固定化脂肪酶的條件優(yōu)化及對豬肉風(fēng)味的影響

陳瑞琦，韓金承，吳慎威，趙麗瑩，代媛媛，孟鑫

錦州醫(yī)科大學(xué)食品與健康學(xué)院（錦州 121000）

近年來，風(fēng)味酶被廣泛應(yīng)用于乳制品、肉制品和葡萄酒中，受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。如林偉鋒等[1]研究發(fā)現(xiàn)脂肪酶抑制乳酸菌增殖和產(chǎn)酸，但明顯促進(jìn)羧酸類生成，并產(chǎn)生酯類，可明顯改變風(fēng)味，賦予體系豐富的風(fēng)味。前期從豬肉中提取內(nèi)源性脂肪酶，對雞肉、豬肉等肉品風(fēng)味有明顯的改善作用，并在大腸桿菌、釀酒酵母中分別表達(dá)脂肪酶基因，發(fā)現(xiàn)重組酶對典型肉類及奶制品的風(fēng)味有一定影響[2-5]。

然而，在生產(chǎn)加工過程中，由于受到環(huán)境條件的制約，脂肪酶容易失活，且難以重復(fù)使用，造成資源浪費(fèi)，限制了大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用。為此，選擇適宜的固定化方法對脂肪酶進(jìn)行改造，生產(chǎn)固定化脂肪酶，是解決該問題的有效途徑。固定化酶多采用吸附法、共價交聯(lián)法、包埋法等方法，但固定化材料多為化學(xué)試劑，不利于脂肪酶在風(fēng)味食品、油脂加工生產(chǎn)中應(yīng)用[6]。核桃殼是環(huán)保型的天然生物材料，來源豐富、無毒無污染，可通過吸附進(jìn)行酶的固定化，把脂肪酶吸附到活性炭孔隙上，產(chǎn)物的使用安全性比較容易有保證[7]。與游離脂肪酶相比，固定化脂肪酶在保持其高效專一及溫和的酶催化反應(yīng)特異性的同時又克服了游離酶的不足之處，呈現(xiàn)貯存穩(wěn)定性高、分離易回收、可多次重復(fù)使用、操作連續(xù)可控、工藝簡便等一系列優(yōu)點(diǎn)[8]。

為此，試驗(yàn)以改性核桃殼作為固定化豬肉內(nèi)源性脂肪酶的載體，通過載體表面和酶分子表面間的吸附而達(dá)到固定目的，結(jié)合單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)優(yōu)化固定化脂肪酶制備工藝，并以豬肉為例，采用 HSSPME-GC-MS考察經(jīng)豬肉內(nèi)源性脂肪酶固定化前后豬肉風(fēng)味的變化，以期為肉制品深加工提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豬肉、生核桃殼（購買于錦州大潤發(fā)）；其他試劑（均為市售分析純）。

RE-2000A馬弗爐（沈陽市長虹工業(yè)電器廠）；固相微萃?。ǖ聡_(dá)姆施塔特默克集團(tuán)）；GL570氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（武漢國量儀器有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 豬肉內(nèi)源性脂肪酶的提取

采用雙水相法從豬肉（肥肉）中提取脂肪酶酶液，參考楊爽等[4]提取方法并做簡單修改。萃取條件：PEG2000濃度32%，(NH4)2SO4濃度32%，pH 6.5。

1.2.2 改性核桃殼固定化豬肉內(nèi)源性脂肪酶

1.2.2.1 載體工藝制備

參考韓本勇等[9]的方法稍加修改。將核桃殼經(jīng)高溫烘干、粉碎，取10 g核桃殼烘干粉末加50 mL磷酸溶液，在60 ℃水浴鍋中進(jìn)行加熱將其浸漬15 min，過濾將其放置加熱到高溫送入馬弗爐，在300 ℃高溫條件下炭化90 min，在600 ℃高溫條件下活化90 min，活化工作完成后，用0.1%鹽酸清洗并用蒸餾水將其洗滌至中性，放置于高溫烘干箱烘干，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.2 載體的表面氧化

取5 g載體，加入50 mL 20%硝酸溶液，在80 ℃水浴鍋中進(jìn)行浸泡3 h。過濾后，加入去離子水煮沸，過濾，干燥4次。

1.2.2.3 載體的表面硅烷化

取1 g氧化后的載體于100 mL無水乙醇中，超聲分散1 h后，加入一定量的0.01 mol/L鹽酸，調(diào)節(jié)至pH 4.0，加入3%的KH-570溶液，于60 ℃水浴反應(yīng)24 h，過濾，濾餅分別用無水乙醇和蒸餾水洗滌，除去未反應(yīng)的KH-570，烘干。

