棉籽糖家族寡糖的提取方法及功能性研究進展

趙若琪，程永霞，宋蓮軍,*，馬 燕，黃現(xiàn)青，喬明武

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南 鄭州 450002；2.河南省食品加工與流通安全控制工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450002；3.鄭州市大豆深加工重點實驗室，河南 鄭州 450002）

棉籽糖家族系列寡糖（Raffinose family of oligosaccharides，RFOs）在植物界廣泛存在，是植物界中特有的一類水溶性糖，含量僅次于蔗糖[1]。RFOs 是葡萄糖基C6 位的一分子蔗糖通過α-1, 6 糖苷鍵逐級連接一個或多個半乳糖苷基而成（圖1），以棉籽糖（三聚體）為代表，除棉籽糖外，還包括水蘇糖（四聚體），毛蕊花糖（五聚體），筋骨草糖（六聚體）和迄今尚未命名的長鏈寡糖，直至九糖，都屬于蔗糖的衍生物[2]。傳統(tǒng)的觀點認為，因人體不含能夠水解RFOs 的半乳糖苷酶，食用富含RFOs 的食物后，RFOs 不能被胃和小腸消化吸收，到達結(jié)腸后會被微生物分解產(chǎn)生的二氧化碳、氫氣和少量的甲烷等氣體造成機體胃腸脹氣[3]。因此，早期棉籽糖和水蘇糖常被當作“脹氣因子”從食品原料中去除。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，RFOs因具有半乳糖苷鍵，可以極大地促進雙歧桿菌（Bifidobacterium）的生長[4]，而被視為功能性低聚糖，有關(guān)RFOs 一些功能性機制研究尚未成熟。本文通過介紹自然界和人工合成的棉籽糖家族寡糖，棉籽糖家族寡糖提取、分離、純化的方法，可為如何提取和從哪里可提取較多RFOs 提供參考；以及棉籽糖家族寡糖調(diào)節(jié)腸道菌群、預(yù)防炎癥性腸病、降血糖等功能性研究，旨在為棉籽糖家族寡糖的開發(fā)利用提供一定的理論參考。

圖1 常見棉籽糖家族低聚糖的分子結(jié)構(gòu)Fig.1 Molecular structure of common raffinose family oligosaccharides

1 RFOs 的主要來源

1.1 植物中的RFOs

RFOs 廣泛存在于葫蘆科、豆科、唇形科、木犀科、玄參科等多類植物中。植物生理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)高等植物體內(nèi)的RFOs 是葉綠素在葉片中進行光合作用的產(chǎn)物，并被輸導(dǎo)組織運輸?shù)礁?、果實、種子等器官進行儲存[5]。其經(jīng)典合成途徑是由幾種α-半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶的順序反應(yīng)進行的，首先，半乳糖基由半乳糖肌醇轉(zhuǎn)移到蔗糖，經(jīng)棉籽糖合酶催化生成棉籽糖，再經(jīng)水蘇糖合酶催化生成水蘇糖，最后經(jīng)毛蕊花糖合成酶催化生成毛蕊花糖[6]。RFOs 在種子發(fā)育成熟過程中逐漸積累，并在其干燥耐性和耐貯藏性方面發(fā)揮著重要作用，而在種子萌發(fā)過程中RFOs 會因提供能量而被迅速消耗[7]。有研究表明，RFOs 參與植物中一些重要的細胞功能，如充當韌皮部中的運輸碳水化合物，抗凍植物器官中的儲藏儲備和防凍劑，膜運輸和mRNA 出口[8]等。近年來，關(guān)于玉米、擬南芥[9]、黃瓜[10]、番茄[11]等植物中RFOs 的大量研究表明在低溫、干燥等逆境條件下，RFOs 會在植物體內(nèi)積累，并起到生長保護的作用。

大量的研究發(fā)現(xiàn)不同植物體內(nèi)RFOs 含量及種類存在著顯著差異（表1），大多數(shù)單子葉植物種子中的RFOs 以棉籽糖為主，而水蘇糖和毛蕊花糖主要在雙子葉植物中積累[12]。目前關(guān)于植物中RFOs 含量的研究主要集中在豆科植物的種子。根據(jù)豆科種類的不同，RFOs 的含量也存在差異，一般在2%～9%之間[3]。KOTHA 等[13]對23 種菜豆可溶性單糖、二糖和低聚糖含量的測定，發(fā)現(xiàn)總糖和棉籽糖含量最多的是黃豌豆，分別達到8.36%和1.34%左右，黑眼豌豆中的水蘇糖含量最多在5.11%左右，綠豆中毛蕊花糖含量最多為1.56%。然而，同一種科屬下不同品種的豆中RFOs 含量也會存在差異，比如綠豌豆、黃豌豆、黑眼豌豆、奶油豌豆等種子中RFOs 含量在4.2%～6.3%之間不等[13]。除了豆科植物的種子，水蘇[14]、生地黃[14]、草石蠶[15]及蓮子[16]中也含有豐富的RFOs，含量分別為42.62、37.34、46.10、44.68 g/100 g。水蘇、生地黃、草石蠶等植物中的RFOs 均以水蘇糖為主，分別占低聚糖含量的85.53%、64.90%和43.38%。蓮子中的RFOs 主要有棉籽糖和水蘇糖，分別占RFOs 含量的39.10%和60.90%。

