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    大豆苷元干預Hedgehog信號通路調(diào)控去卵巢骨質(zhì)大鼠基質(zhì)金屬蛋白酶代謝

    2022-11-27 07:11:00白登彥王冠張海軍朱濤趙志鵬
    中國骨質(zhì)疏松雜志 2022年11期
    關鍵詞:骨組織蛋白酶股骨

    白登彥 王冠 張海軍 朱濤 趙志鵬

    1.甘肅省第二人民醫(yī)院,甘肅 蘭州 730015 2.西北民族大學附屬醫(yī)院,甘肅 蘭州 730015

    骨質(zhì)疏松(osteoporosis,OP)主要表現(xiàn)為骨微結構改變及骨強度降低,其發(fā)病機制與雌激素降低等多種因素有關。研究發(fā)現(xiàn)[1-2],基質(zhì)金屬蛋白酶代謝對成骨細胞的分化、增殖及代謝起關鍵作用,其中基質(zhì)金屬蛋白酶-7(matrix metalloproteinase-3,MMP-7)和基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑-1(tissue inhibitor of metalloproteinases 1,TIMP-1)的含量變化與OP發(fā)病存在密切關系[3-4]。大豆苷元是大豆異黃酮的主要成分之一,與17β-雌二醇的結構相似,研究指出[5],大豆苷元能夠干預破骨細胞的形成,調(diào)控骨質(zhì)疏松過程,但機制不明確。研究發(fā)現(xiàn)[6],刺猬(Hedgehog,Hh)信號通路與雌激素通路有相互促進作用,而且能干預成骨細胞,調(diào)控骨細胞生長和增殖。本研究通過大豆苷元濃縮液灌胃干預OP模型大鼠,探究大豆苷元對Hedgehog信號通路的調(diào)控作用,并分析其對基質(zhì)金屬蛋白酶代謝的影響。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物

    雌性SPF級20周齡Wistar大鼠60只(購自甘肅中醫(yī)藥大學實驗動物中心,動物合格證號SCXK(甘)2020-0001),體質(zhì)量(200±20)g,飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學SPF動物中心,適應性自由進食、飲水,1周后進行OP實驗造模。

    1.2 藥物、試劑及儀器

    大豆苷元(北京藥品生物制品檢定所,純度>98%,批號:20001),血清雌激素(E2)、骨鈣素(BGP)、血清堿性磷酸酶(ALP)試劑盒(上海信帆生物,批號:E202009P、E202041P、E202033P)。PBS緩沖液(北京藍博斯特),瓊脂糖(濟南匯錦川),TRIZOL試劑(北京萊博潤科),兔多克隆抗體PTC1、Gli1、Shh(美國Sigma,批號:47014、43022、42150);羊抗兔二抗(美國Thermo,批號:QE225340);SDS-PAGE試劑盒(批號:45420)、PCR試劑盒(批號:45525)、BCA檢測試劑盒(批號:48751)、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(批號:76330)、ECL試劑盒(批號:98417)均購自美國CST公司,奧林巴斯光學顯微鏡(JAPAN);PCR熱循環(huán)儀及熒光定量PCR儀(美國伯樂)。

    1.3 動物分組、造模及處理

    將60只大鼠按隨機數(shù)字法分為假手術組、模型組、大豆苷元治療低、中、高劑量組共5組,每組12只。除假手術組外,其他組大鼠按照參考文獻[7],腹腔麻醉后,沿腹中線劍突下切口,分離中下腹部肌肉,打開腹膜,暴露大鼠腹腔,切除雙側卵巢后制備OP模型。術后控制飲食,自由飲水。造模成功后開始灌胃治療,假手術組及模型組給予等劑量生理鹽水灌胃,大豆苷元低、中、高劑量組大鼠分別按人鼠比例2.42、4.84、9.68 mg/(kg·d)灌胃治療,1次/d,共持續(xù)12周。灌胃結束24 h后,大鼠股動脈取血5 mL,迅速離心并提取上清液保存。處死大鼠后取股骨組織樣品4份保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.4 指標處理及檢測

    1.4.1ELISA檢測:取上清液,參照ELISA試劑操作說明,檢測各組大鼠血清中血清E2、BGP、ALP含量水平變化。

    1.4.2免疫組化檢測:取各組大鼠股骨組織進行石蠟包埋切片,脫蠟后水洗進行抗原修復后室溫孵育過夜,PBS洗滌3次,室溫孵育60 min,滴加一抗二抗后,PBS洗滌3次,DAB在顯微鏡下染色,高倍鏡下(×400)觀察各組標本中MMP-7及TIMP-1陽性染色情況,并進行半定量分析。

