脂肪間充質干細胞治療新型冠狀病毒肺炎的研究進展

譚麗 綜述 陳世玖 審校

遵義醫(yī)科大學第五附屬(珠海)醫(yī)院，廣東 珠海 519100

在過去的二十年里，嚴重急性呼吸道感染的高發(fā)病率被認為是主要的國際衛(wèi)生問題之一。據(jù)估計，嚴重急性呼吸綜合征(severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoV)和中東呼吸綜合征(middle east respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV)感染人數(shù)分別超過8 422人和1 600人，并導致超過916人和574人死亡[1]。2019年至今一種新型呼吸道傳染疾病在全球范圍內廣泛流行，并被世界衛(wèi)生組將該傳染病毒命名為2019-新型冠狀病毒(COVID-19)，其發(fā)病率和死亡率相比SARS-CoV和MERS-CoV更高。截至2021年8月27日，世界衛(wèi)生組織累計報告全球確診病例達2億余人，累計死亡病例達400萬余人。目前除了需要廣泛接種疫苗，還需要開發(fā)安全有效的治療方式。

醫(yī)療衛(wèi)生行業(yè)正在研究可行的方法來遏制這場全球威脅，包括使用維生素、抗病毒藥物和恢復期血清抗體，以及開發(fā)疫苗。許多治療方案都仍在被研究，近幾個月來，人們對在新冠肺炎患者中使用間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)療法越來越感興趣。因其具有抑制炎癥和分泌細胞因子的功能，正如幾個實驗中證明[2-3]：MSCs治療急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)模型的早期研究報告顯示，MSCs具有改善肺部微環(huán)境、抑制過度活躍的免疫系統(tǒng)、促進組織修復、保護肺泡上皮細胞、預防肺纖維化和保存長期肺功能等作用。脂肪間充質干細胞(adipose-derived mesenchymal stem cells，ADSCs)是表達這些重要特征的一種MSCs類型，被認為是治療COVID-19相對安全的工具，能夠降低其重癥率和死亡率。

1 COVID-19的發(fā)病機制

1.1 SARS-CoV-2感染 COVID-19的常見臨床特征包括發(fā)熱、頭痛、咳嗽、骨痛、肌痛、嗅覺障礙、味覺減退和呼吸困難。SARS-CoV-2感染的發(fā)病機制包括病毒刺突蛋白識別血管緊張素轉換酶-2(angiotensin converting enzyme-2，ACE-2)和細胞跨膜蛋白酶絲氨酸-2(transmembrane protease，serine-2，TMPRSS-2)啟動刺突蛋白促進宿主細胞進入和擴散[4]。嚴重的呼吸系統(tǒng)疾患是SARS-CoV-2感染的主要后果，因為ACE-2受體廣泛表達于肺泡Ⅱ型細胞和毛細血管內皮細胞。此外，肺泡細胞表達TMPRSS-2，病毒性肺部感染導致炎癥因子的產生，大量炎癥因子快速外流。在17.3%的患者中，炎癥因子水平的升高導致廣泛的肺組織水腫、肺彌散功能障礙、急性呼吸困難，繼發(fā)感染和死亡[5]。由于細胞因子級聯(lián)反應快速的進展，導致危重的新冠肺炎患者常發(fā)展成為ARDS。

1.2 難以逆轉的肺損傷-ARDS ARDS是以低氧血癥、肺水腫、彌漫性肺泡損傷和多器官衰竭為特征的多因素嚴重肺部損傷，其是由嚴重的肺部和全身炎癥引起的，中性粒細胞和巨噬細胞侵入肺泡腔，白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-1(IL-1)、白細胞介素-8(IL-8)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等炎癥因子的局部釋放導致肺內皮細胞和上皮細胞損傷，在這種炎癥反應下肺內活性氧產生增加，損害肺屏障功能，血管通透性增加，促進肺泡蛋白滲出物積聚，最終導致肺纖維化[6]。目前管理和治療ARDS仍提倡內源性修復，減少呼吸機引起的肺損傷，以幫助肺損傷恢復。有證據(jù)表明，神經肌肉阻滯和俯臥位可以提高ARDS患者的存活率，同時機械通氣和限流管理可提供器官氧氣支持，將醫(yī)源性傷害降至最低[7]；此外還幾種藥理學方法，包括使用糖皮質激素、表面活性劑、吸入一氧化氮、抗氧化劑和蛋白酶抑制劑等，但這類治療效果都欠佳。目前，還沒有針對ARDS的直接治療方法。