1.2.2.4 固定化酶的制備

取1.0 g改性的載體于三角瓶中，加入5 mL瓶中含有50 mg/mL脂肪酶酶液，在搖床上持續(xù)振蕩一定時間，使這些載體能夠迅速吸附固定脂肪酶。經(jīng)抽濾、去離子水洗滌、冷凍干燥得到固定化脂肪酶。

1.2.3 固定化脂肪酶酶活性測定方法

試驗(yàn)采用一種經(jīng)過不斷改進(jìn)的銅皂法對酶進(jìn)行活性測定，在2支試管中依次繼續(xù)加入2 mL橄欖油乳化液和2.5 mL 0.05 mol/L磷酸緩沖液（pH 7.5），在40 ℃水浴中加熱5 min后，加入0.5 mL脂肪酶液，充分均勻振蕩混勻后，水浴中振蕩15 min，立即加入1 mL 6 mol/L鹽酸溶液，6 mL 95%乙醇溶液，混合后繼續(xù)加入3 mL異辛烷，并完全均勻振蕩90 s。于60 ℃靜止放置10 min，待冷卻后，取上層1 mL異辛烷，將其放入1支新試管中，依次分別加入4 mL異辛烷和1 mL銅鹽顯色劑，混勻后濾液進(jìn)行低溫靜置，取上清液，用紫外可見分光光度計在714 nm波長下進(jìn)行測定其中的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到脂肪酶酶活力[10]。酶活力單位（U）：1 μmol脂肪酸在1 min內(nèi)由酶轉(zhuǎn)化而形成的活力的量稱為1個脂肪酶活力單位。

1.2.4 單因素試驗(yàn)

以載體量（0.50，0.75，1.00，1.25和1.50 g）、pH（6.0，7.0和8.0）、固定化溫度（35，40，45，50和55 ℃）和固定化時間（1，2，3，4和5 h）為單因素，相對酶活為考察指標(biāo)，考察4個因素對固定化酶活性的影響。每個樣品重復(fù)試驗(yàn)3次。

1.2.5 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取載體量、pH濃度、固定化溫度和固定化時間作為考察因素，以相對酶活為響應(yīng)值，采用四因素三水平進(jìn)行響應(yīng)面分析優(yōu)化，每個樣品重復(fù)試驗(yàn)3次，具體試驗(yàn)設(shè)計見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平設(shè)計

1.2.6 風(fēng)味檢測

1.2.6.1 原料肉的處理

在常溫，pH 6.5條件下，稱取10 mL蒸餾水與25 g豬肉樣品充分混勻浸泡30 min（樣品A）；分別取10 mL游離酶酶液和固定化酶酶液與25 g豬肉樣品充分混勻浸泡30 min（樣品B和樣品C）。每組分別置于300 mL沸水中單獨(dú)煮制2 min備用[11]。

1.2.6.2 HS-SPME-GC-MS分析

固相微萃?。?組樣品分別取4 g切碎，煮熟后迅速放入20 mL頂空瓶中，快速加蓋進(jìn)行GC-MS檢測，每組樣品平行試驗(yàn)2次。加入4 mL飽和氯化鈉溶液及磁轉(zhuǎn)子，用聚四氟乙烯隔墊密封，在磁攪拌器中45 ℃加熱10 min。用活化的萃取頭（270 ℃活化60 min）頂空吸附35 min后，然后將萃取頭插入進(jìn)樣口解吸5 min。每個樣品重復(fù)試驗(yàn)3次[11]，樣品分別標(biāo)記為樣品A，B和C。

氣相色譜條件：HP-5MS毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度250 ℃，不分流模式進(jìn)樣；載氣He，流速1.0 mL/min；程序升溫，柱初溫40℃，保持3 min，以3 ℃/min升至100 ℃，以5 ℃/min升至230 ℃，保持5 min[11]。

