抱莖獐牙菜指紋圖譜及4種有效成分含量測定研究

張 楠，許苗苗，杜赟赟，劉鳳鳳，陳洪衛(wèi)，謝志民*

（1.西安市食品藥品檢驗(yàn)所，陜西 西安 710054；2.西安遠(yuǎn)大德天藥業(yè)股份有限公司，陜西 西安 710119）

抱莖獐牙菜Swertia franchetianaH. smith是龍膽科獐牙菜屬一年生草本植物，為傳統(tǒng)藏藥藏茵陳基原植物之一，分布于甘肅、青海、四川等地。其性涼、味苦，具疏肝利膽功效[1]，臨床用于治療肝膽類疾病效果顯著[2]?，F(xiàn)代研究表明，其所含有效成分主要為環(huán)烯醚萜類、黃酮類、酮類、三萜類化合物[3-4]。抱莖獐牙菜目前被收錄到青海省地方標(biāo)準(zhǔn)中，質(zhì)控參數(shù)主要為齊墩果酸的薄層色譜鑒別和獐牙菜苦苷的含量測定，文獻(xiàn)研究也大多以單獨(dú)或幾個成分的含量測定作為質(zhì)控方法[5-6]，此種采用對照品進(jìn)行薄層鑒別和針對個別化合物的含量測定方法專屬性差，難以有效控制其質(zhì)量。中藥指紋圖譜作為評價天然藥物或中藥最有效方法之一[7]，從化學(xué)成分的角度整體反映藥材的特性，專屬性強(qiáng)，方法快速簡便?；诖?，本研究以抱莖獐牙菜為研究對象，建立了HPLC指紋圖譜和4種有效成分的含量測定方法，兩者結(jié)合為抱莖獐牙菜的鑒別、質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

1 儀器與材料

Agilent 1260型高效液相色譜儀（美國安捷倫科技公司）；BT124S型電子天平（賽多利斯公司）。獐牙菜苦苷（批號：1017116-11180003，純度：8.3%）、芒果苷（批號：110753-201817，純度：98.4%）、龍膽苦苷（批號：110770-201918，純度：99.1%）、當(dāng)藥醇苷（批號：111897-201001，純度＞98%）、齊墩果酸（批號：110709-201808，純度：91.1%）、當(dāng)藥苷（批號：110749-201718，純度：100%）均購于中國食品藥品檢定研究院；異葒草苷（批號：111897-201001，純度＞98%）、異牡荊苷（批號：111897-201001，純度＞98%）購于北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司；當(dāng)藥黃素（批號：190803-084，純度＞98%）購于北京盛世康普化工技術(shù)研究院；甲基當(dāng)藥寧（批號：Z26S10S98826，純度＞98%）購于上海源葉生物科技有限公司。乙腈為色譜純，水為超純水，其它試劑為分析純。10批樣品為課題組于青海、四川等地自采或購于藥材市場，經(jīng)西安市食品藥品檢驗(yàn)所謝志民主任藥師鑒定為龍膽科獐牙菜屬抱莖獐牙菜Swertia franchetianaH. smith 的干燥全草，新鮮樣品除去泥土等雜質(zhì)，晾干，樣品詳細(xì)情況見表1。

表1 樣品來源Tab. 1 Sample sources

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Welch Ultimate XB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相A為乙腈，B為0.1%的磷酸水溶液，梯 度 洗 脫：0 ～ 30 min，8%A；30 ～ 60 min，8% →17%A； 60 ～ 70 min，17% → 25%A；70 ～ 115 min，25% → 55%A；115 ～ 135 min，55% → 85%A；體積流量：1.0 mL/min，柱溫：30 °C，檢測波長：0 ～ 115 min為240 nm，115 ～ 135 min為205 nm。