2 ADSCs

2.1 ADSCs的優(yōu)越性 1968年，F(xiàn)RIEDENSTEIN等[8]科學家從骨髓中分離出骨髓間充質干細胞(mesenchymal stem cells from bone marrow，BM-MSCs)，然后將其命名為集落成纖維細胞(colony-forming unit fibroblast，CFU-F)。1991年，CAPLAN將這些細胞命名為間充質干細胞(MSCs)，因為它們在胚胎發(fā)育過程中起源于間充質，并具有分化為成骨細胞、脂肪細胞和軟骨細胞的能力[9]。然而，骨髓來源的MSCs并不適合臨床應用，因為其需要進行高侵入性的抽吸程序，并且隨著年齡的增加，增殖和分化能力都會下降。21世紀初在尋找替代骨髓干細胞來源的過程中，ZUK等[10]發(fā)現(xiàn)了一種從形態(tài)和表型上與MSCs相似的，從脂肪組織中分離出來的多潛能、未分化并自我更新的祖細胞群體。通過微創(chuàng)的方法提取皮下脂肪組織，并經過簡單的分離程序可以得到ADSCs；其次，干細胞的質量和增殖能力不會隨著患者年齡的增長而下降，與骨髓來源的MSCs相比具有明顯的優(yōu)勢。實驗臨床研究都證實了其具有顯著的抗炎作用[11]；并且經培養(yǎng)擴增的MSCs表達低水平的MHCⅠ類分子，不表達MHCⅡ類分子或分子B7-1、B7-2或CD40；與BM-MSCs相比，ADSCs表達的HLA-Ⅰ類分子水平甚至更低[12]。因此MSCs在同種異體移植后不會引發(fā)典型的免疫反應，這使得在臨床治療中使用來自其他捐贈者的MSCs成為可能[13]。

2.2 ADSCs的應用 ADSCs具有三胚系分化潛能，因而具備抗凋亡、抗炎、促血管生成、免疫調節(jié)和抗瘢痕的作用[14]，為其在再生醫(yī)學中廣泛的治療應用提供了良好前提條件。到目前為止，臨床應用也較為廣泛，例如軟組織再生、骨骼組織修復、缺血性損傷、心肌梗死和免疫紊亂(包括狼瘡、關節(jié)炎、克羅恩病、多發(fā)性硬化癥、糖尿病和移植物抗宿主病)。鑒于ADSCs具有巨大的治療潛力，故在整形與重建外科中廣泛應用，如面部創(chuàng)面修復及切除后的乳腺重建；由于ADSCs具有分泌細胞因子、趨化因子和生長因子的特性有助于有效的抗瘢痕治療[15]，對于細胞外基質的聚集和重塑或炎癥發(fā)生引起的增生性瘢痕能起有效治療作用。此外，它們能夠分化成不同的細胞系，并分泌高水平的蛋白質，這些蛋白質在免疫調節(jié)、血管生成、血管重建、皮膚傷口愈合和組織再生方面發(fā)揮功能。除了分泌功能性蛋白質外，還可以釋放胞外體，被定義為具有多囊泡的細胞外小泡(extracellular vesicles，EVs)[16]。研究表明干細胞來源的胞外體通過旁分泌或內分泌信號將蛋白質、mRNAs、microRNAs(MiRNAs)和DNA分子從一個細胞轉移到另一個細胞[17]，它是調節(jié)細胞生物學行為、細胞間信號傳遞的工具，如血管生成、免疫調節(jié)、增殖和遷移等[18]。ADSC-EVs的療效和治療益處已經在廣泛的疾病中得到了觀察和證實，并對未來治療應用的發(fā)展非常重要，例如皮膚修復、再生工程和腫瘤應用等。

3 ADSCs治療COVID-19的潛能

3.1 注入的MSCs在肺中聚集 靜脈輸注的MSCs會在肺部積聚，分泌大量旁分泌因子，在保護或恢復肺泡上皮細胞、對抗肺纖維化和改善肺功能方面發(fā)揮重要作用。靜脈注射后，MSCs具有定位能力和作用于其他受損的器官，如心臟、肝臟和腎臟[19]。此外，小部分MSCs進行了移植。在靶器官中，當它們在肺的微血管系統(tǒng)中時[20]，會對肺臟起良好治療效果。