    1.4.3TUNEL法檢測:取各組大鼠股骨組織,常規(guī)方法石蠟切片后二甲苯洗滌2次,每次5 min,梯度乙醇浸洗后PBS漂洗細胞通透液處理,加入含過氧化氫的PBS漂洗后加入TUNEL反應混合液于標本上檢測標本中各組大鼠骨組織細胞凋亡情況,顯微鏡下記錄并拍照。

    1.4.4RT-PCR法檢測:RNA抽提試劑盒提取各組大鼠骨組織中總RNA,反轉(zhuǎn)錄獲取各組cDNA后設計引物序列,參考RT-PCR實驗方法對各組Shh、PTC1、Gli1 mRNA表達量進行檢測,內(nèi)參為甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH),采用 2-ΔΔCt方法分析不同組別mRNA表達量。引物序列見表1。

    表1 PCR擴增引物序列Table 1 PCR primer sequences

    1.4.5Western blot檢測:各組股骨組織中加入RIPA裂解緩沖液提取樣本中的總蛋白,參照BCA檢測說明測定各組股骨組織中蛋白的含量。SDS-PAGE將蛋白質(zhì)等量分離,4 ℃條件下PDVF膜上添加一抗孵育過夜。PBS洗滌后常溫下添加二抗2 h孵育。ECL試劑顯影后應用軟件Quantity One測定PTC1、Gli1、Shh蛋白表達水平。

    1.5 統(tǒng)計學方法

    2 結果

    2.1 血清E2、BGP、ALP水平變化

    與假手術組大鼠對比,模型組大鼠的BGP、ALP升高,E2含量降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與模型組對比,大豆苷元治療組BGP、ALP含量降低,E2含量升高(P<0.05),且大豆苷元隨劑量增加治療效果更加明顯(P<0.01)。見表2。

    表2 不同組大鼠血清E2、BGP、ALP含量對比

    2.2 股骨組織中MMP-7及TIMP-1蛋白含量變化

    免疫組化染色結果顯示,模型組大鼠組織中MMP-7及TIMP-1表達明顯增多;干預治療后,各治療組MMP-7及TIMP-1表達明顯減少,其中大豆苷元隨劑量增加治療效果更加明顯(P<0.01)。見圖1,表3。

    圖1 大鼠骨組織中MMP-7及TIMP-1含量對比(×400)Fig.1 Comparison between MMP-7 and TIMP-1 contents in bone tissue of rats(×400) 注:A:假手術組,B:模型組,C:大豆苷元低劑量組,D:大豆苷元中劑量組,E:大豆苷元高劑量組。

    表3 大鼠骨組織中MMP-7及TIMP-1含量對比

    2.3 股骨組織細胞凋亡情況比較

    藍色熒光為正常細胞核,綠色熒光為凋亡細胞。鏡下顯示,假手術組大鼠骨組織正常,綠色熒光極少;模型組大鼠造模后綠色熒光增多,提示凋亡細胞增加;干預治療后,各治療組大鼠股骨遠端細胞凋亡數(shù)量減少,其中大豆苷元隨劑量增加治療效果更加明顯。見圖2。

    圖2 各組大鼠股骨遠端細胞凋亡情況(×200)Fig.2 Apoptosis of the distal femur cells in each group(×200)

    2.4 股骨組織中PTC1、Gli1、Shh mRNA表達水平

    與假手術組對比,模型組大鼠股骨組織中PTC1、Gli1、Shh mRNA表達升高(P<0.05)。與模型組對比,各治療組PTC1、Gli1、Shh mRNA含量明顯降低(P<0.05),且大豆苷元的治療效果隨劑量增加更加明顯(P<0.01)。見圖3。

    圖3 股骨組織中PTC1、Gli1、Shh mRNA表達量比較Fig.3 Comparison among PTC1, Gli1, and Shh mRNA expression in the femur注:A:假手術組,B:模型組,C:大豆苷元低劑量組,D:大豆苷元中劑量組,E:大豆苷元高劑量組。與假手術組比較,*P<0.05;與模型組比較,▲P<0.05。

    2.5 股骨組織中PTC1、Gli1、Shh蛋白表達水平

    與假手術組對比,模型組股骨組織中PTC1、Gli1、Shh蛋白表達升高(P<0.05)。與模型組對比,各治療組PTC1、Gli1、Shh蛋白含量表達降低(P<0.05),且大豆苷元的治療效果隨劑量增加更加明顯(P<0.01)。見圖4。