2.2 樣品與對照品溶液的制備

2.2.1 樣品溶液的制備 精密稱取樣品中粉約0.20 g，置具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率：270 W，頻率：45 kHz）30 min，放冷，用80%甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取獐牙菜苦苷、芒果苷、龍膽苦苷、當(dāng)藥苷、異葒草苷、異牡荊苷、當(dāng)藥黃素、當(dāng)藥醇苷、甲基當(dāng)藥寧、齊墩果酸對照品適量，加甲醇制成濃度依次為1 604.0 μg/mL、97.0 μg/mL、81.4 μg/mL、201.6 μg/mL、 40.0 μg/mL、39.9 μg/mL、58.1 μg/mL、68.5 μg/mL、43.8 μg/mL、57.6 μg/mL的溶液，備用。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取S1樣品，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。結(jié)果各共有峰相對保留時間及相對峰面積RSD分別小于1.37%和1.85%。6針樣品相似度分析結(jié)果為0.970，表明儀器精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取S1樣品，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，于0、2.5、5、8、12、16、20、24 h，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜圖。各共有峰的相對保留時間和相對峰面積RSD均小于2.0%。相似度結(jié)果為0.980，表明供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取S1樣品6份，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜圖。各共有峰的相對保留時間RSD 均小于1.68%，相對峰面積RSD均小于2.5%，相似度結(jié)果為0.985，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4 指紋圖譜的建立及相似度評價

2.4.1 指紋圖譜的建立 取10 批樣品，按 “2.2.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，得到10批樣品的色譜圖，再取“2.2.2”項下的對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)行測定，得到混合對照品色譜圖，結(jié)果見圖1。將10批供試品溶液色譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012）”軟件進(jìn)行分析，以S1樣品圖譜為參照圖譜，對色譜峰進(jìn)行多點(diǎn)校正后，自動匹配，生成對照指紋圖譜，計算10批樣品和對照指紋圖譜之間的相似度，共標(biāo)定16個共有峰，見圖2。

圖1 混合對照品(A)和抱莖獐牙菜供試品(B)色譜圖Fig. 1 HPLC of mixed reference substance(A) and Swertia franchetiana sample(B)

圖2 10批抱莖獐牙菜藥材疊加指紋圖譜Fig. 2 HPLC standard chromatographic fingerprint for 10 batches of Swertia franchetiana sample

2.4.2 峰的確認(rèn) 16個共有峰經(jīng)與對照品保留時間和紫外光譜對比，確認(rèn)了1、2、3、4、5、6、7、10、11、16號峰分別為獐牙菜苦苷、芒果苷、龍膽苦苷、當(dāng)藥苷、異葒草苷、異牡荊苷、當(dāng)藥黃素、當(dāng)藥醇苷、甲基當(dāng)藥寧、齊墩果酸，以5號峰為參照峰（S）。

2.4.3 數(shù)據(jù)分析 以參照峰的保留時間和峰面積作為1，計算共有色譜峰的相對保留時間見表2，相對峰面積見表3，相似度計算結(jié)果分別為0.987、0.984、0.980、0.939、0.880、0.912、0.876、0.990、0.978、0.864。

表2 共有峰相對保留時間Tab. 2 Relative retention time of common peaks

表3 共有峰相對峰面積Tab. 3 Relative peak area of common peaks

2.5 化學(xué)計量分析

2.5.1 聚類分析 以10批樣品中16個共有峰的峰面積為變量，用SPSS 22.0軟件進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖3。當(dāng)分離距離為10時，10批樣可聚為2類，S1、S2、S8、S9號聚為第一類，其余為第二類。

圖3 聚類分析圖Fig. 3 Cluster analysis diagram

2.5.2 主成分分析 以10批樣品中16個共有峰峰面積作為變量，采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行主成分分析，提取到4個主成分，累積方差貢獻(xiàn)率為94.426%，見表4。載荷矩陣結(jié)果顯示色譜峰4、13對主成分1的貢獻(xiàn)最大；色譜峰1對主成分2的貢獻(xiàn)最大；色譜峰

表4 主成分分析特征值和方差貢獻(xiàn)率Tab. 4 Principal component analysis eigenvalue and variance contribution rate

8、10對主成分3的貢獻(xiàn)最大；色譜峰2對主成分4的貢獻(xiàn)最大。將10批樣品中16個共有峰峰面積導(dǎo)入SIMCA 14.1軟件繪制主成分分析圖分析組間差異，結(jié)果與聚類分析結(jié)果一致，見圖4。

圖4 PCA得分圖Fig. 4 PCA score chart

2.6 4種有效成分的含量測定

2.6.1 色譜條件 同“2.1”項前30 min色譜條件。

2.6.2 線性關(guān)系考察 取“2.2”項下的混合對照品溶液為線性關(guān)系考察混合對照品溶液⑦ ，再將該溶液用甲醇稀釋至60%、40%、20%、10%、5%、1%濃度依次得到線性關(guān)系考察⑥、⑤、④、③、②、①號對照品溶液。按“2.1”項下條件測定，以進(jìn)樣量作為橫坐標(biāo)（X），測得的峰面積作為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表5。