3.2 治療機制 MSCs具有以下作用：免疫調節(jié)、抗病毒、促使抗炎分子產生、抗菌及能促進巨噬細胞清除細菌、抑制肺纖維化和瘢痕形成、分泌促有絲分裂和抗凋亡的分子、清除肺內的肺泡液、產生細胞外小泡。

3.2.1 免疫調節(jié) 研究表明，新冠肺炎患者的調節(jié)性T細胞數(shù)量會減少，特別是病情重的患者[21]。ADSCs能增加調節(jié)性T細胞(Treg)的生成，并且比BM-MSCs能更有效地促進Treg細胞的發(fā)育[22]。MSCs表現(xiàn)出對CD19+B細胞、CD4+Th1細胞、CD8+T細胞、巨噬細胞、單核細胞和中性粒細胞的增殖、激活和成熟的抑制作用，ADSCs對樹突狀細胞分化的免疫調節(jié)已被證明比BM-MSCs更有效[23]。當骨髓間充質干細胞被免疫細胞吞噬時，會引起單核細胞表型和功能的改變，進而調節(jié)免疫系統(tǒng)細胞[24]。

3.2.2 抗病毒 MSCs抑制病毒的復制、脫落并減少病毒誘導的肺上皮細胞(lung epithelial cell，LECs)損傷。KHATRI等[25]證明了MSCs來源的胞外囊泡(MSC-EVs)通過將RNA從EVS轉移到LECs來促進抗炎和抗病毒特性，在豬流感病毒性肺炎模型中證明氣管內注射MSC-EVs可以顯著減少病毒進入LECs及病毒復制。

3.2.3 促使抗炎因子產生 在許多急性肺損傷模型中，間充質干細胞的應用已顯示出其具有的抗炎作用[26]。間充質干細胞將炎癥中釋放大量的促炎細胞因子(包括IL-1β、IL-6、MCP-1、MIP-2、CXCL-1、CXCL-2、TNF-β、IL-12和IL-17等蛋白酶)轉變?yōu)榭寡谞顟B(tài)；釋放大量抗炎細胞因子包括IL-4、IL-10、轉化生長因子-α、CCL18、前列腺素E2、IDO、一氧化氮，這種轉變促進了炎癥消退和組織修復。

3.2.4 抗菌 間充質干細胞具有天然的抗菌特性，這一特性已在體外和動物實驗中得到證實。間充質干細胞對細菌直接清除是由LL-37通過Toll樣受體-4信號通路和Lipocalin-2通過β-防御素-2介導的[27-28]。研究表明，當巨噬細胞從促炎表型重新編程為抗炎表型時，MSCs可以增加其的吞噬活性[29]。

3.2.5 抑制肺纖維化 有關動物模型證明，早期應用MSCs來改善炎癥和中度纖維化肺組織重塑是有效果的[30]。此外，MSCs分泌的細胞生長因子(keratinocyte growth factor，KGF)參與了肺上皮修復。研究表明，經修飾表達KGF的BM-MSCs在小鼠模型中被證明對博萊霉素誘導的肺纖維化治療有效[31]。

3.2.6 分泌促有絲分裂和抗凋亡的因子 MSCs通過分泌血管內皮生長因子、胰島素生長因子、肝細胞生長因子、神經營養(yǎng)因子-3和神經生長因子等生物活性因子，通過線粒體及微泡轉移發(fā)揮抗凋亡作用[32]。肺損傷也可以通過自噬得到改善，這可能是由于MSCs作用于抗氧化應激、細胞保護和磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(P13K/Akt)信號通路引起的[33]。

3.2.7 清除肺泡液 肺泡Ⅱ型細胞約占肺泡表面積的2%～5%，它們產生表面活性劑并作為肺泡上皮的祖細胞。肺泡液是由鈉離子和氯離子通過上皮細胞膜上的轉運體沿滲透梯度移動，以離開肺泡并維持中空結構。ARDS患者的肺泡清除力(alveolar fluid clearance，AFC)受損，是導致ARDS發(fā)病率和死亡率較高的原因[34]。多項研究證實，MSCs與鈉離子和氯離子通道的相互作用增強了AFC，并促進了肺水腫得到緩解[35]。LOY等[36]的研究結果顯示：在甲型H5N1流感病毒相關的急性肺損傷中，MSCs改善了AFC和肺泡通透性(alveolar protein permeability，APP)，并且研究發(fā)現(xiàn)聯(lián)合應用肝細胞生長因子和血管生成素-1可以恢復AFC和APP，但聯(lián)合應用效果不如單獨使用MSCs。

