不同產(chǎn)地黃精多糖含量、多糖紅外光譜及抗氧化活性研究*

賀維濤 年婧 趙重博

(1.涇陽縣醫(yī)院，陜西 咸陽 713700；2.陜西中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，陜西 咸陽 712000；3.陜西中醫(yī)藥大學，陜西 咸陽 712046)

黃精為百合科植物滇黃精PolygonatumKingianumColl.et Hemsl.、黃精PolygonatumsibiricumRed.或多花黃精polygonatumcyrtonemaHua.的干燥根莖。黃精屬植物在我國分布很廣，大約有40余種，但適應性較差，生境選擇性強[1]。其中黃精主要分布在陜西、河北、內蒙古等?。欢嗷S精在南方地區(qū)分布最多，主要集中在湖南、湖北、安徽、浙江等??；滇黃精主要分布于云南、貴州及四川[2-4]。

自古黃精就被認為是藥食同源之品，久服可輕身不老益壽延年，隨著健康中國2030規(guī)劃綱要的推進，人們保健意識逐漸增強，具有保健功能的中藥的市場需求越來越大，黃精因其良好的藥用價值和豐富的生物活性成為食品、醫(yī)藥等領域開發(fā)和研究的熱點中藥。本研究通過測定9個產(chǎn)地3個不同基源黃精的多糖性質，為黃精的產(chǎn)品開發(fā)提供參考。

1 儀器與試藥

1.1儀器 SHB-3循環(huán)水式多用真空泵(河南予華儀器有限公司)；UV2550 型紫外分光光度計(日本島津科學儀器有限公司)；RE-52AA 旋轉蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；DHG-9140型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海合恒儀器設備有限公司);GB5374-91型電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；中草藥粉碎機(天津泰斯特儀器有限公司)；HH-X型數(shù)顯電熱恒溫水浴鍋(北京科委永興儀器有限公司)；Tensor-27型-傅里葉變換紅外光譜儀(德國布魯克公司)。

1.2試藥 黃精藥材分別來自安國市場、玉林市場、荷花池市場和陜西漢中略陽縣，經(jīng)王昌利教授鑒定為百合科黃精屬植物黃精PolygonatumsibiricumRed.的干燥根莖(見表1)。石油醚、95%乙醇、無水乙醇、濃硫酸、溴化鉀(天津市天力化學試劑有限公司)；蒽酮(國藥集團化學試劑有限公司)；葡萄糖標準對照品(純度≥99%，批號：140974-110833，中國食品藥品檢定研究院)；木瓜蛋白酶(含量98%，比活力 0.5～2 U·mg-1，批號：P3250，美國Sigma-Aldrich 公司)；Vc標準對照品(純度≥99%，批號：S05J6G1，上海源葉生物科技有限公司)；DPPH標準對照品(Diybio生物科技有限公司)。

表1 樣品來源

2 方法

2.1黃精總糖含量測定 參考2020年版《中國藥典》黃精藥材含量測定項下多糖含量的測定方法[5]。

2.1.1對照品溶液的制備 稱取105 ℃干燥至恒重的無水葡萄糖對照品適量，精密稱定，置于100 mL棕色量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，得濃度為0.33 mg·mL-1對照品儲備液。

2.1.2標準曲線的制備 分別精密移取該儲備液0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mL 置于10 mL 具塞試管中，分別加水至2.0 mL，各加入0.2% 蒽酮-硫酸試液至刻度，搖勻，水浴保溫10 min，取出置于冰水浴冷卻10 min，取出，于582 nm處測定吸光度A，以A為縱坐標，對照品質量濃度(C)為橫坐標，繪制標準曲線。