質(zhì)譜條件：色譜-質(zhì)譜接口溫度280 ℃，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃；離子化方式EI；電子能量70 eV；質(zhì)量掃描范圍m/z30～550[11]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有結(jié)果均為3次重復(fù)的平均值，使用Microsoft Office 2013軟件繪制圖。響應(yīng)面數(shù)據(jù)采用Design-Expert 8.0.5軟件進(jìn)行分析。GC-MS數(shù)據(jù)采用揮發(fā)性成分通過譜庫檢索進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 載體量對固定化效果的影響

在pH 7.0、固定化溫度40 ℃、固定化時間2 h條件下，載體量范圍設(shè)置為0.5～1.5 g，考察不同載體量對固定化脂肪酶酶活的影響。結(jié)果如圖1（A）所示，隨著載體量增加，固定化酶相對酶活呈現(xiàn)先上升后下降趨勢。研究表明，改性核桃殼粉末通過吸附法能把脂肪酶固定化，載體量過高或過低均會對固定化效果產(chǎn)生影響。載體量0.75 g時酶活最佳。

圖1 各因素對固定化脂肪酶的影響

2.1.2 pH對固定化效果的影響

在載體量0.75 g、固定化溫度40 ℃、固定化時間2 h條件下，pH范圍設(shè)置為6.0～8.0，考察不同pH對固定化酶酶活的影響。結(jié)果如圖1（B）所示，pH 7.0時，固定化脂肪酶的相對酶活力最高。研究表明，酶促反應(yīng)對酸堿度很敏感，pH影響酶分子構(gòu)象穩(wěn)定性，過酸或過堿均可導(dǎo)致酶的變性失活。如pH偏離最適pH，則酶催化能力下降。因此，在設(shè)置范圍內(nèi)使酶活性表現(xiàn)最高的pH 7.0為最適pH。

2.1.3 溫度對固定化效果的影響

在載體量0.75 g、pH 7.0、固定化時間2 h條件下，固定化溫度范圍設(shè)置為35～55 ℃，考察不同固定化溫度對固定化酶酶活的影響。結(jié)果如圖1（C）所示，在所設(shè)置的固定化溫度范圍中，相對酶活大致呈現(xiàn)先升后降趨勢，在45 ℃達(dá)到最佳酶活。研究表明在最適溫度下，溫度升高，相對酶活升高。在最適溫度上，隨著溫度升高，酶的變形程度逐步加大，酶的活力逐步降低。因此，45 ℃時酶相對活力最大，為最適溫度。

2.1.4 時間對固定化效果的影響

在載體量0.75 g、pH 7.0、固定化溫度45 ℃條件下，固定化時間范圍設(shè)置為1～5 h，考察不同固定化時間對固定化酶酶活的影響。結(jié)果圖1（D）所示，在設(shè)置的固定化時間范圍內(nèi)，相對酶活呈現(xiàn)先升高后降低趨勢，在0～3 h，改性核桃殼粉末與脂肪酶在充分振蕩的條件下，能更好地吸附脂肪酶，使固定化的效果增強(qiáng)，固定化時間大于3 h時，過度反應(yīng)導(dǎo)致改性核桃殼活性炭孔隙過于致密，阻止載體與酶分子的接觸，使得酶活降低。因此最佳固定化時間為3 h。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 回歸模型建立與討論

根據(jù)單因素試驗(yàn)，以相對酶活為響應(yīng)值，每個影響因素?fù)癯?個水平，即A載體量（0.50，0.75和1.00 g）、B pH（6，7和8）、C溫度（40，45和50℃）、D時間（2，3和4 h），設(shè)計響應(yīng)面試驗(yàn)，經(jīng)Box-Behnken分析得出結(jié)果，見表3。

使用Design-Expert 8.0.5軟件對表2進(jìn)行二次線性回歸擬合，得到回歸方程Y=-1 387.129 67+660.148 67A+174.729 50B+26.807 80C+15.363 00D+5.320 00AB+0.066 000AC+1.270 00AD+0.166 50BC+0.602 50BD+0.183 50CD-491.001 33A2-13.290 08B2-0.315 05C2-4.663 8D2。

