郭麗麗,李小蘭,孫杰,楊曉瑩,王小敏,秦楠
山西中醫(yī)藥大學中藥與食品工程學院(晉中 030619)
苦蕎是一種營養(yǎng)價值很高的藥用及食用植物,廣泛種植于中國、日本、俄羅斯、歐洲等國家和地區(qū)。苦蕎中含有蛋白質(zhì)、脂肪、維生素、礦物質(zhì),以及極為豐富的生物活性成分——黃酮類化合物,具有明顯的降血糖、降血脂、降血壓、抗腫瘤、抗氧化、消除體內(nèi)自由基、增強免疫力及保護心腦血管等多種功效,被開發(fā)為膠囊、片劑、粉末、醋和茶等多種功能食品形式,備受消費者青睞。然而,苦蕎籽粒所具有的苦、澀、硬等感官特性,加之未加工苦蕎中存在的較多抗營養(yǎng)因子,在一定程度上限制了苦蕎原料的廣泛開發(fā)利用,因此,有必要對苦蕎資源的合理加工及應用途徑進行研究,在滿足民眾對食品多樣化與營養(yǎng)化消費需求的同時,增強對該資源利用的產(chǎn)業(yè)化和豐富化。
研究表明,苦蕎籽粒經(jīng)萌發(fā)處理后,不僅因質(zhì)地改變而提高其中蛋白質(zhì)和淀粉的生物利用度,降低或消除有毒、有害、抗營養(yǎng)物質(zhì)含量,更重要的是可提高γ-氨基丁酸、游離氨基酸等生物活性物質(zhì)的含量,尤其是蘆丁、槲皮素等黃酮類活性化合物含量顯著增加,抗氧化能力也明顯增強,這表明萌發(fā)是提升苦蕎食用品質(zhì)和營養(yǎng)價值的有效途徑。不同的發(fā)芽條件會造成發(fā)芽能力、生物代謝途徑、代謝物合成種類和數(shù)量等方面的差異,進而影響苦蕎芽的營養(yǎng)和功能特性,研究苦蕎籽的萌發(fā)工藝對于有效富集苦蕎資源中的生物活性成分,從而促進對其合理開發(fā)利用具有重要意義。試驗采用響應面法對苦蕎麥的萌發(fā)工藝進行系統(tǒng)研究,對萌發(fā)過程中蘆丁、槲皮素等黃酮類化合物的含量進行實時監(jiān)測,并比較萌發(fā)前后苦蕎麥的抗氧化活性,以期為促進苦蕎及其黃酮類物質(zhì)的深度開發(fā)利用、研制和開發(fā)新型苦蕎食品提供可靠的理論依據(jù)。
苦蕎籽粒(山西田澤雜糧種子有限公司);蘆丁標準品(批號195128)、L-抗壞血酸標準品(批號190120),均來自上海融禾醫(yī)藥科技公司;槲皮素標準品(批號C12110861,上海麥克林生化科技有限公司);2, 2-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS,批號AK112904,合肥博美生物科技有限責任公司);1, 1-二苯基-2-苦肼基(DPPH,批號CD29142801,北京酷來搏科技有限公司);乙腈、甲醇、磷酸(均為色譜級,天津市北辰方正試劑廠);超純水(娃哈哈飲用水有限公司);其余試劑如亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、無水乙醇、過硫酸鉀、硫酸銅、甲醇為分析純。
HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市杰瑞爾電器有限公司);U1tra-3600紫外可見分光光度計(北京普源精電科技股份有限公司);GZX-9030MBE電熱鼓風干燥箱(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠);SB25-120超聲波清洗機(寧波新芝生物科技股份有限公司);TD4Z-WS湘立離心機(湖南湘立科學儀器有限公司);AR223CN電子天平(常州奧豪斯儀器有限公司);RIGOL L-3000高效液相色譜儀(北京普源精電科技股份有限公司)。
1.3.1 苦蕎萌發(fā)及處理方法