表5 4 種有效成分的線性關(guān)系考察結(jié)果Tab. 5 Results of linear relationship among 4 active components

2.6.3 精密度試驗(yàn) 取“2.2”項下混合對照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，獐牙菜苦苷、芒果苷、龍膽苦苷、當(dāng)藥苷4種有效成分峰面積的RSD分別為0.25%、0.38%、0.29%、0.15%，表明儀器精密度良好。

2.6.4 重復(fù)性試驗(yàn) 同“2.3.3”項下方法，4種有效成分峰面積的RSD分別為0.82%、0.36%、0.92%、1.05%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.6.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 同“2.3.2”項下方法，4種有效成分24 h峰面積的RSD分別為0.48%、0.82%、0.49%、0.56%，表明該方法在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6.6 加樣回收率試驗(yàn) 取已測定各成分含量的樣品（S1）粉末6份，每份0.1 g，按已知含量的100%分別精密加入各成分濃度為獐牙菜苦苷4.241 mg/mL、芒果苷0.154 mg/mL、龍膽苦苷0.157 mg/mL、當(dāng)藥苷0.484 mg/mL的混合對照品溶液2 mL，待溶劑揮發(fā)后按照“2.3”項下方法制成供試品溶液，依法進(jìn)樣測定各成分含量，結(jié)果所測4個成分的平均加樣回收率（RSD值）分別為99.56% （0.58%）、100.37%（1.23%）、98.63%（0.59%）、99.11%（1.02%），表明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.6.7 樣品含量測定 取10批次樣品，按照“2.3”項下方法制備供試品溶液，依法測定，結(jié)果見表6。

表6 10批抱莖獐牙菜中4種成分測定結(jié)果（n = 3）Tab. 6 Content results of 4 components in 10 batches of Swertia franchetiana（n = 3）

3 討論

10 批樣品指紋圖譜相似度在0.86以上，表明各樣品相似度較好，各色譜峰均達(dá)到基線分離，保留時間穩(wěn)定，16個共有峰通過與對照品對照指認(rèn)出了10個成分，包含了抱莖獐牙菜主要有效成分，所建立的指紋圖譜可以作為抱莖獐牙菜的鑒別指標(biāo)之一。

聚類分析結(jié)果顯示10批抱莖獐牙菜分為兩類，分別為青海境內(nèi)自采樣品和四川境內(nèi)及藥材市場采購的樣品，顯示了抱莖獐牙菜成分與地域分布及采收儲存時間具有明顯相關(guān)性。含量測定以獐牙菜苦苷、芒果苷、龍膽苦苷、當(dāng)藥苷作為指標(biāo)性成分。獐牙菜苦苷具有解痙鎮(zhèn)痛、清肝利膽、降血脂等多種作用，對多種實(shí)驗(yàn)性肝損傷具有保護(hù)作用[8]；龍膽苦苷是龍膽科植物中的主要活性成分，主要用于保肝、抗炎、抗病原微生物、健胃利膽等[9-10]；芒果苷藥理學(xué)活性豐富，主要有抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒、保肝等作用，另外體外實(shí)驗(yàn)表明其對HBV-DNA復(fù)制具有明顯抑制作用[11-12]；當(dāng)藥苷是一種存在于多種中藥中的環(huán)烯醚萜類化合物，研究表明具有抗纖維化、抗炎、抗腫瘤等作用[13]。鑒于這4種成分在保肝利膽抗炎等方面均有明顯的藥理作用，且通過主成分分析表明其對主成分的貢獻(xiàn)較大，以這4種成分作為抱莖獐牙菜的質(zhì)量控制指標(biāo)成分較為合理，所建立的含量測定方法色譜峰分離效果好，簡便、快速、準(zhǔn)確，可以作為抱莖獐牙菜質(zhì)量控制方法。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)建立了10批抱莖獐牙菜的HPLC指紋圖譜和4種有效成分含量測定方法，方法穩(wěn)定性、重復(fù)性好，結(jié)果準(zhǔn)確，可為抱莖獐牙菜的鑒別和質(zhì)量控制提供參考。后續(xù)研究應(yīng)以有效成分作為指標(biāo)對獐牙菜屬以及其它種屬如扁蕾屬、花錨屬的植物進(jìn)行考察和篩選，建立各種或?qū)俚臉?biāo)準(zhǔn)指紋圖譜和質(zhì)量控制方法，進(jìn)而為藏茵陳的持續(xù)開發(fā)提供依據(jù)。