3.2.8 胞外體 目前，研究表明MSCs產生EVs有助于減輕急性肺損傷[37]。來源于BM-MSCs的EVs接種于細菌性肺炎的小鼠，可減少炎癥細胞、炎癥因子、炎癥介質和細菌的流入。EVs的攝取對于療效至關重要，在體外灌流的細菌性肺炎模型上測試了EVs的治療效果，從人BM-MSCs條件培養(yǎng)液中分離EVs，給予EVs可顯著增加肺泡液清除率，降低蛋白通透性，并降低損傷肺泡內的細菌含量。此外，經EVs治療后，分離的人肺泡巨噬細胞的抗菌活性增強[38]。

4 MSCs治療ARDs的實驗研究

在大腸桿菌內毒素、缺氧和呼吸機誘導的肺損傷動物模型中，MSCs促進肺損傷動物模型的恢復[39]。在這些模型中，MSCs抑制腫瘤壞死因子-α的釋放，促進IL-10的分泌，降低IL-6水平，增加KGF和血管生成素-2的表達，促進巨噬細胞功能的重新編程和抗菌肽的分泌[39]。MCINTYRE等[40]對17項關于臨床前動物模型的死亡率進行了回顧性研究發(fā)現(xiàn)：與對照組相比，MSCs治療顯著降低了急性肺損傷動物的總體死亡率。在一項常發(fā)疾病研究中，ADSCs被用來治療肺泡上皮和肺泡的病變[41]，ADSCs被認為可以修復肺部病患處受損的血管，防止肺毛細血管出血，降低肺動脈高壓，減輕血管周圍炎癥和纖維化。

此外，MSCs具有抗菌和抗炎作用。在不同的ARDS模型中，全身和氣管內注射MSCs靶向作用于肺損傷最明顯處，減輕肺部和全身炎癥，提高細菌清除率，并增加AFC和氣體交換能力，從而降低ARDS的死亡率[42]。

已有相關臨床研究證明MSCs治療ARDS的有效性。SIMONSON等[43]對2例嚴重難治性ARDS患者靜脈注射異基因BM-MSCs 2×106個/kg治療，兩例患者均從多器官衰竭中恢復，其肺泡灌洗液和血漿中的上皮細胞的凋亡程度，肺泡毛細血管液體的滲出量，促炎因子、miRNAs和趨化因子的標志物均降低。MATTHAY等[44]報道了一項前瞻性、雙盲、多中心、隨機試驗的研究，以評估BM-MSCs治療ARDS的療效，在40例中重度ARDS患者中單次靜脈注射BM-MSCs 10×106個/kg與安慰劑進行比較，BM-MSCs組血漿中血管生成素-2水平的下降幅度明顯大于安慰劑組。有關實驗證實血管生成素-2濃度的降低與抗炎介質的釋放有關，從而減輕肺損傷[45]。BM-MSCs治療組患者的疾病嚴重程度評分高于安慰劑組，但各組之間的死亡率沒有顯著差異，故通過BM-MSCs治療。單次靜脈注射BM-MSCs對中、重度急性呼吸窘迫綜合征患者是安全的，仍需進行更大規(guī)模的試驗來評估療效。

5 MSCs治療COVID-19的臨床研究

MSCs通過釋放各種旁分泌因子和外泌體，調節(jié)免疫系統(tǒng)，防止細胞因子釋放綜合征，并促進內源性肺損傷修復，可對COVID-19起治療作用，針對COVID-19的細胞治療臨床研究正在增多[46]。

LIU等[47]回顧性分析了109例患有及不患有ARDS的新冠肺炎患者之間的差異，患者的平均年齡為55歲，平均隨訪時間為15 d，總存活率為71.6%。在所有患者中48.6%的患者發(fā)生了ARDS，與非ARDS患者比較，ARDS患者年齡較大，并合并有其他疾病?？傊M管使用了抗病毒、糖皮質激素或免疫球蛋白治療，ARDS患者存活率仍無明顯改善。