2.1.3黃精總多糖含量測定 分別取不同產(chǎn)地黃精藥材粉末0.25g(過四號篩)，精密稱定，置圓底燒瓶中，加80%乙醇150mL，置水浴中加熱回流1 h，趁熱濾過，殘渣用80%熱乙醇洗滌3次，每次10 mL，將殘渣及濾紙置燒瓶中，加水150 mL，置沸水浴中加熱回流1 h，趁熱濾過，殘渣及燒瓶用熱水洗滌4次，每次10 mL，合并濾液與洗液，放冷，轉移至250 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，精密量取l mL，置10 mL具塞干燥試管中，0.2% 蒽酮-硫酸試液顯色后于582 nm處測定吸光度，計算總多糖含量。

2.2黃精多糖制備

2.2.1黃精粗多糖制備 取黃精藥材粉末500 g(過60目篩)，加400 mL石油醚脫脂8 h。紗布過濾，藥渣加20倍蒸餾水，煎煮兩次，每次2 h，過濾后濾液合并，常壓濃縮冷卻至常溫并定容至1000 mL，即得總多糖提取液。加入無水乙醇，使乙醇體積分數(shù)為80%，搖勻，醇沉液置常溫環(huán)境中靜置20 h，抽濾收集沉淀，干燥，得黃精粗多糖，記錄重量[6]。

2.2.2除蛋白 取黃精粗多糖10 g加超純水充分溶解，加入相當于粗多糖質量的1%的木瓜蛋白酶，在55℃水浴反應2 h，反應結束后用沸水煮5 min滅活木瓜蛋白酶，酶解液離心(4000 r·min-1，5 min)，收集上清液后減壓濃縮，體積比5∶1加入Sevage試劑(三氯甲烷-正丁醇=4∶1)振蕩20 min，然后靜置10 min，4000 r·min-1離心10 min。棄去中間層和下層物質，反復5～6次，紫外分光光度計檢測260～280 nm吸收波長至無吸收，旋蒸除去殘留的Sevage試劑，緩慢加入無水乙醇，使乙醇體積分數(shù)為80%，搖勻，醇沉液置常溫環(huán)境中靜置20 h，抽濾收集沉淀，干燥，得黃精多糖，記錄重量[7-8]。

2.3黃精多糖紅外檢測 分別取不同產(chǎn)地黃精多糖樣品，以 1∶200 比例同溴化鉀混合后，在瑪瑙研缽中磨至約200目粉末，在紅外壓片機上制成透明薄片，采用紅外光譜儀，在范圍為 4000～400 cm-1，共掃描 20次，分辨率為 2 cm-1。以純溴化鉀得到的紅外光譜圖作為背景[9-10]。

2.4黃精多糖抗氧化活性

2.4.1DPPH溶液的配制 稱取DPPH試劑適量，精密稱定，置于100 mL棕色容量瓶中，用無水乙醇溶解，并定容至刻度線，搖勻，即得濃度為0.04 mg·mL-1溶液。

2.4.2Vc溶液的配制 稱取Vc對照品適量，精密稱定分別置于5 mL棕色容量瓶中，用無水乙醇溶解并定容至刻度線，搖勻，分別制成0.5 mg·mL-1、1 mg·mL-1、2 mg·mL-1、4 mg·mL-1、8 mg·mL-1、10 mg·mL-1的對照品溶液。

2.4.3黃精多糖供試品溶液的配制 稱取各種黃精多糖適量，分別置于5 mL容量瓶中，用純水溶解并定容至刻度線，搖勻，分別制成0.5、1.0、2.0、4.0、6.0和8.0 mg·mL-1的供試品溶液。

2.4.4DPPH自由基清除率測定 分別吸取不同濃度的陽性對照品Vc溶液(以無水乙醇為空白)與供試品溶液(以水為空白)，各0.2 mL置于10 mL具塞刻度試管中，再加7.8 mL的DPPH溶液，搖勻，在室溫下反應30 min，于紫外分光光度計515 nm處測定吸光度。依公式計算DPPH清除率[11-13]。

DPPH自由基清除率=(1-Ai/AO)×100%

注：Ai.樣品加DPPH溶液的吸光度；AO.空白溶液加DPPH溶液的吸光度

3 結果

3.1黃精多糖測定結果 葡萄糖回歸方程A=0.5065C+0.017(r=0.9993)，標準曲線見圖1，表明葡萄糖質量濃度在0.33～1.98 mg·mL-1范圍內與吸光度A呈良好線性關系。黃精多糖測定結果見表2。

