，用PTEE 硅膠隔墊和螺帽密封。將樣品在旋渦振蕩器上振搖30 s?？瞻讓?duì)照瓶用20 mmol/L 磷酸鹽（含0.6 mol/L NaCl，pH6.0）替代蛋白樣品，空白對(duì)照及含蛋白樣品的萃取瓶均置于35 ℃振搖反應(yīng)12 h。反應(yīng)的樣品萃取瓶置于頂空自動(dòng)進(jìn)樣器中待分析。頂空條件設(shè)置為：頂空平衡時(shí)間為30 min，平衡溫度為80 ℃，頂空固定管溫度為150 ℃，傳輸線溫度為150 ℃。使用GC-2010 Plus氣相色譜儀對(duì)頂空風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)。樣品在250 ℃的進(jìn)樣口進(jìn)行解吸。使用氮?dú)鉃檩d氣，流速為1.0 mL/min。用Rtx-Wax 柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）分離各樣品的揮發(fā)性化合物。風(fēng)味提取物通過自動(dòng)頂空進(jìn)樣器進(jìn)樣注入，分流比為10:1。GC 爐溫最初在40 ℃保持60 s；以8 ℃/min 升溫至90 ℃并保持60 s；進(jìn)一步以6 ℃/min 升溫至205 ℃，保持60 s；以20 ℃/min 上升至230 ℃并保持4 min，總加熱時(shí)間為33.5 min。當(dāng)風(fēng)味物質(zhì)滿足GC 火焰離子化檢測(cè)器（FID）中的火焰溫度被電離，F(xiàn)ID 直接檢測(cè)并定量風(fēng)味物。通過測(cè)量風(fēng)味物質(zhì)的出峰時(shí)間與標(biāo)品進(jìn)行比較來確定風(fēng)味物質(zhì)。蛋白樣品頂空風(fēng)味物質(zhì)濃度以百分比表示，100%表示的是不含蛋白僅含相同體積緩沖液的對(duì)照萃取瓶中各種風(fēng)味物質(zhì)在萃取瓶頂空的濃度。所有分析均進(jìn)行三次。

1.2.9 HS-GC 檢測(cè)不同離子條件下氧化蛋白結(jié)合風(fēng)味物質(zhì)的能力 在含AAPH 濃度為15 mmol/L 的氧化體系中，用20 mmol/L 磷酸鹽緩沖液（含 0.6 mol/L NaCl，pH6.0）稀釋到9 mg/mL，并添加風(fēng)味物質(zhì)儲(chǔ)備液，使得各風(fēng)味物質(zhì)在MP 中的終濃度均為2.5 mg/mL，然后添加NaCl、KCl、CaCl2和MgCl2到氧化的MP 中，使得最終濃度為0.5 mmol/L。然后如1.2.8 檢測(cè)不同離子條件下氧化蛋白結(jié)合風(fēng)味物質(zhì)的水平。

1.3 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用SPSS 19.0 對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差（analysis of variance，ANOVA）分析、最小顯著差數(shù)法（least significant difference，LSD）多重比較。用Origin 8.1 作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 氧化處理MP 羰基含量的變化

AAPH 經(jīng)常被用于在不同的氧化系統(tǒng)模型中熱分解產(chǎn)生過氧自由基[18]，其不僅在脂質(zhì)氧化中起著重要作用，也是促進(jìn)蛋白氧化的活性氧物質(zhì)[19]。蛋白羰基是蛋白質(zhì)氧化的重要產(chǎn)物[20]。不同濃度AAPH 氧化處理MP 蛋白羰基含量如圖1 所示，隨著AAPH濃度的增加羰基含量顯著增加（P＜0.05）。本試驗(yàn)中，氧化空白的MP 羰基含量為1.59 nmol/mg，與周非白[21]的研究結(jié)果類似，也與對(duì)照組（鮮肉蛋白）羰基含量結(jié)果無顯著差異（P＞0.05），當(dāng)AAPH 濃度達(dá)到50 mmol/L 時(shí)，蛋白羰基含量顯著增加到17.53 nmol/mg蛋白（P＜0.05），說明MP 隨著AAPH濃度的增加發(fā)生了不同程度地氧化。羰基是蛋白氧化的標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)物[20]，很多研究都是用羰基值來衡量蛋白的氧化程度。Wen等[22]研究了哈爾濱香腸鈉鹽替代對(duì)脂肪和蛋白氧化及風(fēng)味物質(zhì)變化的影響，文章對(duì)蛋白質(zhì)氧化對(duì)羰基等影響進(jìn)行了研究，隨著時(shí)間的延長，對(duì)照和替代組蛋白羰基含量均顯著增加，KCl 替代組羰基含量顯著低于KCl 和其它物質(zhì)共同替代組，說明在香腸發(fā)酵過程中發(fā)生蛋白質(zhì)氧化反應(yīng)，而不同替代對(duì)蛋白質(zhì)氧化程度有顯著影響。馬國源[23]比較了牦牛肉和肌肉肌紅蛋白羰基值的差異，從而得出低劑量煙硝酸鈉抑制牦牛肉肌紅蛋白氧化的結(jié)論。本研究的前提條件是豬肌原纖維蛋白發(fā)生氧化反應(yīng)，因而也對(duì)羰基值進(jìn)行了檢測(cè)。

