設計優(yōu)化微波輔助法提取草石蠶中水蘇糖

欒凱雯，賀夢瑤，劉佳欣，湯興楠，朱建星，張萬忠

沈陽化工大學制藥與生物工程學院（沈陽 110142）

水蘇糖是在唇形科、豆科、玄參科等多種植物中存在的功能性低聚糖，其中在草石蠶中含量最高。水蘇糖分子式為C24H42O21，分子量666.59，屬于低聚半乳糖，被譽為“超強雙歧因子”，被廣泛用于食品、醫(yī)藥等領域[1-2]。 水蘇糖對腸道有益菌如雙歧桿菌、乳桿菌有特異性的增殖作用[3]，每天攝入0.5～3 g水蘇糖即有效果[4]。水蘇糖能增加機體對礦物元素的吸收，被認為與盲腸中的L-乳酸的提高有關(guān)[5]。

微波輔助提取法具有快速高效、節(jié)省溶劑、工藝簡單、應用面廣泛等特點[6-10]。此次試驗采用微波輔助法對干品草石蠶中水蘇糖進行提取，借助響應曲面以水蘇糖提取率為響應值，對微波輔助提取草石蠶中水蘇糖的工藝進行優(yōu)化（微波功率、微波時間、微波溫度和料液比），得到最優(yōu)的提取條件。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

草石蠶干品（亳州市康易飲生物科技有限公司）；蒸餾水；水蘇糖標準品（純度98%，廣東深圳潤慧生物科技有限公司）；乙腈（色譜純，德國SIMARK）。

GB1302型電子精密天平（梅特勒托利多儀器公司）；Agilent1200高效液相色譜儀；Mars6微波消解儀[培安CEM微波化學（中國）技術(shù)中心]；小型高速粉碎機（北京興時利和科技發(fā)展有限公司）；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器責任公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 水蘇糖標準溶液的配制

稱取100 mg水蘇糖標準品溶于10 mL容量瓶中，加入蒸餾水溶解定容到10 mL，此時得到10 mg/mL的標準品溶液，將此標準溶液逐級稀釋成8，6，4和2 mg/mL的標準溶液，經(jīng)孔徑0.45 μm微孔膜過濾后待用。

1.2.2 水蘇糖標準曲線的繪制

將過膜后不同濃度的水蘇糖標準品分別利用高效液相法[11-14]進行分析，進樣量均為20 μL，每種濃度標準品重復進樣3次，取平均值，以水蘇糖的濃度（X，mg/mL）與它們對應的峰面積（Y）進行線性回歸，繪制水蘇糖的標準曲線，得到水蘇糖標準曲線Y= 58 017.1X-43 538.4，R2=0.999 5。

1.2.3 色譜條件

色譜柱，TIANHE Kromasil NH2柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為V乙腈∶V水=70∶30；流速1 mL/min，柱溫40 ℃，進樣量20 μL。

1.3 水蘇糖的提取工藝及提取率測定

草石蠶干品粉碎過0.150 mm（100目）篩，得到草石蠶干品粉末，稱取若干份草石蠶粉末，以微波輔助法提取，抽濾得到上層溶液后過膜進樣，計算草石蠶中水蘇糖含量。水蘇糖提取率按式（1）計算。

式中：n為稀釋倍數(shù)；V為提取液體積，mL；Q為提取液水蘇糖含量，mg/mL；W為干粉質(zhì)量，g。

1.4 單因素試驗

選擇料液比（1∶10，1∶15，1∶20，1∶25和1∶30 mg/mL）、提取溫度（40，50，60，70和80 ℃）、提取時間（2，4，6，8和10 min）、微波功率（200，300，400，500和600 W）進行單因素試驗，考察其對草石蠶中水蘇糖提取率的影響。

1.5 響應面優(yōu)化試驗

在單因素試驗基礎上，根據(jù)Box-Behnken試驗設計原理，采用Design-Expert軟件，以水蘇糖提取率為影響值進行響應曲面優(yōu)化，響應面因素和水平見表1。

表1 響應面因素和水平表

1.6 數(shù)據(jù)分析

通過SPSS 17.0軟件統(tǒng)計進行數(shù)據(jù)方差分析，p＜ 0.01表示差異具有顯著統(tǒng)計學意義，試驗結(jié)果用作圖軟件Origin 9.0繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 料液比對水蘇糖提取率的影響

