復(fù)方鴉膽子油軟膠囊質(zhì)量標準及初步藥效學(xué)研究

王 娉 ，王 堅 ，黃繩武

（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江杭州 310053； 2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院，浙江杭州 310003）

復(fù)方鴉膽子油軟膠囊主要由鴉膽子油和蟾皮超微粉兩味藥組成，鴉膽子油是從苦木科植物鴉膽的干燥成熟果實中提取得到的脂肪油，具有清熱解毒［1］、抗瘧、抗炎和抗腫瘤的作用［2-4］，是一種療效確切、毒副作用小的抗腫瘤藥物［5］，可用于治療肺癌、肺癌腦轉(zhuǎn)移、肝癌、胃癌［6］和乳腺癌等多種惡性腫瘤，臨床上與化療藥合用可提高療效，毒副反應(yīng)少，很少出現(xiàn)惡心、嘔吐、厭食、脫發(fā)、血細胞計數(shù)下降和骨髓抑制等常規(guī)化療藥的毒副反應(yīng)［7-8］。蟾皮具有清熱解毒、利水消腫的功能，用于治療咽喉腫痛、腫瘤等［9］?；瘜W(xué)成分研究表明，華蟾酥毒基和脂蟾毒配基是蟾皮中抗腫瘤活性成分。本試驗采用薄層色譜（TLC）法定性鑒別鴉膽子油和蟾皮微粉，并采用氣相色譜（GC）法測定復(fù)方鴉膽子油軟膠囊中油酸含量，高效液相色譜法（HPLC）測定華蟾酥毒基和脂蟾毒配基的總含量，制備S180腹水型腫瘤小鼠模型，考察其對腫瘤的藥效作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗儀器 SP-Ⅲ型條帶電動點樣器，Goodsee-Ⅰ型薄層色譜攝影儀，GC-14A氣相色譜儀，CP225D準微量電子分析天平，METTLER TOLEDO電子天平，高效液相色譜儀，LC2130輸液泵（配梯度洗脫和在線洗脫裝置），LC2030紫外檢測器，手動進樣器，色譜工作站，T2000P OLYMPUS-CKX41倒置萬能顯微鏡，AB104-N電子分析天平，BILON電熱恒溫水浴箱，TGLA-16高速離心機。

1.1.2 藥物與試劑 油酸對照品（111621-201004）、亞油酸（111622-20101004）、華蟾酥毒基對照品（10803-200605）、脂蟾毒配基對照品（110718-200507）均由中國生物制品檢定所提供；乙酸乙酯，三氯甲烷，丙酮，環(huán)己烷，復(fù)方鴉膽子油軟膠囊（自制，批號20121113、20121103、20121027），復(fù)方鴉膽子油軟膠囊（自制，20121123），環(huán)磷酰胺凍干粉針劑，生理鹽水，臺盼藍。小鼠S180腹水型腫瘤細胞（由浙江省醫(yī)科院提供）。

1.1.3 實驗動物 ICR小鼠100只［SPF級，雌雄各半，4w～6w，體重（20±2）g，浙江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供］。

1.2 方法與結(jié)果

1.2.1 薄層方法研究

1.2.1.1 薄層色譜條件 油酸薄層條件：硅膠板GF254，以105℃活化30min，取出備用；展開劑為石油醚-乙酸乙酯-冰醋酸（8.5∶1.5∶0.1），預(yù)飽和 30min，置展開缸內(nèi)展開。揮去溶媒，碘蒸汽熏蒸顯色，紫外燈下觀察。蟾皮薄層條件：硅膠板GF254，以105℃活化30min，取出備用；展開劑為環(huán)己烷-三氯甲烷-丙酮（4∶3∶3），展開，取出，晾干，噴以 10%硫酸乙醇溶液，加熱至斑點顯色清晰。