表2 響應(yīng)面分析結(jié)果

由表3方差分析的結(jié)果可以得知：整體模型F=187.37，P＜0.000 1，表明試驗(yàn)的模型極顯著；失擬項P=0.079 8＞0.05，說明模型失擬度不顯著；模型的決定系數(shù)R2=0.971 2，試驗(yàn)值與預(yù)測值非常接近，其線性關(guān)系和二次關(guān)系極顯著（P＜0.000 1），說明該模型可很好地解釋響應(yīng)值。模型的調(diào)整決定系數(shù)Radj2=0.989 4，說明該模型能解釋響應(yīng)值的變化，因而擬合程度較好，試驗(yàn)誤差小，可用此模型優(yōu)化酶活進(jìn)行分析和預(yù)測。一次項A（P＜0.01）差異極顯著，一次項B和C（P＜0.05）差異顯著，一次項D（P＞0.05）差異不顯著；A2、B2、C2、D2（P＜0.01）差異極顯著。由F值得出，影響酶活優(yōu)化的4個因素的主次順序?yàn)锳＞B＞C＞D，即載體量＞pH＞固定化溫度＞固定化時間，可見，載體量影響最大，其次為固定化環(huán)境pH，固定化時間影響最小。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析

2.3 HS-SPME-GC-MS分析豬肉風(fēng)味

通過HS-SPM-GC-MS方法，測定出A、B、C這3組樣品的揮發(fā)性物質(zhì)分別為54，44和44種，主要為醛類、醇類和烴類等（圖2），從揮發(fā)性物質(zhì)含量方面來看，經(jīng)固定化脂肪酶處理的樣品這類含量更豐富，對樣品進(jìn)行處理后能賦予豬肉更豐富的香味[12]。

圖2 豬肉樣品處理前后揮發(fā)性成分相對含量的比較

2.3.1 醛類物質(zhì)分析

豬肉中的揮發(fā)性物質(zhì)類型十分豐富，醛類便是其中的一種，這類物質(zhì)通常是脂肪酸氧化降解后形成的。試驗(yàn)結(jié)果表明，在對3組豬肉樣品進(jìn)行檢測后，均得到9種醛類物質(zhì)，其含量占比依次是48.89%，51.33%和54.32%。有研究報道生豬肉中醛類化合物含量約50.27%[13]。樣品C中醛類物質(zhì)含量高于文獻(xiàn)報道，由此可見，在對豬肉樣本進(jìn)行處理過后，會形成更多醛類物質(zhì)。而醛類因?yàn)橛X察閾值較低，所以會對肉品風(fēng)味產(chǎn)生較大影響，通常當(dāng)脂肪酸出現(xiàn)氧化降解反應(yīng)后會生成此類物質(zhì)。3組樣品中都存在的醛類是5～9個碳原子直鏈醛，為主要的醛類，其中，具備較高百分含量的包括己醛、壬醛等[14]。其中，含量最高的是己醛，其味道和青草香味差不多，對豬肉風(fēng)味的影響較大，其后是庚醛、辛醛等，有果香味或油脂香，也是豬肉風(fēng)味的重要影響因素，相似的研究成果也可見報道[15]。

2.3.2 烴類和酯類物質(zhì)分析

烯烴族一般來自于飽和脂肪酸烷氧自由基的均裂，其感覺閾值范圍通常較高，對肉類風(fēng)味的直觀貢獻(xiàn)并不大，甚至基本不影響香味[16]。A、B、C這3組樣品中烯烴類分別檢出5，3和3種，相對含量分別為2.43%，4.61%和36.83%，能夠發(fā)現(xiàn)它們之間存在較大區(qū)別。酯類物質(zhì)一般來源于酸與醇間進(jìn)行的酯化反應(yīng)。樣品中，在檢驗(yàn)出酯類化合物的數(shù)量、相對含量方面，A組分別為5種（3.20%），B組分別為3種（3.26%），C組分別為3種（5.72%）。經(jīng)分析可知，酯類化合物能夠?yàn)槭澄锾峁┑臍馕吨饕?種，首先是蜂蜜香，其次是花香，最后是水果香。在需要對豬肉風(fēng)味進(jìn)行豐富之時，它也能起到一定作用[17]。