    圖4 股骨組織中PTC1、Gli1、Shh蛋白表達對比Fig.4 Comparison among PTC1, Gli1, and Shh protein expression in the femur注:A:假手術組,B:模型組,C:大豆苷元低劑量組,D:大豆苷元中劑量組,E:大豆苷元高劑量組。與假手術組比較,*P<0.05;與模型組比較,▲P<0.05。

    3 討論

    雌激素替代治療是雌激素缺乏導致的OP的主要治療方法,但其禁忌癥較多[8]。植物激素存在與雌激素相似的功能和結構,其中部分植物激素在組織中能夠選擇性地與雌激素受體(ER)結合,發(fā)揮弱雌激素樣活性作用。大豆苷元是一種具有類似雌激素功能的非甾類化合物。研究顯示[9-10],大豆苷元能夠有效抗雌激素活性,改善骨損傷,干預成骨細胞的形成,但其具體機制不詳。

    血清E2濃度是反映絕經(jīng)后機體雌激素水平最重要的一種激素[11]。BGP和ALP由成骨細胞分泌產(chǎn)生,其表達水平能夠體現(xiàn)骨形成與骨吸收的過程,是評估骨質(zhì)量的關鍵指標[12]。本研究結果顯示,在摘除大鼠卵巢后,大鼠E2含量明顯降低,BGP、ALP含量升高,證明大鼠在造模后雌激素降低,骨質(zhì)量發(fā)生改變,經(jīng)過大豆苷元干預后,OP大鼠E2明顯升高,BGP、ALP含量明顯降低,說明OP大鼠在大豆苷元干預后,雌激素水平及骨的發(fā)育得到一定改善。MMP-7是骨吸收過程中具有降解細胞外基質(zhì)作用的酶,在OP發(fā)病過程中MMP-7過表達可降解細胞外蛋白多糖、IX型膠原等多種基質(zhì)蛋白產(chǎn)物,影響骨組織平衡狀態(tài)下基質(zhì)的合成與分解,加速骨吸收過程[13]。TIMPs作為金屬蛋白酶抑制因子,對組織中的間質(zhì)膠原酶以及間質(zhì)溶解素具有特異性,可直接與活化的MMPs家族形成1∶1復合體進而抑制MMPs活性,降低MMP-7對骨組織的損害[14]。本研究顯示,OP大鼠的骨組織在造模后MMP-7及TIMP-1蛋白含量發(fā)生明顯變化,MMP-7表達增高,TIMP-1表達降低,經(jīng)大豆苷元干預治療后,MMP-7及TIMP-1蛋白含量發(fā)生明顯改善,這說明大豆苷元干預了骨組織中MMP-7及TIMP-1的蛋白表達。

    Hh信號通路是骨細胞分化過程中的關鍵通路之一,與骨細胞形成及骨代謝疾病存在密切關系[15]。在骨細胞分化過程中,Hh信號通路的關鍵受體音猬因子(Shh)與下游基因12次跨膜蛋白Ptched1(Ptch1)和膠質(zhì)瘤相關腫瘤基因同源物 1(Gli-1)在成骨細胞中表達,進而促進骨髓間充質(zhì)干細胞分化為成骨細胞和軟骨細胞[16-17]。骨缺損和骨再生過程中Shh含量變化可激發(fā)骨髓間充質(zhì)干細胞向成骨細胞分化,這是促進骨組織生成的關鍵因素[18]。正常骨組織中Hh信號活性較低,當激發(fā)骨細胞分化時,Hh通路中關鍵的因子含量發(fā)生明顯變化,其中關鍵因子Gli1能夠調(diào)控膜型金屬基質(zhì)蛋白酶(MTI-MMP)的表達來促進細胞的遷移和侵襲,而Shh表達變化與MMP-7及TIMP-1存在密切聯(lián)系[19-20]。本研究也表明,OP大鼠造模成功后,骨組織細胞凋亡明顯增加,基質(zhì)金屬蛋白酶發(fā)生改變,PTC1、Gli1、Shh蛋白及基因表達也發(fā)生明顯改變,這說明Hh信號通路參與了OP的發(fā)病過程。而且本實驗還證實,大豆苷元干預OP大鼠后,大鼠骨細胞凋亡情況顯著改善,而骨組織中Hh信號通路相關蛋白基因及基質(zhì)金屬蛋白酶也發(fā)生明顯改善,這也證明大豆苷元有效調(diào)控了OP大鼠Hh信號通路的表達,影響細胞凋亡過程,干預了基質(zhì)金屬蛋白酶代謝,進而影響OP的發(fā)病過程。

    綜上所述,大豆苷元可調(diào)控Hh信號通路,影響基質(zhì)金屬蛋白酶代謝,干預骨細胞凋亡過程,但其干預的具體機制仍需深入研究。

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