1.2.1.2 對照品溶液配制 稱取鴉膽子油0.051g，加正己烷1.0mL溶解，制備鴉膽子油對照溶液備用；稱取油酸對照品0.011g，加正己烷1.0mL溶解，制備油酸對照溶液備用；分別稱取華蟾酥毒基對照品1.4mg、脂蟾毒配基對照品1.4mg，置10mL容量瓶中，加甲醇定容，制備華蟾酥毒基和脂蟾毒配基混合對照溶液備用。

1.2.1.3 供試品溶液配制 取3批制劑各4粒，剖開取內(nèi)容物，加正己烷10mL，超聲5min，過膜，制備供試品溶液1備用。取3批制劑各10粒，剖開取內(nèi)容物，加甲醇20mL，加熱回流60min，過濾，濾液過膜，搖勻制備供試品溶液2備用。

1.2.1.4 樣品測定 依法對樣品進行鑒別，鴉膽子油薄層色譜結(jié)果顯示：供試品色譜中在與鴉膽子油對照液、油酸對照溶液相應(yīng)位置上顯相同暗黑色斑點，陰性無干擾。蟾皮薄層色譜結(jié)果顯示：供試品色譜中在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的一個綠色及一個藍色斑點，陰性無干擾。結(jié)果見圖1、圖2。

1.2.2 GC測定復(fù)方鴉膽子油軟膠囊中油酸含量

圖1 復(fù)方鴉膽子油軟膠囊油酸薄層鑒別結(jié)果

圖2 復(fù)方鴉膽子油軟膠囊蟾皮薄層鑒別結(jié)果

1.2.2.1 色譜條件 色譜柱：DM-Inert Wax毛細柱（30mm×0.25mm×0.25μm）；柱溫：150℃；進樣口溫度：250℃；檢測器溫度：250℃；載氣為高純氮，流速1.0mL/min；恒流分流比 30∶1，柱前壓 10psi。柱溫采用程序升溫方式，150℃（停留1min）－200℃（10℃/min，停留 2min）－220℃（10℃/min，停留 10min）。在本色譜條件下，樣品中油酸與其他成分能夠達到基線分離，且分離度大于1.5，理論塔板數(shù)按油酸峰面積計算，不低于40000。對照品、溶劑、空白、樣品色譜圖見圖3～圖6。

圖3 對照品色譜圖

圖4 溶劑色譜圖

圖5 空白色譜圖

圖6 樣品色譜圖

1.2.2.2 對照品溶液制備 精密稱取油酸對照品33.8mg，至25mL容量瓶中，加正己烷溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成 1.352mg/mL 對照品溶液［10］。

1.2.2.3 供試品溶液制備 取復(fù)方鴉膽子油軟膠囊內(nèi)容物適量，置10mL容量瓶中，加正己烷定容，取1mL按照對照品溶液的制備項操作，即得樣品溶液。

1.2.2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取1.352mg/mL油酸對照品溶液 0.4mL、0.8mL、1.2mL、1.6mL、2.0mL、2.4mL至15mL具塞試管中加入0.5moL/L氫氧化鉀甲醇溶液2mL，在60℃恒溫水浴中皂化25min；待油珠完全溶解后，放冷，加入15%三氟化硼乙醚溶液2mL，搖勻，在60℃恒溫水浴中甲酯化2min，放冷，精密加入正己烷2.0mL，充分振搖2min；加入過飽和氯化鈉溶液適量，使正己烷溶液上浮至瓶頸，立即吸取上層有機液，用0.5g無水硫酸鈉脫水，制得系列對照品溶液；分別精密吸取對照品溶液進樣，測定峰面積，以面積為縱坐標，以對照品溶液的濃度為橫坐標，繪制標準曲線。油酸在0.2704mg/mL～1.6224mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好?；貧w方程：Y=433993X+4816，相關(guān)系數(shù)R=0.9996。