LIANG等[48]報道了一例感染SARSCoV-2的重癥65歲女性的治療。2020年1月27日，患者先出現(xiàn)疲勞、發(fā)燒和咳嗽，接著第二天出現(xiàn)胸悶，缺氧和高血壓，并檢測出2019年新型冠狀病毒陽性。最初采用抗病毒、干擾素-γ霧化吸入、奧司他韋、靜脈注射莫西沙星、血必凈、甲基強的松龍和免疫球蛋白、由機械呼吸機維持等治療。幾天后被診斷出患有危重型新冠肺炎并伴有急性呼吸衰竭，被轉移到重癥監(jiān)護病房接受呼吸機支持，并停用糖皮質激素和抗病毒治療，1周后靜脈注射50×106個同種異體UC-MSCs，未發(fā)現(xiàn)明顯的不良反應。在首次治療后第3天和第6天重復治療。輸注第三劑疫苗2 d后，后轉出重癥監(jiān)護病房，生命體征和實驗室指標正常，咽拭子新冠肺炎抗原檢測呈陰性。這項研究僅限于一例危重患者，但積極的治療效果支持更深一步的研究。

LENG等[4]報道了靜脈注射UC-MSCs對7例新冠肺炎患者有改善功能和促進康復的作用。入選病例均為SARS-CoV-2陽性，其中1例為危重癥，4例為重型，2例癥狀較輕；另有3例重癥患者參加了安慰劑對照。輸注MSCs前所有患者均出現(xiàn)高熱、呼吸急促、低血氧飽和度和肺炎等臨床表現(xiàn)。當癥狀加重時，患者靜脈注射1×106個UC-MSCs/kg，并密切隨訪14 d，癥狀在注射MSCs后的2～4 d內消退，胸部CT顯示肺炎浸潤程度明顯消退，并且沒有不良反應。大多數(shù)患者在輸注MSCs后一周或兩周后的SARS-CoV-2核酸檢測呈陰性，MSCs可以顯著改善這7例患者的肺功能，并且沒有觀察到任何不良反應。雖然短期沒有觀察到不良反應，但在未來的臨床研究中仍有必要對MSCs應用后長期隨訪。

6 ADSCs安全性存在的爭議

雖然ADSCs在再生醫(yī)學領域具有廣大的應用前景，但是其能促進殘留腫瘤細胞增殖、分化或轉移，甚至誘導新的癌變，這一點是不可忽視的。因此，ADSCs在臨床應用是否安全的問題在當前廣泛討論。有研究發(fā)現(xiàn)，對于乳腺癌，癌細胞刺激間充質干細胞重新分泌趨化因子CCL5以旁分泌的方式作用于癌細胞，因此增強癌細胞的運動性、侵襲性和轉移性[49]。此外，還有研究報道了ADSCs與人鱗狀細胞癌細胞的相互作用：在與ADSCs共培養(yǎng)時，鱗狀細胞癌細胞的侵襲行為顯著增加，使得腫瘤風險加大[50]。但目前在臨床應用中還未出現(xiàn)上訴副作用，在121例乳腺癌患者中僅有一例在細胞輔助脂肪移植后發(fā)現(xiàn)癌癥復發(fā)，低于該人群的預期復發(fā)率[51]。在一項針對8例脊髓損傷男性的臨床試驗中，在一次靜脈注射4億個自體ADSCs后沒有發(fā)現(xiàn)腫瘤發(fā)展的證據(jù)[52]?，F(xiàn)ADSCs治療惡性腫瘤仍存在爭議，針對COVID-19合并惡性腫瘤患者的ADSCs治療還需進一步研究。

7 展望

新冠肺炎疫情形勢仍較為嚴峻，最早在印度被發(fā)現(xiàn)的新冠病毒變異毒株德爾塔毒株已傳播到了74個國家，而且還在快速傳播。這一毒株不但傳染性強，感染者更易發(fā)展成重癥。面對重癥患者數(shù)量的激增，改善癥狀和多器官損傷修復尤為重要。ADSCs被認為是應用于再生治療的理想細胞，在于以微創(chuàng)的簡易的方式獲得，并且具有沿著中胚層、外胚層和內胚層譜系分化為成熟細胞的高潛力[53]。靜脈注射ADSCs可以有效地對全身多個器官的損傷進行修復，但在常規(guī)臨床應用之前，還有一些問題需要解決。完全了解調控它的潛在機制，例如，在未來的實驗對ADSCs更精準的標記，以便能夠實現(xiàn)靶向治療；此外還需更多的實驗研究其潛在的危險風險性。