表1 不同植物中RFOs 的種類及含量Table 1 Species and content of RFOs in different plants

綜上所述，自然界中RFOs 在豆科植物中含量較多，大部分豆科植物中水蘇糖占比較大，只有綠豆中毛蕊花糖占比較大。此外，水蘇糖在玄參科地黃和唇形科水蘇、草石蠶中含量較多。目前用于工業(yè)生產(chǎn)的RFOs 也主要是從大豆、豌豆、鷹嘴豆等豆類的加工廢棄物中以及地黃、草石蠶等植物中分離提取得到的。

1.2 酶法制備RFOs

天然植物來源的RFOs 因原料來源豐富，且可以提取、分離、純化得到不同組分的RFOs，故而在食品工業(yè)中的應(yīng)用更為廣泛。除了從天然植物中提取，酶法合成也是制備RFOs 的一個有效途徑。目前對棉籽糖酶法合成的研究較為成熟，主要以半乳糖為底物，通過α-半乳糖苷酶（α-Galactosidase EC 3.2.1.22）催化合成[20]。在合成過程中通過調(diào)整初始的底物濃度、體系pH、反應(yīng)溫度、離子強度以及溶液組成等因素對熱力學(xué)反應(yīng)加以控制進而對RFOs 的產(chǎn)率進行調(diào)控。α-半乳糖苷酶存在于植物、動物和微生物體內(nèi)。糖苷酶之所以被應(yīng)用于低聚糖的合成反應(yīng)是因其在適合的反應(yīng)條件下，可將正常的水解反應(yīng)逆轉(zhuǎn)為糖苷的合成反應(yīng)。目前研究中用到的α-半乳糖苷酶多是從真菌中提取得到的，例如，在30 ℃黑曲霉中α-半乳糖苷酶可催化半乳糖和蔗糖溶液合成棉籽糖[21]。此外，BAIK[22]用在分枝犁頭霉IFO8084 中分離得到的α-半乳糖苷酶，在37 ℃下催化蔗糖和D-半乳糖反應(yīng)48 h 制得了棉籽糖。PETERBAUER等[23]從豌豆種子中純化出水蘇糖合成酶，能催化肌醇半乳糖苷轉(zhuǎn)移到棉籽糖上形成水蘇糖。雖然酶法合成RFOs 的理論和實踐均被證明可行，但這方面的研究報道遠少于從天然植物中提取RFOs 的相關(guān)報道。但酶法合成具備專一性強的特點，更利于制備高純度的單一組分低聚糖，若能將酶法制備RFOs 的相關(guān)研究進行工業(yè)化推廣，應(yīng)用前景將較為廣闊。

2 植物中RFOs 的提取、分離純化方法

目前關(guān)于RFOs 提取的研究主要集中于豆類和地黃等原料，具體的提取技術(shù)相對成熟，常用的提取方法包括溶劑提取法、微波提取法和超聲提取法，而最新的研究中常將微波、超聲等輔助提取技術(shù)進行聯(lián)合使用，具備提取效率更高、耗時較短的優(yōu)點，可應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)。提取得到的粗RFOs 中常含有雜質(zhì)成分，而RFOs 的功能特性與其純度有著密切的關(guān)系，所以對制備出的粗RFOs 進行分離純化得到高純度的RFOs 非常重要。低聚糖分離純化的依據(jù)主要包括以下幾種：一是低聚糖所處的混合體系中各組分分子量的差異；二是混合體系中各組分在溶劑中溶解度的差異；三是某些帶有可電離基團的酸性或堿性糖所帶電荷的質(zhì)和量的差異。根據(jù)RFOs 各組分的特點，其分離純化的方法主要包括色譜分離法、膜分離技術(shù)以及發(fā)酵分離法，它們都有各自的優(yōu)勢，可根據(jù)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的實際情況選擇合適的方法和條件。