1.2.2.5 精密度實驗 取復(fù)方鴉膽子油軟膠囊的供試品溶液一份，連續(xù)進樣6次，結(jié)果各峰面積相對標準偏差小于3%。

1.2.2.6 重復(fù)性實驗 取復(fù)方鴉膽子油軟膠囊樣品，分別平行制備6份供試品溶液，進樣測定，計算含量，相對標準偏差小于3%。

1.2.2.7 穩(wěn)定性實驗 取復(fù)方鴉膽子油軟膠囊供試品一份，分別于 0h，2h，4h，6h，8h，10h 進樣測定，峰面積相對標準偏差小于3%。

1.2.2.8 回收率實驗 精密量取對照品溶液適量于容量瓶中，按供試品溶液制備方法分別平行制備6份加樣回收溶液，進樣測定，計算回收率，其平均回收率在95%～105%之間。

1.2.2.9 含量測定 依法測定6份復(fù)方鴉膽子油軟膠囊中油酸含量，平行測定，結(jié)果見表1。

表1 復(fù)方鴉膽子油軟膠囊中油酸含量測定結(jié)果

1.2.3 HPLC測定華蟾酥毒基和脂蟾毒配基含量

1.2.3.1色譜條件色譜柱：kromasil C18（4.6mm×250mm，5μm）（瑞典）；流動相：乙腈（A）-水（B）（50∶50）；流速：1mL/min；柱溫：30℃；檢測波長：296nm。對照品、空白、樣品、溶劑色譜圖見圖7～圖10。

1.2.3.2 對照品溶液制備 取華蟾酥毒基對照品1.4mg、脂蟾毒配基對照品1.4mg，置10mL容量瓶中，加甲醇定容，即得。

1.2.3.3 供試品溶液制備 取膠囊內(nèi)容物適量，置50mL錐形瓶中，加甲醇，稱重，加熱回流1h，放冷，加甲醇至恒重，搖勻，過微孔濾膜（0.45μm），取續(xù)濾液。

圖7 溶劑色譜圖

圖8 空白色譜圖

圖9 對照品色譜圖

圖10 樣品色譜圖

1.2.3.4 線性關(guān)系考察 標準曲線的制備：分別將對照品溶液稀釋成 0.0056mg/mL，0.0168mg/mL，0.0280mg/mL，0.0392mg/mL，0.0504mg/mL，0.0616mg/mL，分別進樣10μL分析，以樣品峰面積對樣品濃度作圖，得華蟾酥毒基標準曲線：Y=11351573.9796X+20148.6143，相關(guān)系數(shù)R=0.9998；脂蟾毒配基標準曲線：Y=5590923.4694X+14457.3048，相關(guān)系數(shù)R=0.9996；線性范圍0.0056mg/mL～0.0616mg/mL。

1.2.3.5 精密度實驗 取復(fù)方鴉膽子油軟膠囊的供試品溶液1份，連續(xù)進樣6次，結(jié)果各峰面積相對標準偏差小于3%。

1.2.3.6 重復(fù)性實驗 取復(fù)方鴉膽子油軟膠囊樣品，分別平行制備6份供試品溶液，進樣測定，計算含量，相對標準偏差小于3%。

1.2.3.7 穩(wěn)定性實驗 取復(fù)方鴉膽子油軟膠囊供試品 1份，分別于 0h，2h，4h，6h，8h，10h 進樣測定，峰面積相對標準偏差小于3%。

1.2.3.8 回收率實驗 精密量取對照品溶液適量于容量瓶中，按供試品溶液制備方法分別平行制備6份加樣回收溶液，進樣測定，計算回收率，其平均回收率在95%～105%之間。

