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    遠志及其近緣種的ITS序列分析及鑒定

    2014-12-02 04:36:34束明月
    關(guān)鍵詞:靈丘遠志藥用植物

    樊 杰,白 妍,束明月

    (山西中醫(yī)學(xué)院,山西太原 030024)

    遠志屬是一個世界性分布的大屬,尤以熱帶、亞熱帶為盛,約500種[1]。我國遠志屬有42種8變種,全國分布,以西南和華南地區(qū)最多[1-2]。遠志屬植物含有豐富的三萜皂苷、口山酮、寡糖酯類成分及其他活性成分,組成該屬植物生理活性的有效物質(zhì)群,具有鎮(zhèn)咳、祛痰、益智、安定、解毒消腫、補益強壯等作用[3-4]。在臨床和民間常用于心神不安、驚悸、失眠健忘、咳痰不爽、瘡瘍腫毒等。其中,遠志和卵葉遠志是中藥遠志的基源植物[5],二者從植物形態(tài)到藥材鑒定均不易區(qū)別[6]。瓜子金在外部形態(tài)上與這2個種非常類似,但化學(xué)成分略有不同[3]。核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer,ITS)序列在藥用植物的分子鑒定、遺傳多樣性等方面有大量研究[7-8],本研究通過測定ITS序列,分析卵葉遠志、遠志和瓜子金的差異,為這3種藥用植物的分子鑒定,為藥材遠志基源植物的選擇提供科學(xué)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 實驗材料

    遠志采自山西靈丘,常溫下自然干燥并保存1年;從Genbank數(shù)據(jù)庫獲得另外2個種的2條ITS序列和遠志的另外2條ITS序列,結(jié)果見表1。

    1.2 DNA的提取方法

    DNA的制備采用改良CTAB法[9],略作改動,具體為:稱取約0.1g葉片,在提前-20℃預(yù)冷的研缽中研磨成粉末后用于DNA的提取。水浴溫度45℃,水浴5~6h,加異丙醇沉淀1h。

    表1 樣品來源及ITS序列信息

    1.3 PCR擴增及測序

    ITS片段均無法1次完成PCR擴增,所以分為ITS1和ITS22段擴增,引物參考文獻[10]中的引物,使用的引物包括 ITS forward:5′-cga gaa gtc cac tga acc tta tc-3′,ITS reverse:P1:5′-tct tyt cct ccg ctt att gat atgc-3′和 ITS internal reverse:5′-gcg ttc aaa gac tcg atg gtt c-3′,ITS internal forward:5′-gac tct cgg caa cgg ata tct cggc-3′。PCR反應(yīng)在 PTC-200型PCR儀上進行。PCR總體積為25μL,包括:12.5μL Mix(Takara Premix Taq),10μm 引物各 0.5μL,0.5~1μL 模板(10~50ng),用滅菌超純水補足反應(yīng)體積。擴增程序為:94℃,3min;33個循環(huán):94℃,1min;58℃,1min;72℃,1min 20s;72℃,6min。PCR 產(chǎn)物10μL用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,PCR產(chǎn)物送華大基因測序。

    1.4 序列提交與分析

    序列通過Sequin軟件提交至NCBI數(shù)據(jù)庫,并獲得相應(yīng)登錄號。ClustalX 1.81軟件用于序列比對,采用MEGA 3.1軟件計算遺傳距離并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 ITS序列比較

    測序結(jié)果表明,序列中除ITS1和ITS2的全長外,還包含5.8S、18S和28S的部分序列,遠志的ITS序列已提交至NCBI,Genbank登錄號見表1。序列分析結(jié)果表明,遠志屬3種藥用植物ITS1長度為269~271bp,G+C 量為 63.1%~63.4%;ITS2的長度為216~217bp,G+C 量為64.4%~65.0%。結(jié)果見表2。

    表2 遠志屬3種藥用植物ITS序列長度和G+C含量

    2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

    利用MEGA 3.1軟件計算ITS的變異位點及信息位點,結(jié)果表明,5.8S基因無變異;ITS1序列有19個變異位點,占總位點數(shù)的6.76%,其中17個是由于瓜子金單堿基突變造成的,另2個是由于山西靈丘的遠志樣品單堿基缺少造成的,無信息位點,Genbank下載的2個遠志序列與卵葉遠志序列無差異;ITS2序列有7個變異位點,占總位點數(shù)的3.02%,其中6個為瓜子金的單堿基變異造成的,信息位點僅1個,山西靈丘遠志有1個單堿基缺失,卵葉遠志序列和Genbank下載的2個遠志序列完全一致。

    利用MEGA 3.1的Kimura 2-parameter計算3種藥用植物之間的遺傳距離。結(jié)果表明,瓜子金與其他2個種的距離最遠,均為0.038;其次為山西靈丘遠志樣品;遠志來自Genbank的2個樣品與卵葉遠志之間的遺傳距離最小,為0.000,關(guān)系最近(表3)。

    表3 遠志屬3種藥用植物的遺傳距離

    基于ITS序列,采用NJ法構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1),經(jīng)1000次自舉檢測,結(jié)果表明,遠志的3個樣品分為2支,Genbank的2個樣品與卵葉遠志聚為1支,山西靈丘遠志樣品單獨為1支,瓜子金單獨為1支。

    圖1 基于ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

    3 討論

    山西靈丘遠志樣品和另外2個來自Genbank的樣品存在遺傳差異性,說明遠志存在種下變異。已有的ISSR研究發(fā)現(xiàn),遠志不同居群之間存在遺傳差異性,這在一定程度上佐證了我們的結(jié)論[7,11]。

    ITS序列分析技術(shù)具有技術(shù)簡單、結(jié)果準確、重復(fù)性好等優(yōu)點,近年來廣泛應(yīng)用于藥用植物鑒定,是藥學(xué)研究中的一種重要分子標記[12]。其中ITS2被認為比ITS1具有更多的信息位點,具有更高的鑒定效率[13]。我們的研究支持這一觀點,ITS1含有19個變異位點,占總位點數(shù)的6.76%,但無信息位點;ITS2序列存在7個變異位點,占總位點數(shù)的3.02%,有1個信息位點。

    卵葉遠志和遠志同為藥材遠志的基源植物[5],兩者在形態(tài)上十分相似,藥材也較難區(qū)別[6]。通過比較它們的ITS序列,發(fā)現(xiàn)卵葉遠志和2個Genbank下載的遠志序列無差異,但與山西靈丘遠志存在差異,這與形態(tài)特征是一致的。

    [1]中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會.中國植物志拉丁名索引[M].北京:科學(xué)出版社,1997:132.

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    [3]李文魁,林新,彭勇.中國遠志屬藥用植物資源及傳統(tǒng)療效[J].時珍國藥研究,1997,8(6):481-482.

    [4]楊學(xué)東,張麗杰,梁波.遠志科植物中寡糖酯類成分[J].中草藥,2002,33(10):954-958.

    [5]中華人民共和國藥典編委會.中華人民共和國藥典[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:146.

    [6]滕紅梅,房敏峰,胡正海.2種遠志根結(jié)構(gòu)及其皂苷含量的比較研究[J].西北植物學(xué)報,2008,28(12):2359-2367.

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    [9]Doyle J J,Doyle J L.A repid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue[J].Photochem Bull,1987(19):11-15.

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    [11]Fang M F,Li J,Zhou T H,et al.Genetic diversity in natural populations of the medicinal herb Polygala tenuifolia Willd and its implications for conservation[J].Biochemical Systematics and Ecology,2012(44):400-406.

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