2.3.3 醇類物質(zhì)分析

在豐富肉類風(fēng)味方面，醇類雖不如醛類的貢獻(xiàn)更大，但在肉品風(fēng)味中也起關(guān)鍵性作用。在3組樣品里，在檢驗(yàn)出醇類物質(zhì)的數(shù)量、相對含量方面，A組分別為5種（5.02%），B組分別為7種（18.43%），C組分別為7種（23.99%）。1-辛烯-3-醇能產(chǎn)生蘑菇香味，可以提高肉的鮮味，為最典型的肉香型物質(zhì)，來源于脂質(zhì)β-氧化[18]，其相對含量依次是1.23%，13.38%和18.52%，其在A組中含量最低。二甲基硅烷二醇、正辛醇、4, 7-二甲基-4-辛醇在B、C組中都比A組多。由不飽和脂肪酸可知，當(dāng)其出現(xiàn)氧化裂解反應(yīng)之時，會有醇類、醛類物質(zhì)形成[19]。此外，常認(rèn)為肉品風(fēng)味并不會受到酸類物質(zhì)的較大影響，試驗(yàn)中檢測出的酸類化合物含量并不高，相對含量分別為0.51%，0.20%和0.26%。同時在部分揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)中，酸類扮演著中間體的角色，但普遍認(rèn)為此類物質(zhì)并不會對豬肉風(fēng)味產(chǎn)生直接性影響。

2.3.4 酮類物質(zhì)分析

豬肉中的不飽和脂肪酸，發(fā)生氧化降解反應(yīng)時會生成酮類物質(zhì)。經(jīng)分析可知，一部分酮類物質(zhì)的氣味是花果香，而二酮通常產(chǎn)生奶油香、肉香，在碳鏈數(shù)量變多時，花香會更為濃郁[20]。在上述樣品里，在檢驗(yàn)出酮類物質(zhì)的數(shù)量、相對含量方面，A組分別為3種（11.25%），B組分別為2種（7.99%），C組分別為2種（3.89%）。其中有一類酮類物質(zhì)是上述樣品都有的，為3-辛酮，其散發(fā)著奶油香，當(dāng)亞油酸發(fā)生脂氧合酶氧化反應(yīng)之時，便會生成這類物質(zhì)[20]。蔡原等[21]發(fā)現(xiàn)在對豬肉風(fēng)味的貢獻(xiàn)方面，酮類遠(yuǎn)不及醛類，然而在肉類整體風(fēng)味中，酮類所起到的影響卻不可忽略。

2.3.5 其他物質(zhì)分析

當(dāng)含硫氨基酸發(fā)生降解反應(yīng)時，易生成含硫物質(zhì)，檢測的含硫物質(zhì)有許多，比如N-（二甲基氨基甲基）氮丙啶、二甲基二硫化物等。在這些含硫物質(zhì)中，帶有濃郁肉香味的二甲基二硫化物雖然并不具備較高的含量，卻能夠?qū)ωi肉風(fēng)味產(chǎn)生極大影響。同時，通常肉類特征香味的來源有許多，雜環(huán)類化合物便是其中的一種[22]。像檢測出的十二甲基環(huán)六硅氧烷等，盡管并不具備較高含量，但其對豬肉風(fēng)味的影響也不可忽略，有研究發(fā)現(xiàn)，在肉的風(fēng)味上，這些物質(zhì)扮演主要中間體的角色，對肉香的形成作出貢獻(xiàn)極大。

3 結(jié)論

試驗(yàn)以改性核桃殼為載體，采用吸附法固定化豬肉內(nèi)源性脂肪酶。通過單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面優(yōu)化固定化脂肪酶的工藝條件，并研究固定化脂肪酶的熱穩(wěn)定和重復(fù)使用性。在載體量0.75 g、pH 7.0、固定化溫度45 ℃、時間3 h條件下，試驗(yàn)制備的固定化脂肪酶最高酶活力可達(dá)178 U/g。

采用HS-SPME-GC-MS技術(shù)研究豬肉中具體的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)成分，研究結(jié)果表明：經(jīng)改性核桃殼固定化脂肪酶處理前后的豬肉樣品中有9種醛類物質(zhì)，其含量分別為48.89%，51.33%和54.32%；其次是醇類中分別檢出5，7和7種，相對含量分別為5.02%，18.43%和23.99%，其中主要的醇類化合物是1-辛烯-3-醇；烯烴類分別檢出5，3和3 種，相對含量分別為2.43%，4.61%和36.83%。添加改性核桃殼固定化豬肉內(nèi)源性脂肪酶后肉品風(fēng)味物質(zhì)成分發(fā)生改變，豬肉樣品的揮發(fā)性物質(zhì)分別為54，44和44種，主要為醛類、醇類和烴類，這些揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的成分變化表明，添加改性核桃殼法固定化的豬肉內(nèi)源性脂肪酶處理肉品可以有效增加肉品的香氣，提高肉品風(fēng)味，并為固定化脂肪酶在肉品中的應(yīng)用提供試驗(yàn)依據(jù)。