2.1 提取方法

2.1.1 溶劑提取法 溶劑提取法是較為傳統(tǒng)的提取方法，其最先考慮的因素是溶劑的選擇，提取溶劑有乙醇，蒸餾水等，同時要考慮極性溶劑的濃度。影響提取率的主要因素有提取時間、溫度、pH 和料液比。有學(xué)者以乙醇為溶劑，提取豌豆中的棉籽糖家族寡糖，乙醇濃度為50%，在40 ℃下水浴提取30 min，經(jīng)過離心分離和純化，得出的豌豆中棉籽糖家族純度可達80%[2]。錢艷艷等[24]對地黃采用水浸提，得出最佳條件為液料比20:1，提取2 次，提取時間4 h，地黃低聚糖得率為68.27%。盧旭等[25]對蓮子低聚糖進行熱水浸提，采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到水浴浸提蓮子低聚糖的最佳條件為溫度81 ℃，提取時間66 min，液料比80:1，低聚糖得率為8.09%。XIANG 等[26]提取19 種鷹嘴豆的低聚糖，采用乙醇濃度50 %、液料比10:1、提取溫度50 ℃、提取時間30 min 的條件，19 種鷹嘴豆中，低聚糖得率最低為6.35%，最高為8.68%。傳統(tǒng)溶劑提取的方法工藝相對成熟，但其在工業(yè)化應(yīng)用中存在耗能高、提取率相對較低的缺陷。為解決這一產(chǎn)業(yè)難題，微波、超聲波輔助提取等新型提取方式被開發(fā)利用。

2.1.2 輔助提取法 微波輔助提取是一種非常有潛力的新型提取技術(shù)。它將微波和溶劑提取相結(jié)合，通過溶劑使物料直接被加熱，具有提取率高、速度快、溶劑用量少等優(yōu)點。WAN 等[27]用微波輔助提取地黃中的RFOs，在500 W 和80 ℃下進行10 min 的微波輔助提取，RFOs 粗粉的得率為24.3%。欒凱雯等[28]用微波輔助法提取草石蠶中水蘇糖，在微波功率400 W、微波時間5.6 min、溫度60 ℃、液料比25:1，水蘇糖得率為41.18%。SOLARTE 等[29]以固液提取和微波輔助提取從苜蓿葉片、莖和種子中提取碳水化合物并進行了優(yōu)化，其種子提取物富含α-GOS，主要是水蘇糖。相比固液提取，微波輔助提取使時間縮短6.5 倍，得率提高7 倍。由此可見，微波法具有提取時間短、效率高的優(yōu)勢。

與微波相比，超聲輔助提取更簡單、快速。超聲提取使提取溶劑快速地進入固體物質(zhì)中，將目標成分盡可能完全地溶于溶劑之中，達到提高提取率，縮短提取時間、節(jié)約成本的目的。周泉城等[30]研究超聲波輔助提取對擠壓膨化后大豆低聚糖提取率的影響，最佳條件為：超聲波功率200 W，乙醇濃度31.3%、超聲時間34 min、液料比20.4 mL/g，此時得率為11.95%。相同條件下直接用乙醇提取擠壓膨化后的大豆低聚糖得率僅為9.83%。RUZICA 等[19]研究了超聲輔助提取水果和蔬菜中的低聚糖，當乙醇濃度63 %，超聲時間10 min，超聲溫度40 ℃時，低聚糖得率最高。其中，蔥中RFOs 的得率最高，以棉籽糖為主，為1.73±0.061 g/100 g 鮮重，水蘇糖僅存在于菊芋中，為1.29±0.053 g/100 g 鮮重，與傳統(tǒng)水浴提取相比，超聲輔助提取使所有水果和蔬菜中低聚糖的提取率提高了2～4 倍。ANH 等[31]采用超聲法提取玫瑰籽中的糖，并與水浴法進行比較，其中棉籽糖和水蘇糖的濃度分別為17.9 和11.0 mg/g，超聲法提取總糖含量比水浴法高13.1%。

有研究者將超聲-微波聯(lián)合輔助提取應(yīng)用于低聚糖的提取中，很好地結(jié)合兩種技術(shù)的優(yōu)點、彌補各自的不足。XU 等[16]用超聲-微波輔助提取蓮子中的RFOs，其中總低聚糖、三糖和四糖的提取率分別提高了76.59%、17.47%和27.21%，與熱水、超聲輔助、微波輔助提取相比，提取時間分別縮短了12.18、8.92 和1.16 倍。GUO 等[32]采用超聲-微波輔助法對甘薯中RFOs 進行提取，采用響應(yīng)面設(shè)計，得出最優(yōu)條件為：提取時間100 s，超聲功率300 W，微波功率200 W，甘薯RFOs 得率為6.948%。超聲波-微波輔助提取充分利用了微波和超聲空化的高能量效應(yīng)，克服了常規(guī)超聲和微波提取的缺點。

綜上所述，單純?nèi)軇┨崛【哂泻臅r長、提取率低的缺點，微波超聲輔助提取技術(shù)可以顯著地縮短提取時間并提高效率，可以更好地應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)。但在提取過程中，要控制好時間，時間過長會破環(huán)多糖的結(jié)構(gòu)，使糖鏈斷裂，降低提取率。