圖1 氧化處理MP 羰基含量的變化Fig.1 Changes in carbonyl content of MP upon oxidation

2.2 氧化處理MP 總巰基含量的變化 蛋白質(zhì)巰基（半胱氨酸殘基）損失是蛋白質(zhì)氧化的標(biāo)志之一，含硫氨基酸的巰基（硫醇?xì)埢O易發(fā)生氧化反應(yīng)[24]。不同濃度AAPH 氧化處理MP 總巰基含量如圖2 所示，總巰基從15.46 nmol/mg 降到4.41 nmol/mg。隨著AAPH 濃度的增加，MP 的巰基含量顯著下降（P＜0.05），說明MP 發(fā)生了氧化。在肉體系中，過氧自由基可以從半胱氨酸的S-H 基團(tuán)中抽取氫原子以產(chǎn)生硫基自由基[25]，并進(jìn)一步與其他硫醇/硫醇鹽反應(yīng)產(chǎn)生二硫化物或與分子氧反應(yīng)生成硫代過氧自由基[26]。Zhang 等[27]強(qiáng)調(diào)巰基屬于弱二級(jí)鍵，有助于穩(wěn)定蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)。因此，可以推測(cè)巰基的損失會(huì)導(dǎo)致MP 三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。

圖2 氧化處理MP 巰基含量的變化Fig.2 Changes in sulfhydryl content of MP upon oxidation

2.3 氧化處理MP 色氨酸熒光的變化 色氨酸殘基位于天然蛋白質(zhì)的內(nèi)核中并在295 nm 光譜激發(fā)下可以在330～370 nm 內(nèi)發(fā)射熒光[28]。色氨酸殘基的直接氧化降解和蛋白質(zhì)去折疊都能夠?qū)е聼晒鈴?qiáng)度的損失[29]。不同濃度AAPH 氧化處理MP 色氨酸熒光變化如圖3 所示。隨著AAPH 濃度的增加，色氨酸熒光強(qiáng)度逐漸降低。在本試驗(yàn)中，色氨酸殘基易受過氧自由基的氧化，因?yàn)檫^氧自由基可以在色氨酸吲哚環(huán)的1 位抽取氫原子，從而產(chǎn)生色氨酰基[30]。值得注意的是色氨酸在蛋白質(zhì)中的位置可以影響它們對(duì)過氧自由基的反應(yīng)性[31]。因此，色氨酸在蛋白質(zhì)表面上的暴露可能使它們變得更容易受到過氧自由基的攻擊。Diao 等[31]表明熒光強(qiáng)度與色氨酸濃度密切相關(guān)。因此，降低的熒光強(qiáng)度可能與過氧自由基對(duì)色氨酸的消耗有關(guān)。

圖3 氧化處理MP 色氨酸熒光的變化Fig.3 Changes in tryptophan fluorescence of MP upon oxidation

2.4 氧化處理MP 表面疏水性的變化 表面疏水性普遍用于評(píng)價(jià)疏水性氨基酸殘基在蛋白質(zhì)表面的分布程度[32]。不同濃度AAPH 處理MP 的表面疏水性變化如圖4 所示。對(duì)照組和氧化空白樣品表面疏水性無顯著差異（P＞0.05），隨著AAPH 濃度從0 mmol/L增加到50 mmol/L，表面疏水性顯著增加到最大（P＜0.05）。一般來說，蛋白質(zhì)氧化是自由基鏈?zhǔn)竭B鎖反應(yīng)。在蛋白質(zhì)分子中，氧化損傷可以通過自由基進(jìn)行連鎖反應(yīng)，如初始氧化半胱氨酸的巰基可以導(dǎo)致隨后的α-位（主鏈）和β-位（側(cè)鏈）的碳原子團(tuán)的形成，并且這些碳原子基團(tuán)會(huì)導(dǎo)致下游的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，因此這種氧化損傷會(huì)從蛋白質(zhì)表面通過自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)傳遞到蛋白質(zhì)的內(nèi)部[24]。因此過氧自由基很可能會(huì)傳遞到蛋白質(zhì)包埋的氨基酸，如芳香氨基酸里面的酪氨酸和色氨酸殘基極易被過氧自由基氧化[33]。此外，芳香族氨基酸殘基的氧化可以產(chǎn)生一些帶電基團(tuán)，增強(qiáng)這些側(cè)鏈的親水能力，這可能迫使氧化的芳香族側(cè)鏈分布在蛋白質(zhì)表面上[34]。因此，隨著AAPH濃度的增加，表面疏水性增加。