苦蕎萌發(fā)及處理參考文獻[1]。將苦蕎種子進行去雜、篩選、清洗等預處理,去除原料中的未成熟、不飽滿粒,得到干凈均勻的苦蕎種子。將種子置于浸濕的紗布中,采用4層紗布墊底、2層紗布覆蓋的方式對種子進行萌發(fā)處理。萌發(fā)后的種子置于60 ℃電熱鼓風干燥箱干燥2 h,脫殼,磨成粉末待用。
1.3.2 發(fā)芽率測定
每組苦蕎麥種子樣品為100粒,每次萌發(fā)完成后統(tǒng)計發(fā)芽種子數(shù)量,按式(1)計算發(fā)芽率[2]。
1.3.3 總黃酮含量測定
準確稱取1.0 g苦蕎粉末,精確至0.001 g,置于100 mL三角瓶中,加入30 mL 70%甲醇溶液,在50 ℃下超聲浸提30 min后于3 000 r/min離心10 min,上清液用70%甲醇溶液定容至50 mL作為待測液。分別準確量取5.0 mL試樣待測液及0.0,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0和6.0 mL 0.2 mg/mL的蘆丁標準溶液置于25 mL容量瓶,加水至6 mL,加1 mL 5%亞硝酸鈉溶液,搖勻后放置6 min,加1 mL 10%硝酸鋁溶液,搖勻后放置6 min,加10 mL 4%氫氧化鈉溶液,加水至刻度,搖勻,靜置15 min,于508 nm測定標準液及待測液的吸光度[3]。以蘆丁標準溶液濃度為橫坐標,相應吸光度為縱坐標,制得標準曲線并得到線性回歸方程y=9.668 8x+0.017(R2=0.994 0),繼而將待測液吸光度代入方程求出樣品中的總黃酮濃度,按照式(2)得總黃酮含量(X,mg/g)。
式中:C為計算所得的測定液總黃酮濃度,mg/mL;V1為測定溶液總體積,25 mL;V2為待測液取樣體積,5 mL;V3為待測液總體積,50 mL;m為苦蕎粉末質(zhì)量,1.0 g。
1.3.4 苦蕎萌發(fā)工藝的單因素試驗
選取苦蕎種子若干組,每組100粒,分別在一定的浸泡時間(6,8,10,12和14 h)、萌發(fā)時間(48,53,58,63和68 h)和萌發(fā)溫度(15,20,25,30和35 ℃)下進行萌發(fā),分別測定發(fā)芽率和總黃酮含量,并計算綜合評分,其中各因素固定水平為浸泡時間8 h、萌發(fā)時間58 h、萌發(fā)溫度25 ℃。
采取加權法計算綜合評分,將發(fā)芽率和總黃酮含量兩者的權重均設為50。
1.3.5 苦蕎萌發(fā)工藝的響應面試驗
在單因素試驗基礎上,進一步研究浸泡時間(A)、萌發(fā)時間(B)和萌發(fā)溫度(C)3個因素之間的交互作用,以由發(fā)芽率和總黃酮含量組成的綜合評分為指標,采用Design-Expert軟件進行Box-Behnken三因素三水平響應面試驗(共17組),從而確定最優(yōu)的苦蕎萌發(fā)工藝。響應面因素水平編碼表如表1所示。
表1 響應面試驗因素與水平
1.3.6 苦蕎萌發(fā)過程中蘆丁和槲皮素的動態(tài)變化
按最佳萌發(fā)工藝進行苦蕎萌發(fā),并分別精密稱取1.500 g萌發(fā)0,6,12,18,24,30,36,42,48,54和59 h并經(jīng)研磨過0.180 mm孔徑(80目)篩的苦蕎粉末,用40 mL 70%甲醇溶液超聲提取30 min后抽濾,提取液用70%甲醇溶液定容至50 mL,得樣品溶液。進行HPLC分析,記錄蘆丁和槲皮素的峰面積,采用外標法進行含量測定,繪制苦蕎中蘆丁和槲皮素隨萌發(fā)過程的動態(tài)變化曲線。其中:蘆丁含量測定所用的標準曲線為y=25.662x-195.04,R2為0.999 7,線性范圍為10~100 μg/mL;槲皮素含量測定所用的標準曲線為y=34.544x-108.37,R2為0.999 6,線性范圍為10~50 μg/mL。