2.2 分離純化方法

2.2.1 色譜分離法 色譜分離法是利用要分離的各種物質(zhì)在兩相中的分配系數(shù)、吸附能力等親和能力的不同來進行分離。其中，活性炭是一種常用的分離糖類的非極性吸附劑，GULEWICZ 等[2]用活性炭柱層析法對豌豆中的RFOs 進行分離純化，將粗制RFOs 提取物溶于蒸餾水（25 mL）中，后置于燒結(jié)玻璃漏斗中的硅藻土和木炭（1:1 w/w）上，并連接至真空，將漏斗用200 mL 蒸餾水洗滌。并用70 %乙醇（500 mL）洗脫RFOs。蘇娣[33]利用活性炭和硅藻土（1:1 w/w）中壓柱對綠豆中的毛蕊花糖進行分離蔗糖，以5%～50%的乙醇-水進行線性洗脫，發(fā)現(xiàn)乙醇濃度5%時單糖首先被洗出，當乙醇濃度略高于10%時，棉籽糖可被洗脫；當乙醇濃度達到15%時，水蘇糖可被洗脫；當乙醇濃度為20%時，毛蕊花糖可被洗脫，隨后利用Bio-gelp2 凝膠層析柱進一步純化，最終所得毛蕊花糖純度為93.85%?；钚蕴糠蛛x效率高、價格低廉、吸附量大，易于進行工業(yè)化推廣。常見的極性吸附劑是大孔樹脂、硅膠。崔希慶[34]利用AB-8 大孔樹脂對大豆糖蜜中的功能性低聚糖進行分離純化，在最佳條件下的脫色率可達92%，總糖保留率為98.3%，總糖占總固形物的75.40%，洗脫液中棉籽糖為5.31 mg/mL，水蘇糖為20.51 mg/mL。馬璇[35]采用AB-8 大孔樹脂對草石蠶多糖進行純化，當溫度30 ℃、徑高比1:4、流速2 BV/h、pH 為5 時，水蘇糖保留率為82.51%，脫色率為75.34%。與活性炭方法相比，樹脂處理技術(shù)具有精密度高、易再生、使用周期長等優(yōu)勢。目前，硅膠柱層析法有應(yīng)用到甘露寡糖的分離，而凝膠柱層析法在多糖的分離中應(yīng)用較多。離子交換樹脂也是RFOs 分離純化中常用的，此方法分離純化糖類主要受樹脂特性、分離糖類混合物的組成、給料濃度、分離溫度、溶劑種類等方面的影響。田原等[36]選取對大豆糖蜜脫色能力較好的6 種離子交換樹脂，其中，陰離子樹脂LS-21 和陽離子樹脂LS-12 組成混床樹脂效果最好，脫色率可達90%以上。

2.2.2 膜分離法 膜分離法是利用天然或合成的高分子薄膜，在膜兩邊施加一個推動力，原料側(cè)組分會選擇性地透過膜，以達到分離純化的目的[37]。其選擇性強、操作過程簡單、適用范圍廣、能耗低，比較常用的膜分離技術(shù)有超濾和納濾。張敏等[38]采用納濾膜分離技術(shù)對地黃中的水蘇糖進行分離純化，使水蘇糖含量達到了58.84%。王興國等[39]發(fā)現(xiàn)以0.005 μm的陶瓷有機膜作為試驗?zāi)?，在料液溫?0 ℃、濃縮比4.5、時間控制在120～150 min，棉籽糖提取液中的蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)可有效脫除，蛋白質(zhì)脫除率可達87.4%，且沒有損失透過液中的棉籽糖。在工業(yè)生產(chǎn)中，如分離大豆低聚糖，殘留蛋白通過超濾法后，反滲透除鹽，最后納濾精制分離低聚糖。

2.2.3 發(fā)酵分離法 發(fā)酵分離法利用低聚糖難以被微生物發(fā)酵的特點，選取特定的微生物菌株選擇性地去除低聚糖混合體系中的非功能性雜質(zhì)成分。劉玉蘭等[40]去除大豆糖蜜中的蔗糖，以制備大豆功能性低聚糖，采用啤酒酵母發(fā)酵去除，其中蔗糖去除率可達90%，棉籽糖保存率為85.7%，水蘇糖保存率為94.3%。此外，崔希慶等[41]用7 號酵母菌對大豆糖蜜中低聚糖進行分離，分離條件為發(fā)酵pH5.0、接種量為2%、發(fā)酵溫度28 ℃、發(fā)酵時間12 h、大豆糖蜜稀釋8 倍。大豆糖蜜發(fā)酵液中RFOs 的保留率為：棉籽糖99.61%、水蘇糖95.72%。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，有望通過誘變、馴化等技術(shù)手段，培育出對功能性低聚糖中非功能性成分特異性去除的異變菌株，這對低聚糖的純化具有重要的作用。