圖1 葡萄糖濃度標準曲線

由表2得，9種不同產(chǎn)地黃精的多糖存在明顯的差異，其總糖含量由大到小為4(云南)>1(河北)>7(廣西)>3(湖南)>5(貴州)>6(四川)>2(江西)>9(陜西)>8(湖北)。

表2 不同產(chǎn)地黃精多糖含量測定結果

粗多糖含量由大到小為4(云南)>1(河北)>6(四川)>9(陜西)>2(江西)>5(貴州)>7(廣西)>3(湖南)>8(湖北)。

多糖含量由大到小為1(河北)>4(云南)>9(陜西)>6(四川)>7(廣西)>2(江西)>3(湖南)>5(貴州)>8(湖北)。

3.2紅外測定結果 紅外測定結果見圖2，不同產(chǎn)地黃精多糖的紅外光譜在3600～1200 cm-1處基本相似，說明具有相似的官能團。在3400 cm-1和2900 cm-1附近處出現(xiàn)吸收峰，說明在多糖中含有-OH伸縮震動吸收峰和C-H伸縮震動吸收峰，這兩個吸收峰均為多糖的典型吸收峰，1600 cm-1附近處是C=O的吸收峰，在1400～1200 cm-1是C-H的變角振動引起的吸收峰。

圖2 不同產(chǎn)地黃精多糖紅外光譜堆積折線圖

在紅外光譜指紋區(qū)存在個別差異，在1100 cm-1處出現(xiàn)吸收峰，含有吡喃環(huán)結構，890 cm-1處的吸收峰說明具有β糖苷鍵，830 cm-1處的吸收峰說明具有α糖苷鍵。其余產(chǎn)地黃精多糖僅有β糖苷鍵，無α糖苷鍵吸收；湖南和湖北黃精多糖同時含有β糖苷鍵和α糖苷鍵[14-16]。

3.3抗氧化活性測定結果 不同產(chǎn)地黃精多糖樣品抗氧化結果見圖3，多糖濃度與DPPH清除率存在一定的量效關系，高濃度DPPH清除率貴州>河北>四川>江西>陜西>云南>湖南>廣西>湖北，其中貴州黃精多糖高濃度的DPPH清除率和Vc的效應相似。

圖3 不同產(chǎn)地黃精多糖抗氧化活性結果

4 討論

黃精多糖是黃精的主要成分，是其抗疲勞、抗氧化作用、延緩衰老的主要活性物質，不同產(chǎn)地黃精的多糖含量有一定差異，目前黃精的含量測定方法均是通過蒽酮硫酸法檢測，多糖被硫酸水解為單糖，單糖在硫酸作用下脫水生成糠醛，糠醛與蒽酮作用形成一種藍綠色的絡合物，在620 nm處有最大吸收。但是此法無法排除寡糖和單糖的影響[17-18]。文中檢測結果提示：云南產(chǎn)黃精總糖含量最高，達到16.01%，遠高于2020版《中國藥典》7%的含量要求，同時其粗多糖含量12.56%，也位居第一，但其多糖含量卻不及總糖含量較之略少的河北產(chǎn)黃精，可能與不同產(chǎn)地黃精含有的單糖及蛋白成分含量差異有關。

紅外結果表明不同產(chǎn)地多糖的官能團基本一致，都包含O-H振動吸收峰，亞甲基C-H振動吸收峰，C-H的變角振動，吡喃環(huán)的醚鍵C-O-C振動吸收峰，湖南和湖北的黃精多糖所含官能團與其他產(chǎn)地有一定差異?？寡趸钚詼y定結果表明貴州黃精效果最好，也符合民國《藥物出產(chǎn)辨》及近現(xiàn)代認為貴州產(chǎn)黃精品質優(yōu)良的觀點[19-20]。