HPLC色譜條件[4]:Agilent ZORBAX EXTEND-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),進樣量10 μL,洗脫流速0.7 mL/min,柱溫35 ℃,DAD檢測器,檢測波長256 nm,流動相為乙腈(A)-0.2%磷酸水溶液(B)。洗脫程序:0~8 min,15%~22% A;8~20 min,22% A;20~30 min,22%~30% A;30~32 min,30%~15% A。
1.3.7 萌發(fā)前后苦蕎的抗氧化活性比較
用70%甲醇溶液提取發(fā)芽前后苦蕎麥中的總黃酮(50 ℃下超聲浸提30 min),將提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干得總黃酮提取物,進行體外抗氧化活性測定。
DPPH·清除能力的測定參照文獻[5]。分別取1 mL陽性對照VC和總黃酮提取物的系列稀釋溶液(0.2,0.4,0.6,0.8和1.0 mg/mL)置于試管中,分別加入2 mL 0.1 mmol/L DPPH·自由基溶液,振蕩均勻后避光靜置20 min,在517 nm波長處測吸光度(A1)。以2 mL無水乙醇代替 DPPH溶液,同上測得各管吸光度(A2);以1 mL無水乙醇代替樣品液為空白組,同上測得各管吸光度(A0)。DPPH·清除率按式(4)計算。
ABTS+·清除能力的測定參照文獻[6]。取7.4 mmol/L ABTS二胺鹽和2.6 mmol/L過硫酸鉀各1 mL,混合后暗處反應12 h,用無水乙醇稀釋40倍,得在734 nm處吸光度為 0.70的ABTS+·工作液。分別取1 mL陽性對照VC和總黃酮提取物的系列稀釋溶液(0.2,0.4,0.6,0.8和1.0 mg/mL)置于試管中,分別加入2 mL ABTS+·工作液,振蕩均勻后避光靜置30 min,在734 nm波長處測吸光度(A1)。以2 mL無水乙醇代替ABTS+·溶液,同上測得各管吸光度(A2);以1 mL無水乙醇代替樣品液為空白組,同上測得各管吸光度(A0)。ABTS+·清除率計算同式(4)。
采用Origin 9.0軟件繪圖,試驗結(jié)果為3次平行的平均值。
2.1.1 浸泡時間對苦蕎種子萌發(fā)的影響
隨著浸泡時間的延長,苦蕎籽發(fā)芽率整體呈升高趨勢(圖1A),這是因為通過浸種處理可活化相關酶類,從而使苦蕎種子解除休眠,促進后續(xù)萌發(fā)[7]。浸泡時間12 h時,發(fā)芽率達到85.67%,繼續(xù)延長浸泡時間,發(fā)芽率增長不顯著。與此同時,總黃酮含量也隨浸種時間的延長而逐漸上升,這可能與不斷升高的萌發(fā)程度有關系。隨著浸種時間的延長,發(fā)芽率不斷升高,萌發(fā)程度不斷增強,使得總黃酮含量不斷增大[8]??傸S酮含量在浸種12 h時為11.18 mg/g,浸種時間繼續(xù)延長2 h,總黃酮含量增加0.26 mg/g,故從萌發(fā)效率兼顧生產(chǎn)的角度考慮,選擇浸泡時間12 h為響應面設計的0水平,此時綜合評分也較高(96.85分,圖1B)。
圖1 浸泡時間對苦蕎發(fā)芽率和總黃酮含量(A)及綜合評分(B)的影響
2.1.2 萌發(fā)時間對苦蕎種子萌發(fā)的影響
由圖2(A)可知,隨著萌發(fā)時間的延長,發(fā)芽率不斷升高,而總黃酮含量先增長后降低,萌發(fā)時間58 h時,總黃酮含量達到最高,說明適當延長萌發(fā)時間可在一定程度上提高總黃酮含量,但過長的萌發(fā)時間可能會過多消耗苦蕎種子中的營養(yǎng)物質(zhì)[9],從而使得總黃酮含量降低,與Zhou等[10]的研究結(jié)果相一致。結(jié)合綜合評分(圖2B),選取58 h為響應面設計中萌發(fā)時間因素的0水平,此時綜合評分為95.81分。
圖2 萌發(fā)時間對苦蕎發(fā)芽率和總黃酮含量(A)及綜合評分(B)的影響