綜上所述，色譜分離法的效果最好，分離的準確度較高，操作簡單。膜分離法雖分離效率高，但是膜易受損壞或污染、更換不方便，并且成本較高。發(fā)酵分離法雖分離純度率較高，但分離時間較長，并且在發(fā)酵過程中影響因素較多。

3 功能性研究

雖然RFOs 曾被認為是引起腸胃脹氣的重要因素，但近年來大量研究認為其可以作為一種益生元用于開發(fā)潛在的健康促進劑，生理功能主要包括調(diào)節(jié)腸道菌群、預(yù)防炎癥性腸病、保護肝臟、降血糖、降血脂、防止齲齒、促進礦物質(zhì)吸收、保護神經(jīng)細胞等。

3.1 調(diào)節(jié)腸道菌群

人體腸道特別是大腸中棲居著數(shù)量眾多的微生物，其中，細菌的數(shù)量可達1014個，微生物種類超過160 種，它們與機體的健康有著緊密的聯(lián)系[42]。RFOs能夠刺激雙歧桿菌增殖產(chǎn)生短鏈脂肪酸（SFCA），同時抑制腐敗菌及相關(guān)有害物質(zhì)產(chǎn)生；并通過菌體大量生長保持腸內(nèi)滲透壓，刺激腸道蠕動，糞便濕潤度增加，進而起到防止便秘及減少結(jié)腸癌發(fā)病率的作用。XI 等[43]研究了水蘇糖對斷奶小鼠腸道菌群的影響，并評估了水蘇糖是否能改善抗生素攝入后早期的腸道菌群，發(fā)現(xiàn)服用水蘇糖能夠增加斷奶小鼠腸道菌群中阿克曼菌的豐度，提高腸內(nèi)容物乙酸和丙酸水平。姜寶森[44]發(fā)現(xiàn)，在小鼠日糧中添加0.3%棉籽糖，與對照組相比，小鼠盲腸乳酸菌和雙歧桿菌數(shù)分別增加了119.14%和289.51%（P＜0.05），腸桿菌和腸球菌數(shù)分別減少了46.27%（P＞0.05）和62.02%（P＜0.05），說明棉籽糖具有調(diào)節(jié)小鼠腸道菌群的作用。SARINA等[45]通過羊膜給藥程序，將不同濃度的水蘇糖和棉籽糖溶液注入孵化第17 d 的肉雞蛋卵內(nèi)，與對照組相比，棉籽糖和水蘇糖增加了孵化后小雞腸道內(nèi)雙歧桿菌和乳酸桿菌的相對豐度（P＜0.05），降低了致病菌的相對豐度。此外，蘇娣[33]研究了毛蕊花糖對腸道菌群的影響，發(fā)現(xiàn)毛蕊花糖顯著促進雙歧桿菌和乳酸菌（Lactobacillus）的增殖。目前關(guān)于RFOs 調(diào)節(jié)腸道菌群方面的研究已證明RFOs 具備促進腸道益生菌增殖和改善腸道免疫屏障的效果。但除了雙歧桿菌、乳桿菌外，能利用RFOs 的腸道菌群的種類目前尚未有深入研究。因此，除了雙歧桿菌外，其它能夠利用棉籽糖家族的菌群還有待進一步深入研究，以揭示腸道菌群利用RFOs 的機制，闡明RFOs 與腸道細菌的關(guān)系。目前對水蘇糖和棉籽糖的研究較多，對于毛蕊花糖的研究較少，這可能與植物中水蘇糖和棉籽糖的含量相對于毛蕊花糖高，更容易實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)有關(guān)。但水蘇糖、棉籽糖和毛蕊花糖等不同組分配比的RFOs 與腸道菌群的劑效關(guān)系尚不清楚，摸清不同組分配比的RFOs 對腸道菌群的作用效果及機制對開發(fā)RFOs 益生元的應(yīng)用具有十分重要的指導(dǎo)意義。