圖4 氧化處理MP 表面疏水性的變化Fig.4 Changes in protein surface hydrophobicity of MP upon oxidation

2.5 氧化處理MP 溶解度的變化 不同濃度AAPH氧化處理MP 可溶性的變化如圖5 所示。對(duì)照組和AAPH 氧化空白組MP 可溶性最高且無顯著差異（P＞0.05），隨著AAPH 濃度的增加，MP 溶解度顯著降低（P＜0.05），由氧化空白組的72.85%降低到AAPH 濃度為50 mmol/L 時(shí)的38.25%。一般認(rèn)為蛋白質(zhì)溶解度的降低是因?yàn)榈鞍?水相互作用的降低[30]。在AAPH 作用下，蛋白質(zhì)表面疏水性氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)的暴露，增加了蛋白質(zhì)的聚集，從而降低了蛋白質(zhì)在水中的溶解度。

圖5 氧化處理MP 可溶性的變化Fig.5 Changes in solubility of MP upon oxidation

2.6 氧化對(duì)MP 結(jié)合特征風(fēng)味物質(zhì)能力的影響 蛋白結(jié)構(gòu)是影響蛋白結(jié)合風(fēng)味物質(zhì)能力的重要因素[3]。在表征蛋白氧化后結(jié)構(gòu)改變的基礎(chǔ)上，試驗(yàn)進(jìn)一步研究了氧化引起蛋白結(jié)構(gòu)變化對(duì)其結(jié)合風(fēng)味物質(zhì)能力的影響。試驗(yàn)選取5 種風(fēng)味物質(zhì)在對(duì)照及氧化蛋白的萃取瓶頂空的含量（%）對(duì)比分析如圖6 所示。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)2-甲基丁醛和壬醛在對(duì)照瓶頂空的含量顯著低于氧化MP 在萃取瓶頂空的含量（P＜0.05），表明氧化處理的MP 對(duì)2-甲基丁醛和壬醛有促釋放作用。實(shí)驗(yàn)表明當(dāng)AAPH 達(dá)10 mmol/L 濃度時(shí)，MP 的氧化促進(jìn)了其對(duì)己醛和辛醛的吸附作用，對(duì)2-甲基丁醛和壬醛有促釋放作用。當(dāng)AAPH 達(dá)20 mmol/L 濃度氧化MP 時(shí)，MP 促2-甲基丁醛、3-甲基丁醛、辛醛、壬醛等的釋放能力顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。當(dāng)AAPH 濃度達(dá)到50 mmol/L 時(shí)，3-甲基丁醛、己醛、辛醛和壬醛含量均顯著低于（P＜0.05）AAPH 濃度為20 mmol/L 時(shí)頂空瓶上空的含量，說明MP 的高強(qiáng)度氧化使得其對(duì)3-甲基丁醛、己醛、辛醛和壬醛的吸附能力增強(qiáng)。Zhou 等[3]研究了氧化誘導(dǎo)的肌纖維蛋白結(jié)構(gòu)修飾對(duì)其與芳香化合物結(jié)合能力的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)芳香化合物的結(jié)合受到蛋白質(zhì)氧化水平的強(qiáng)烈影響。本實(shí)驗(yàn)同樣檢測(cè)到當(dāng)AAPH 濃度為20 mmol/L 時(shí)，其結(jié)合風(fēng)味化合物能力降低，可能是一定程度氧化導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的再折疊，加速蛋白質(zhì)的聚集，降低了芳香化合物的親和力，從而降低了結(jié)合能力。而當(dāng)AAPH 濃度為50 mmol/L時(shí)，蛋白質(zhì)會(huì)發(fā)生再聚集和部分降解，進(jìn)而對(duì)蛋白質(zhì)的表面性質(zhì)進(jìn)行修飾，表面褶皺的聚集蛋白有利于與芳香化合物的疏水相互作用，形成蛋白質(zhì)-芳香化合物復(fù)合物，從而增強(qiáng)其結(jié)合能力。