2.1.3 萌發(fā)溫度對苦蕎種子萌發(fā)的影響
在合理的萌發(fā)溫度下,適度升高溫度可以促進植物萌發(fā)。但溫度過高會導致苦蕎籽粒中的酶類物質(zhì)失去催化活力,從而抑制萌發(fā)。由圖3(A)可知,萌發(fā)溫度25 ℃時,發(fā)芽率和總黃酮含量均達到最大,這表明隨著萌發(fā)的進行,總黃酮含量不斷升高,當萌發(fā)受到抑制時,總黃酮的生物合成也隨之受到影響。彭濤等[11]以營養(yǎng)成分蘆丁和煙酸含量變化為指標,發(fā)現(xiàn)苦蕎萌發(fā)的最佳溫度為25 ℃,與試驗結(jié)果一致。蔡利等[12]以種子萌發(fā)率和總黃酮含量為指標研究了苦蕎種子萌發(fā)條件,結(jié)果也表明25 ℃為最佳溫度。然而,朱云輝等[13]采用苦蕎發(fā)芽富集γ-氨基丁酸,通過優(yōu)化條件,發(fā)現(xiàn)苦蕎發(fā)芽最佳溫度為32 ℃。這說明不同萌發(fā)條件會影響苦蕎中營養(yǎng)活性成分的合成累積,在接近室溫的溫度下萌發(fā)利于黃酮類化合物的合成轉(zhuǎn)化,而略高于室溫的溫度更利于氨基酸類化合物的富集形成。綜上,選取萌發(fā)溫度25 ℃為響應面設計的0水平,此時綜合評分為95.87分(圖3B)。
圖3 萌發(fā)溫度對苦蕎發(fā)芽率和總黃酮含量(A)及綜合評分(B)的影響
2.2.1 響應面試驗設計及結(jié)果
17組響應面試驗結(jié)果如表2所示。
表2 響應面試驗設計及試驗結(jié)果
2.2.2 模型建立及顯著性分析
運用Design-Expert 8.0.6軟件對試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合,得到二次多項回歸方程Y=97.47+2.86A+3.07B-3.67C-0.35AB-5.33AC-5.27BC-21.00A2-12.26B2-7.67C2。對回歸方程進行方差分析,結(jié)果如表3所示。模型達到極顯著水平(P<0.01),失擬項不顯著(P>0.05),模型R2和Radj2分別為0.991 1和0.979 7,說明該模型具有較高的顯著性,與真實數(shù)據(jù)擬合程度好。由F值可以看出,各因素對綜合評分的影響程度為萌發(fā)溫度>萌發(fā)時間>浸泡時間,且3個因素的一次項及二次項對綜合評分的線性效應均極顯著。交互項中浸泡時間和萌發(fā)溫度相互作用、萌發(fā)時間和萌發(fā)溫度相互作用對綜合評分影響極顯著。
表3 響應面模型方差分析
2.2.3 響應面的交互作用分析
采用Design-Expert 8.0.6軟件對試驗結(jié)果進行二次響應面回歸分析,結(jié)果如圖4所示。
由圖4(A)可知,綜合評分隨著浸泡時間和萌發(fā)時間的延長而提高;到達一定范圍,綜合評分不再增加,即曲面圖的頂點處。繼續(xù)延長浸泡和萌發(fā)時間,綜合評分開始下降。相應的等高線接近圓形,表明這2個因素無顯著交互作用,與表3方差分析結(jié)果相一致。類似地,圖4(B)和4(C)分別反映綜合評分隨浸泡時間和萌發(fā)溫度及萌發(fā)時間和萌發(fā)溫度的變化,大致呈先上升后下降趨勢。就等高線而言,浸泡時間和萌發(fā)溫度相互作用及萌發(fā)時間和萌發(fā)溫度相互作用的等高線均呈橢圓形,表明圖4(B)和4(C)中的兩因素交互作用較顯著,與方差分析結(jié)果一致。
圖4 兩因素相互作用對綜合評分影響的響應面圖
2.2.4 驗證試驗