3.2 保護腸道，預(yù)防炎癥性腸病

炎癥性腸病（Inflammatory bowel disease，IBD）是特征為腸道慢性炎癥性疾病，主要包括潰瘍性結(jié)腸炎（Ulcerative colitis）和克羅恩病（Crohn's disease），其典型特征之一是Treg 細胞數(shù)量減少，其確切病因和發(fā)病機制至今不明，可能由遺傳、腸道屏障功能障礙、免疫系統(tǒng)疾病以及宿主與腸道微生物群之間的異常串擾驅(qū)動[46]。有研究認為，膳食多糖在體內(nèi)被腸道微生物先分解為寡糖，進一步分解產(chǎn)生短鏈脂肪酸，促進腸道Naive CD4＋T 細胞向Treg 細胞的分化，進而改善IBD[47]。目前普遍認為改善IBD 的途徑有直接干預(yù)和間接干預(yù)[48]。直接干預(yù)是通過調(diào)節(jié)相關(guān)細胞因子或調(diào)節(jié)信號通路實現(xiàn)。蘇娣[33]用巨噬細胞RAW264.7 研究毛蕊花糖的體外免疫調(diào)節(jié)能力，發(fā)現(xiàn)毛蕊花糖濃度為200 μg/mL 時，細胞增殖的效果最好，其吞噬中性紅的能力增強，促進NO 和免疫活性分子IL-6、IL-1β等的釋放。HE 等[49]研究水蘇糖對急性結(jié)腸炎小鼠炎癥水平和腸道微生物群的影響，結(jié)果表明，水蘇糖處理可顯著抑制右旋糖酐硫酸鈉（DSS）誘導(dǎo)的炎癥細胞因子的上調(diào)，并改變了腸道菌群的組成，提高了阿克曼氏菌（Akkermansia muciniphila）的水平。也有研究發(fā)現(xiàn)其它寡糖2'-巖藻糖處理感染空腸梭菌毒株的人上皮細胞HT-29，可抑制白細胞介素IL-8、IL-1β促炎信號釋放[50]。近年來關(guān)于IBD 的信號通路研究，主要集中在核因子-κB（NF-κB）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）和過氧化物酶體增殖劑激活受體（PPARs）等。NF-κB 表達的增加伴隨著IL-6、TNF-α、IL-1 等炎性因子分泌能力的增加，且作為控制促炎細胞因子分泌的重要因素，直接參與黏膜組織損傷的發(fā)生[51]。MAPK 包括3 個亞族（ERK、p38 和JNK），被稱作是炎癥和凋亡過程中的“上游里程碑”，且MPAK 的抑制可有效改善IBD 的炎性[52]。PPARs 包含3 個亞型（α、β/δ、γ），PPARs 參與糖脂代謝調(diào)節(jié)、炎癥調(diào)控等多種生理反應(yīng)[53]。XI 等[43]研究發(fā)現(xiàn)水蘇糖能夠在小鼠服用抗生素初期過NF-κB 途徑改善脂多糖介導(dǎo)的炎癥，并降低代謝性疾病的風(fēng)險。也有研究發(fā)現(xiàn)非RFOs 寡糖新瓊脂寡糖可通過MAPK 通路改善IBD，通過下調(diào)脂多糖刺激的巨噬細胞（m?）的MAPK 和NF-κB信號通路來減輕炎癥反應(yīng)[54]。在抗炎作用中，PPAR與MAPK 等信號通路有著密切的關(guān)系，但RFOs 是否可以通過這一途徑來抑制炎癥，進而改善IBD 尚不清楚。

以上是可能進行直接干預(yù)IBD 的途徑，間接干預(yù)IBD 的途徑有以下兩種。一是通過腸道菌群進行干預(yù)。有研究發(fā)現(xiàn)水蘇糖可以通過腸道菌群中阿克曼菌來干預(yù)IBD[43]；二是通過菌群發(fā)酵產(chǎn)物SCFAs來發(fā)揮作用。SCFAs 是一種脂肪尾部由1～6 個碳組成的羧酸，包括甲酸、乙酸、丙酸和丁酸等，在腸道總濃度約為0.5～0.6 mol/L[55]，研究發(fā)現(xiàn)[56]IBD 患者糞便中的丁酸和丙酸水平顯著低于正常人。研究發(fā)現(xiàn)水蘇糖可增加體外培養(yǎng)液中腸內(nèi)容物中丁酸和乙酸的濃度[57]。IBD 與腸道穩(wěn)態(tài)關(guān)系密切，腸道菌群失調(diào)和腸道屏障受損都會引起炎癥。已有研究表明RFOs 可通過調(diào)節(jié)相關(guān)細胞因子和NF-κB 途徑抑制腸道炎癥，并可能通過調(diào)節(jié)腸道菌群及其產(chǎn)物SCFA等改善IBD。但大量研究集中在水蘇糖，系統(tǒng)探究RFOs 各組分改善IBD 的機制的研究尚需進一步深入。