在提取溫度50 ℃、提取時間4 min、微波功率400 W的條件下，料液比對水蘇糖提取率的影響如圖1所示。隨著液體比例不斷增加，提取率不斷增加，料液比1∶25 mg/mL時達到最大值，因為隨著溶液體積分數(shù)增加，草石蠶干品與溶液得到充分接觸，使得水蘇糖溶解率增加。料液比超過1∶25 mg/mL時，水蘇糖的溶解度達到飽和，其他雜質(zhì)溶出影響水蘇糖的溶出，使得提取率下降。故料液比1∶25 mg/mL最合適。

圖1 料液比對水蘇糖提取率的影響

2.1.2 提取溫度對水蘇糖提取率的影響

在料液比1∶25 mg/mL、提取時間4 min、微波功率400 W的條件下，提取溫度對水蘇糖提取率的影響如圖2所示。隨著提取溫度不斷增加，提取率不斷增加，提取溫度60 ℃時達到最大值，當溫度繼續(xù)增加時，水蘇糖得率不斷下降，可能是因為溫度短時間內(nèi)迅速升高加速其他雜質(zhì)大量溶出，阻礙水蘇糖的溶出。故提取溫度選擇60 ℃最合適。

圖2 提取溫度對水蘇糖提取率的影響

2.1.3 提取時間對水蘇糖提取率的影響

在提取溫度60 ℃、料液比1∶25 mg/mL、微波功率400 W的條件下，提取時間對水蘇糖提取率的影響如圖3所示。隨著提取時間增加，水蘇糖得率先增加后下降，在6 min時得率達到峰值，8 min時開始下降，可能是使用微波提取時間過長會引起水蘇糖結(jié)構(gòu)的破壞，故提取時間6 min最合適。

圖3 提取時間對水蘇糖提取率的影響

2.1.4 微波功率對水蘇糖提取率的影響

在提取溫度60 ℃、提取時間6 min、料液比1∶25 mg/mL的條件下，微波功率對水蘇糖提取率的影響如圖4所示。微波功率對水蘇糖的提取影響較大，隨著微波功率增加，提取率大幅增加，400 W時達到最大值。原因可能是隨著微波功率增加，分子運動逐漸劇烈，增加了水蘇糖的溶出，微波功率繼續(xù)增大，微波產(chǎn)生的強烈作用使水蘇糖結(jié)構(gòu)遭到破壞，提取率下降。故微波功率選擇400 W最合適。

圖4 微波功率對水蘇糖得率的影響

2.2 響應面優(yōu)化試驗結(jié)果

2.2.1 回歸模型的構(gòu)建及方差分析

水蘇糖提取設計方案及結(jié)果見表2，回歸方差分析見表3，擬合所得多元二次回歸方程：Y=41.23+ 0.51A-0.13B-0.23C+0.036D-1.18AB-0.70AC+7.500E-003AD+0.38BC+0.48BD+0.12CD-1.07A2-1.88B2-2.50C2-1.32D2。

表2 響應面試驗設計和試驗結(jié)果

由表3可知，該回歸模型達到極顯著水平（p＜ 0.01），失擬項不顯著，R2=0.916 0，表明該模型的擬合程度較好，水蘇糖的提取率可以用該模型進行分析和預測。通過對比表3中的F值可以得出，影響水蘇糖提取率的主次順序為A＞C＞B＞D，即提取功率＞提取溫度＞提取時間＞料液比。

表3 回歸模型方差分析表

2.2.2 各因素間的交互作用

根據(jù)回歸方程做出的各兩因素交互作用的響應面分析見圖5。微波功率（A）和提取時間（B）交互（AB）的影響顯著。

圖5 各兩因素交互作用響應面

2.2.3 最優(yōu)條件的確定及驗證試驗

用Design-Expert 8.0.6軟件對二次多項式回歸方程進行計算，得到提取水蘇糖的最佳工藝條件：微波功率400 W、提取時間5.6 min、提取溫度60 ℃、料液比1∶25 mg/mL。水蘇糖提取率的理論最優(yōu)值是41.35%。參照試驗條件進行驗證試驗，得到的水蘇糖提取率為41.18%，與理論值的相對誤差為0.17%，說明該方法具有一定可操作性。

3 結(jié)論

以響應曲面法來優(yōu)化微波輔助法提取水蘇糖條件，確定最佳提取條件：提取時間5.6 min、提取溫度60 ℃、微波功率400 W，料液比1∶25 mg/mL，水蘇糖的提取率可達41.18%。綜上，利用響應曲面法對草石蠶中水蘇糖的提取工藝進行優(yōu)化的方法是科學的，為從草石蠶中提取水蘇糖以及對水草石蠶中水蘇糖的開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。