1.2.3.9 含量測定 依法測定9份復(fù)方鴉膽子油軟膠囊中華蟾酥毒基和酯蟾毒配基的含量，平行測定，結(jié)果見表2。

表2 復(fù)方鴉膽子油軟膠囊中華蟾酥毒基和酯蟾毒配基含量測定結(jié)果

1.2.4 復(fù)方鴉膽子油軟膠囊初步藥效學(xué)研究之抑瘤率實驗

1.2.4.1 S180荷瘤小鼠模型建立 于液氮罐中取出S180腹水型腫瘤細胞株1支，置于37℃電熱恒溫水浴箱內(nèi)，輕輕搖動令其盡快融化。取出凍存管，用酒精消毒后開啟，用吸管吸出細胞懸液，注入離心管并滴加15%胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)基，常規(guī)離心，制成瘤細胞混懸液，臺盼藍計數(shù)約為1×107/mL瘤細胞。取0.2mL（1×106～2×106個瘤細胞）接種于腹腔。傳代3次后選擇接種7d的S180荷瘤小鼠，脫頸處死，抽取小鼠腹腔內(nèi)腹水，用生理鹽水適當稀釋后，計數(shù)，調(diào)整濃度至2×107/mL，用無菌注射器吸取瘤細胞混懸液0.2mL注射在小鼠左前肢腋下，每只0.2mL。

1.2.4.2 分組與給藥 取50只接種后的ICR小鼠，稱重記錄體重，按體重和性別隨機分為5組：高劑量組（換算成鴉膽子生藥量189.2mg/kg，蟾皮316.8mg/kg，0.2mL/10g體重）、中劑量組（換算成鴉膽子生藥量94.6mg/kg，蟾皮158.4mg/kg，0.2mL/10g體重）、低劑量組（換算成鴉膽子生藥量47.3mg/kg，蟾皮79.2mg/kg，0.2mL/10g體重）、模型組（生理鹽水，0.2mL/10g體重）、環(huán)磷酰胺組（環(huán)磷酰胺2.5mg/kg，0.1mL/10g體重）。環(huán)磷酰胺組采用腹腔注射方式，其余組采用灌胃給藥。

1.2.4.3 數(shù)據(jù)收集與指標檢測 連續(xù)灌胃給藥11d，給藥期間觀察記錄小鼠的一般情況（飲食、外觀、行為、分泌物、排泄物、中毒表現(xiàn)和死亡情況等），定期稱荷瘤小鼠體重，停藥后第2天記錄體重，脫頸處死后解剖，剝?nèi)∧[瘤組織、脾臟、胸腺，電子天平稱重，記錄。記錄給藥前后小鼠體重變化、平均瘤重，計算抑瘤率；根據(jù)解剖后小鼠胸腺和脾臟重量，計算胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)。運用SPSS 16.0軟件對相關(guān)數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料采用均數(shù)±標準差（±s）表示，組間計量資料比較采用t檢驗。

1.2.4.4 各組小鼠抑瘤率及胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)比較 在給藥前期（1～6d）小鼠的一般情況總體良好；在接種后5d～7d，可以直觀看見小鼠腋下腫大的瘤塊；在給藥后期（7d～11d）隨著瘤體的增大，部分小鼠活動能力減弱，進食減少。模型組、低劑量組小鼠后期體重增長緩慢，皮毛凌亂無光澤；高劑量組小鼠體重增長趨勢穩(wěn)定，皮毛柔順且有光澤。

與模型組比較，環(huán)磷酰胺組和復(fù)方鴉膽子油高、中、低劑量組小鼠平均腫瘤重量降低，脾臟指數(shù)升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），表明復(fù)方鴉膽子油軟膠囊給藥后可以改善小鼠的機體免疫力，提高免疫器官的臟器指數(shù)。結(jié)果見表3、表4。

表3 各組小鼠抑瘤實驗結(jié)果比較 （g，±s）

表3 各組小鼠抑瘤實驗結(jié)果比較 （g，±s）

注：與模型組比較，1）P<0.05

組別 n 實驗前體質(zhì)量 實驗后體質(zhì)量 平均腫瘤重量 抑瘤率（%）模型組 10 20.34±1.32 24.43±2.78 1.330±0.142 -環(huán)磷酰胺組 10 23.49±1.13 27.58±5.51 0.818±0.1091） 38.51低劑量組 10 20.19±1.11 25.05±2.48 1.037±0.2341） 22.08中劑量組 10 20.44±1.02 25.13±2.31 0.947±0.3471） 28.87高劑量組 10 19.24±1.12 25.31±2.34 0.868±0.1931） 34.82