3.3 保護肝臟

肝臟是參與生物毒素和藥物代謝的主要器官。這種代謝（CRP 代謝）總是伴隨著肝細胞生物化學(xué)的紊亂和活性氧的產(chǎn)生，很多肝臟損傷都與氧化還原失衡和氧化應(yīng)激有關(guān)。許多抗氧化劑和植物提取物對化學(xué)性肝損傷具有保護和抗氧化作用[58]。有研究者[59]從一種新植物地黃中分離和鑒定得到了主要由水蘇糖和棉籽糖組成的棉籽糖族低聚糖，評價其對CCl4誘導(dǎo)的小鼠氧化應(yīng)激和肝臟病變的保護作用，結(jié)果表明，連續(xù)21 d 每天口服RFOs 可顯著降低血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、總膽固醇（TC）和甘油三酯（TG）的水平。小鼠實驗發(fā)現(xiàn)水蘇糖可以有效降低由High Fructose 誘導(dǎo)肝損傷的潛在生物標志物β-羥基丁酸的水平[60]，起到預(yù)防HF 飲食性肝損傷的作用。在高脂飲食喂養(yǎng)的大鼠中，12α-羥基化膽汁酸（12αOH-BA）的腸肝循環(huán)因能量攝入而增強。這種膽汁酸代謝可以通過補充膽酸（CA）的飲食進行復(fù)制，MAEGAWA 等[61]研究了飲食中添加棉籽糖是否能改善CA 喂養(yǎng)條件下誘導(dǎo)的大鼠肝臟脂質(zhì)積累，結(jié)果表明，飲食補充棉籽糖可降低肝臟12αOH-BA 濃度，增加盲腸內(nèi)容物中的乙酸濃度。即棉籽糖可通過抑制腸肝12αOH-BA 循環(huán)使肝臟脂質(zhì)積累正?；?。有研究認為腸道微生物代謝產(chǎn)物氧化三甲胺（TMAO）可抑制SIRT3-SOD2-線粒體活性氧信號通路并觸發(fā)氧化應(yīng)激，血栓素NIPNLRP3型炎癥小體被激活[62]，細胞表面CD36 受體表達增加，巨噬細胞、膽固醇加速積累[63]，釋放炎癥細胞因子白細胞介素1、β和18，一氧化氮和一氧化氮合酶生成被抑制，誘發(fā)炎癥和內(nèi)皮功能障礙[64]。RFOs 具有調(diào)節(jié)腸道微生物的作用，但其是否通過上述途徑來發(fā)揮保護肝臟的作用，仍需進一步的研究和驗證。

3.4 降血糖、降血脂

在世界范圍內(nèi)，糖尿?。―M）的發(fā)病率呈上升趨勢，已成為21 世紀主要健康問題之一。RFOs 熱量低，約為蔗糖熱量的50%，是一類低熱量并且具有保健功能的膳食纖維，可作為甜味劑使用，服用后血糖值和胰島素濃度不易升高。在降血糖食品開發(fā)中作為潛在應(yīng)用價值廣泛。有研究者評估水蘇糖對2 型糖尿?。═2DM）小鼠的影響，發(fā)現(xiàn)水蘇糖通過調(diào)控腸道擬桿菌門微生物豐度降低胰腺炎性細胞因子，并且促進糖脂代謝，降低了高脂喂養(yǎng)小鼠的血清TC 和TG 水平[65]。LIANG 等[66]通過尿代謝組學(xué)分析水蘇糖對高脂飲食和低劑量鏈脲子菌誘導(dǎo)的T2DM 大鼠的干預(yù)效果，發(fā)現(xiàn)水蘇糖干預(yù)可調(diào)節(jié)T2DM 大鼠的胰島素、低密度脂蛋白膽固醇和甘油三酯水平。RFO作為益生元，不能被胃腸道消化吸收，調(diào)節(jié)腸道菌群可能是其發(fā)揮生理功效的重要途徑。近年來維持菌群穩(wěn)態(tài)作為T2DM 的新型治療方法備受關(guān)注，干預(yù)調(diào)節(jié)腸道菌群及其代謝產(chǎn)物SCFA、膽汁酸、脂多糖（LPS）等途徑來預(yù)防T2DM（圖2）。主要機制如下：a. SCFAs 可能通過與G 蛋白偶聯(lián)受體GPR41、GPR43結(jié)合或抑制組蛋白去乙酰化酶活性，從而激活宿主的信號傳導(dǎo)，促進機體釋放胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）[67]，SCFA 與GPR41 和GPR43 結(jié)合也抑制了宿主免疫細胞核因子κB 的活化，減輕了炎癥反應(yīng)，從而保護胰島β細胞[68]；b.膽汁酸是膽固醇在肝臟中經(jīng)過多種酶催化形成的代謝產(chǎn)物。初級膽汁酸在葡萄糖代謝中的作用可能是通過法尼醇X 受體（FXR）介導(dǎo)的。研究表明，抑制FXR 可促進GLP-I 的分泌，從而促進胰島素的合成，調(diào)節(jié)糖脂代謝[69]。當FXR 被初級膽汁酸激活時，血漿葡萄糖的水平下降，并伴有糖異生基因表達下降。初級膽汁酸在腸道菌群的作用下被轉(zhuǎn)化為次級膽汁酸，次級膽汁酸主要激活GPR5，兩者在維持葡萄糖代謝穩(wěn)態(tài)和改善胰島素抵抗中起重要作用；c.脂多糖是體內(nèi)重要的炎癥刺激物。當腸道菌群紊亂時，會產(chǎn)生大量的脂多糖，脂多糖進入血液循環(huán)后，可先與脂多糖結(jié)合蛋白相結(jié)合，然后與CD14 細胞相結(jié)合，并可激活Toll 樣受體-4（TLR-4）信號通路，使機體出現(xiàn)不同程度的炎癥反應(yīng)，引發(fā)胰島素抵抗[70]。以上是通過腸道菌群代謝物來抑制糖尿病的幾個通路，也有研究發(fā)現(xiàn)，殼寡糖可通過抑制腸道α-葡萄糖苷酶和葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白SGLT1 和GLUT2 表達，逆轉(zhuǎn)胰島素抵抗，發(fā)揮抗糖尿病作用[71]，但RFOs 是否可以通過腸道菌群代謝物以及抑制腸道α-葡萄糖苷酶和葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白的表達這幾種途徑來抑制2 型糖尿病的研究尚未見報道。RFOs 調(diào)控血糖、血脂的作用機制還有待進一步深入研究。RFOs 中的水蘇糖已被證明具有改善糖脂代謝的作用，但棉籽糖和毛蕊花糖在這方面的作用尚不可知，探究RFOs 其它組分及各組分配比與降血糖、降血脂作用的劑效關(guān)系對開發(fā)RFOs 抗糖尿病產(chǎn)品具有重要的指導(dǎo)意義。