根據(jù)Design-Expert 8.0.6軟件運行結(jié)果,以綜合得分最大值為指標,得到苦蕎萌發(fā)的最優(yōu)條件:浸泡時間12.18 h、萌發(fā)時間58.69 h、萌發(fā)溫度23.81 ℃,在此條件下模型預測的綜合評分為98.47分,發(fā)芽率為88.94%,總黃酮含量為11.93 mg/g??紤]到實際操作,將最優(yōu)條件調(diào)整為浸泡時間12 h、萌發(fā)時間59 h、萌發(fā)溫度24 ℃,對苦蕎麥進行3次平行萌發(fā),并按前述進行分析檢測,在該條件下發(fā)芽率為89.00%±1.00%,總黃酮含量為11.97±0.06 mg/g,驗證試驗綜合評分98.67±0.79分,接近模型預測值,說明所設計優(yōu)化的萌發(fā)工藝較合理。經(jīng)萌發(fā)后,苦蕎中總黃酮含量較萌發(fā)前(5.56±0.20 mg/g)提高115.3%。
由圖5可以看出,隨著苦蕎的萌發(fā),蘆丁和槲皮素含量均呈上升趨勢,但蘆丁含量的增加總體明顯于槲皮素,這與石磊等[14]的研究結(jié)果類似,也與胡俊君等[15]所觀察到的苦蕎全粉中蘆丁、槲皮素等活性成分含量隨苦蕎發(fā)芽期(0~4 d)的變化趨勢相一致。Kim等[16]研究表明,隨著萌發(fā)的進行,品種Hokkai T 8苦蕎籽粒中的蘆丁含量逐漸下降,而品種Hokkai T 10籽粒中的蘆丁含量不斷上升,這表明苦蕎萌發(fā)期間活性成分的動態(tài)變化規(guī)律與苦蕎品種有關。試驗中,蘆丁含量在萌發(fā)24 h后增長明顯,而槲皮素含量的增加主要發(fā)生在萌發(fā)初期6~12 h內(nèi)。萌發(fā)至59 h時,蘆丁和槲皮素含量分別達到5.61和2.20 mg/g,蘆丁含量較未萌發(fā)時的2.04 mg/g提高1.75倍,這表明萌發(fā)后的苦蕎具有更高的營養(yǎng)價值,更適用于苦蕎相關功能食品的開發(fā)。
圖5 混合標準品的高效液相色譜圖(A)及苦蕎萌發(fā)過程中蘆丁、槲皮素的含量變化(B)
通過測定比較萌發(fā)前后苦蕎對DPPH·和ABTS+·自由基的體外清除能力,結(jié)果表明萌發(fā)后苦蕎的抗氧化活性有所增強,且抗氧化活性與濃度呈正比(圖6),與周小理等[17]、王靜波等[18]研究結(jié)果相一致。1 mg/mL的苦蕎麥芽對DPPH·和ABTS+·自由基的清除率分別為95.83%和97.64%,是同濃度下陽性對照VC清除能力的96.91%和98.63%,較同濃度下未萌發(fā)苦蕎的92.04%和92.24%分別提高4.11%和5.53%。有研究表明,苦蕎芽中的VC、總黃酮以及蘆丁含量與其自由基清除能力呈顯著正相關[19]。Ryu等[20]通過相關分析進一步證實蘆丁是苦蕎茶中最主要的抗氧化物質(zhì)。試驗中,苦蕎經(jīng)萌發(fā)后蘆丁和總黃酮含量均大幅提高,這在一定程度上解釋了苦蕎麥芽抗氧化活性有所增強的現(xiàn)象。
圖6 萌發(fā)前后苦蕎對DPPH·自由基(A)和ABTS+·自由基(B)的清除能力
試驗采用單因素結(jié)合響應面法優(yōu)化苦蕎萌發(fā)工藝,結(jié)果表明,將苦蕎籽粒室溫浸泡12 h后在24 ℃下萌發(fā)59 h,發(fā)芽率和總黃酮含量均較高,分別為89.00%和11.97 mg/g。采用HPLC法動態(tài)監(jiān)測苦蕎萌發(fā)過程中黃酮類成分蘆丁和槲皮素的含量變化,結(jié)果表明蘆丁和槲皮素含量均隨萌發(fā)過程的進行而增加,但蘆丁含量的增加主要發(fā)生于萌發(fā)24 h后,而槲皮素含量的增加主要發(fā)生于6~12 h的萌發(fā)初期,且槲皮素含量的整體增長幅度小于蘆丁含量。體外抗氧化活性分析表明,萌發(fā)后苦蕎的抗氧化活性較萌發(fā)前有所增強,說明萌發(fā)有利于富集蘆丁、槲皮素等黃酮類物質(zhì),從而提高苦蕎抗氧化活性。由此可見,苦蕎麥芽是一種可用于抗氧化功能食品開發(fā)的優(yōu)良資源,可用于開發(fā)苦蕎芽茶、苦蕎芽飲料、苦蕎芽餅干、苦蕎芽酸奶等功能食品。