圖6 氧化對(duì)MP 結(jié)合特征風(fēng)味物質(zhì)能力的影響Fig.6 Effect of oxidation on the ability of MP to bind characteristic flavor substances

2.7 不同離子Na+、K+、Ca2+、Mg2+對(duì)氧化處理MP結(jié)合風(fēng)味物質(zhì)的影響 蛋白質(zhì)結(jié)合風(fēng)味物質(zhì)的能力與環(huán)境中不同離子及離子濃度有關(guān)，先前研究表明20 mmol/L 的AAPH 可以使蛋白質(zhì)發(fā)生氧化，加速蛋白質(zhì)的聚集，降低芳香化合物的親和力，因而為避免此濃度的過度氧化使蛋白質(zhì)聚集后結(jié)合位點(diǎn)被遮蔽，從而影響加入離子后的反應(yīng)效果，選擇AAPH 濃度為15 mmol/L 時(shí)氧化MP 的基礎(chǔ)上，試驗(yàn)研究了不同離子一定濃度對(duì)氧化后的蛋白質(zhì)結(jié)合風(fēng)味物質(zhì)能力的影響。試驗(yàn)所選的5 種風(fēng)味物質(zhì)在對(duì)照及添加不同離子Na+、K+、Ca2+和Mg2+的氧化蛋白的萃取瓶頂空含量（%）分析如圖7 所示。Na+、K+、Ca2+和Mg2+離子條件下的MP 對(duì)2-甲基丁醛、3-甲基丁醛、己醛、辛醛、壬醛都有吸附作用（頂空風(fēng)味物質(zhì)濃度百分比＜100%），并且，Na+的添加使己醛在頂空瓶上空的含量顯著增加（P＜0.05），說明Na+的添加對(duì)己醛有促釋放的作用，可能是由于鹽析作用的影響，這與María 等[34]的研究結(jié)果一致。而Mg2+的添加使己醛在頂空瓶上空的含量減少，說明Mg2+的添加對(duì)己醛有吸附作用，K+和Ca2+的添加對(duì)蛋白質(zhì)和己醛相互作用無顯著影響（P＞0.05）。Na+、K+、Ca2+和Mg2+的添加使頂空瓶上空2-甲基丁醛、3-甲基丁醛、辛醛和壬醛的含量顯著降低（P＜0.05），說明Na+、K+、Ca2+和Mg2+的添加促進(jìn)了蛋白對(duì)2-甲基丁醛、3-甲基丁醛、辛醛和壬醛的吸收。近年來，國內(nèi)外的研究學(xué)者大多從鹽部分替代后的肉制品品質(zhì)變化進(jìn)行研究，認(rèn)為低鹽肉制品之所以呈現(xiàn)出某種性質(zhì)是因?yàn)樘娲}本身的特質(zhì)，而本研究旨在說明肉制品在鹽部分替代狀態(tài)時(shí)表現(xiàn)出來的不同風(fēng)味可以從鹽離子影響蛋白質(zhì)吸附風(fēng)味物質(zhì)的能力方面進(jìn)行分析考慮。因此，本研究為鹽部分替代肉制品風(fēng)味分析機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)。

圖7 不同Na+、K+ 、Ca2+、Mg2+濃度對(duì)氧化處理的MP 結(jié)合風(fēng)味物質(zhì)能力的影響Fig.7 Effects of different sodium, potassium, calcium and magnesium concentrations on the flavor substances of oxidized MP binding properties

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用AAPH 氧化體系誘導(dǎo)MP 的氧化，從蛋白氧化的角度修飾MP 的結(jié)構(gòu)，經(jīng)氧化的MP 羰基含量升高，巰基含量降低，色氨酸熒光減少，表面疏水性增加，MP 溶解度降低。因氧化的MP 其結(jié)構(gòu)改變導(dǎo)致其結(jié)合風(fēng)味物質(zhì)的能力有所改變。蛋白的氧化會(huì)提高促進(jìn)蛋白對(duì)2-甲基丁醛、3-甲基丁醛、辛醛和壬醛的釋放，但該釋放作用呈AAPH 濃度依賴性。不同鹽離子Na+的添加促進(jìn)了氧化蛋白對(duì)己醛的釋放，而Na+、K+、Ca2+和Mg2+的添加促進(jìn)了氧化蛋白對(duì)2-甲基丁醛、3-甲基丁醛、辛醛和壬醛的吸收。因此，在氯化鈉被部分替代的肉制品加工及貯藏過程中，蛋白質(zhì)易發(fā)生氧化而改變其結(jié)構(gòu)功能，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)結(jié)合風(fēng)味物質(zhì)的能力，從而使肉制品風(fēng)味發(fā)生變化。