表4 各組小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)比較 （mg/g，±s）

表4 各組小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)比較 （mg/g，±s）

注：與模型組比較，1）P<0.05

組別 n 胸腺指數(shù) 脾臟指數(shù)模型組 10 12.209±0.334 34.328±1.252環(huán)磷酰胺組 10 9.953±0.945 44.838±0.5771）低劑量組 10 11.903±0.467 38.692±1.1351）中劑量組 10 12.409±0.656 42.277±1.2461）高劑量組 10 12.079±0.357 44.838±0.7641）

1.2.5 生命延長率實驗 取50只接種后的ICR小鼠，分組、給藥同1.2.4.2。從給藥第11天開始停止給藥，繼續(xù)飼養(yǎng)觀察，在觀察期間記錄小鼠的一般情況（飲食、外觀、行為、分泌物、排泄物、中毒表現(xiàn)和死亡情況等），定期稱荷瘤小鼠體重，記錄小鼠的死亡情況。運用SPSS 16.0軟件對相關(guān)數(shù)據(jù)進行統(tǒng)學(xué)處理。計量資料采用均數(shù)±標準差（±s）表示，組間計量資料比較采用t檢驗。

結(jié)果表明，未形成腹水前，小鼠的一般狀態(tài)良好，但是隨著腹水的增多，小鼠行動減緩，進食少，精神狀態(tài)極差。環(huán)磷酰胺組和復(fù)方鴉膽子油高、中、低劑量組荷瘤小鼠的生存天數(shù)均提高，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），結(jié)果見表5。

2 討 論

薄層板和展開缸應(yīng)預(yù)飽和至少15min，薄層板使用之前需活化。3批復(fù)方鴉膽子油軟膠囊樣品，油酸的含量最高為0.664%，最低為0.622%，故建議將復(fù)方鴉膽子油軟膠囊中油酸的檢查限度設(shè)定為0.622%。華蟾酥毒基和脂蟾毒配基總含量最高為0.0246%，最低為0.0209%，故建議將復(fù)方鴉膽子油軟膠囊中華蟾酥毒基和脂蟾毒配基總含量的檢查限度設(shè)定為0.0209%。脾臟和胸腺是機體重要的免疫器官，二者對細胞毒劑高度敏感，在化療藥物作用下明顯萎縮，其組織結(jié)構(gòu)較快地發(fā)生嚴重損傷。從延長患者生命，提高患者生存質(zhì)量的角度出發(fā)，抑瘤率和生命延長率是驗證一種藥物是否有效的藥效學(xué)的2個整體評估指標。

表5 各組生命延長率實驗結(jié)果

3 結(jié) 論

本實驗采用薄層色譜法、氣相色譜法和高效液相色譜，以不同指標分別對復(fù)方鴉膽子油軟膠囊的質(zhì)量進行了較全面的評價，并對建立的方法進行了詳盡的方法學(xué)考察，為復(fù)方鴉膽子油軟膠囊質(zhì)量標準的提高提供了實驗依據(jù)，可進一步指導(dǎo)安全有效的用藥。本實驗采用ICR小鼠S180腹水瘤模型觀察鴉膽子油給藥對荷瘤小鼠生命延長率以及抑瘤效果的影響。同時設(shè)生理鹽水組作陰性對照，環(huán)磷酰胺化療組為陽性對照。實驗結(jié)果表明，復(fù)方鴉膽子油軟膠囊不僅能延長荷瘤小鼠的生存天數(shù)，還可以抑制腫瘤生長，具有良好的藥理作用，為臨床的推廣應(yīng)用提供了依據(jù)。

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