圖2 腸道菌群調(diào)節(jié)宿主血糖的信號機制Fig.2 Signaling mechanism of intestinal flora regulating host blood glucose

3.5 其他功能

變形鏈球菌是齲病的主要致病菌，能迅速發(fā)酵單糖和二糖產(chǎn)酸，人和動物體內(nèi)不存在α-半乳糖苷酶系統(tǒng)，致使RFOs 不能在口腔被分解成果糖、葡萄糖、半乳糖等單糖，因而RFOs 不會被變異鏈球菌分解利用，從而起到抗齲齒的作用[72]。結(jié)腸的pH 對礦物質(zhì)的吸收有著重要的影響，RFOs 會使結(jié)腸微生物產(chǎn)生大量的SCFA，結(jié)腸內(nèi)的pH 降低，鈣離子濃度提高，加速鈣、鉀等礦物質(zhì)的吸收，使骨骼礦物質(zhì)的密度增強，以緩解骨質(zhì)疏松癥[73]。此外，研究發(fā)現(xiàn)當鉛進入人體后，會干擾人體對鐵、鋅、鈣離子的吸收，水蘇糖對鉛有一定的螯合能力，可以通過促進鉛排出，緩解因鉛過量而導(dǎo)致的機體缺鈣、鐵、鋅等癥狀[35]。另有研究發(fā)現(xiàn)地黃中的水蘇糖和棉籽糖能夠起到治療和預(yù)防慢性肺阻塞的作用[74]，其他來源的RFOs 是否可以保護神經(jīng)細胞和預(yù)防慢性肺阻塞的研究還未曾發(fā)現(xiàn)。

4 總結(jié)和展望

棉籽糖家族系列寡糖普遍存在于自然界，但在豆類種子、蓮子及水蘇、地黃、草石蠶等植物中含量較為豐富。目前工業(yè)中用于提取RFOs 的原料多為豆類和地黃等。提取工藝相對成熟，多為微波、超聲輔助溶劑提取的方法。但高純度RFOs 的生產(chǎn)仍面臨著耗材成本高等難題。因此，高效、低成本的RFOs工業(yè)化生產(chǎn)技術(shù)仍待進一步的研究開發(fā)。RFOs 作為一種功能性寡糖，已被證實可以促進機體內(nèi)有益菌的增殖，并具有改善免疫系統(tǒng)的能力、保護肝臟及調(diào)節(jié)糖脂代謝的潛在功能。目前，棉籽糖家族低聚糖已經(jīng)作為益生元添加到多種食品中，例如嬰兒奶粉、保健飲料、面包、糕點糖果等。RFOs 因不能被人體胃腸道吸收，其保健功能通常被認為是通過調(diào)節(jié)腸道菌群實現(xiàn)的。但其在機體內(nèi)發(fā)揮活性功能的具體機制尚不清楚，有待進一步深入研究。隨著食品科技和工業(yè)的發(fā)展，人們對RFOs 的認識水平的不斷提高，其潛在的應(yīng)用價值和經(jīng)濟效益會受到越來越多的重視，開發(fā)和應(yīng)用領(lǐng)域也會更加廣闊。