復(fù)方芩蘭口服液長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)研究

賈 興，劉 欣，魏麗娟，耿志霞，瞿紅穎，宋婷婷，劉 靜，魏占勇，史萬玉

（1.河北遠(yuǎn)征藥業(yè)有限公司，石家莊050041；2.河北省獸藥工程技術(shù)研究中心，石家莊050041；3.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，保定071000）

復(fù)方芩藍(lán)口服液為純中藥制劑，由金銀花、黃芩、連翹、板藍(lán)根四味中藥組成，用于外感風(fēng)熱引起的發(fā)熱、咳嗽、咽痛［1-3］。為了考察復(fù)方芩蘭口服液臨床上長(zhǎng)時(shí)間應(yīng)用的安全性，對(duì)該制劑進(jìn)行了長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)研究［4］。本試驗(yàn)通過將復(fù)方芩蘭口服液在一定時(shí)間內(nèi)連續(xù)高劑量給試驗(yàn)動(dòng)物反復(fù)飲喂，觀察動(dòng)物出現(xiàn)損害的靶組織或靶器官及劑量效應(yīng)關(guān)系，并了解試驗(yàn)動(dòng)物對(duì)復(fù)方芩蘭口服液能夠耐受的劑量范圍，從而為評(píng)價(jià)復(fù)方芩蘭口服液能否安全應(yīng)用于臨床提供科學(xué)依據(jù)，以保證用藥安全。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 3周齡清潔級(jí)Wistar大鼠80只，雌雄各半，購自斯貝福（北京）生物科技有限公司（許可證號(hào)SCXK（京）2016-0002）。大鼠購入后觀察飼養(yǎng)一周，投入試驗(yàn)。

1.2 主要藥物及試劑 復(fù)方芩蘭口服液：河北遠(yuǎn)征藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的中試產(chǎn)品（每mL相當(dāng)于原生藥 1.25 g，批號(hào)：170701）。

天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶試劑盒（產(chǎn)品批號(hào)20161108）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶試劑盒（產(chǎn)品批號(hào)20161028）、肌酐試劑盒（產(chǎn)品批號(hào) 20161205）、血清白蛋白測(cè)定試劑盒（產(chǎn)品批號(hào)20161205）、總膽固醇測(cè)定試劑盒（產(chǎn)品批號(hào)20161108）、甘油三酯試劑盒（產(chǎn)品批號(hào)20161205）等購于南京建成生物技術(shù)有限公司，尿素氮試劑盒（產(chǎn)品批號(hào)201611125）、血糖測(cè)定試劑盒（產(chǎn)品批號(hào)20161125）等購于北京百智生物科技有限公司，總蛋白測(cè)定試劑盒（產(chǎn)品批號(hào)20161020）購自于美國Thermo公司。

1.3 主要儀器設(shè)備 BC-2800Vet獸用全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）；半自動(dòng)生化分析儀（荷蘭圖威技術(shù)有限公司）；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國 BioTek公司制造）；OLYMPUS生物顯微鏡（日本制造）；KD-202輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)（浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司）；電子天平，型號(hào)：Precisa 92SM-202A。

1.4 試驗(yàn)動(dòng)物及給藥方法選擇 為了全面評(píng)價(jià)受試藥物復(fù)方芩蘭口服液的長(zhǎng)期毒性，進(jìn)行為期4周飼喂試驗(yàn)（由于本制劑臨床擬推薦用藥期為5～7 d）；給藥方法理應(yīng)灌胃給藥，但考慮到長(zhǎng)達(dá)28 d的灌胃可能會(huì)造成大鼠食道及胃的損傷，也可能引起應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而影響試驗(yàn)結(jié)果；而經(jīng)前期的預(yù)試驗(yàn)得到復(fù)方芩蘭口服液在大鼠飲水中加到8%（即80 mL／L）時(shí)，不會(huì)影響大鼠飲水量，且此劑量能滿足長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)的劑量要求，故確定以飲水方式給藥，最大劑量定為80 mL／L（即擬推薦劑量的40倍）。

1.5 試驗(yàn)分組 體重（75±5）g Wistar大鼠80只，雌雄各半，隨機(jī)選擇分為4組（3個(gè)受試藥物不同劑量組與1個(gè)不用藥對(duì)照組），每組雌雄各10只。完成隨機(jī)分組后，對(duì)每組大鼠用結(jié)晶紫在不同部位進(jìn)行染色編號(hào)標(biāo)記。分籠飼養(yǎng)。

1.6 試驗(yàn)劑量及給藥方式 試驗(yàn)設(shè)置高、中、低三個(gè)劑量以及一個(gè)空白對(duì)照組，其中高劑量組為含8%復(fù)方芩蘭口服液的飲水（即80 mL／L為擬推薦用量的40倍）；中劑量組為含4%復(fù)方芩蘭口服液的飲水（即40 mL／L為擬推薦用量的20倍）；低劑量組為含2%復(fù)方芩蘭口服液的飲水（即20 mL／L為擬推薦用量的10倍）。動(dòng)物分籠飼養(yǎng)，將受試藥物混勻于飲水中，連續(xù)飲用28 d，采食不限。

2 觀察指標(biāo)與測(cè)定方法

2.1 臨床表現(xiàn) 每天觀察各組大鼠的活動(dòng)、采食、飲水及發(fā)病情況。包括被毛是否貼身或稀疏豎散，是否神態(tài)萎靡、蜷縮不動(dòng)、過度興奮、躁動(dòng)驚跳、肌肉麻痹或震顫、步態(tài)異常。出現(xiàn)中毒反應(yīng)的大鼠取出單籠飼養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)死亡或?yàn)l死大鼠及時(shí)剖檢。

2.2 體重、采食情況測(cè)定 分別于給藥后的7、14、21和28 d對(duì)各組大鼠進(jìn)行稱重，比較其體重變化情況；每天記錄各組的飼料添加量，于給藥后的第7、14、21、28 d 測(cè)定各組的飼料剩余量，計(jì)算各組每周大鼠的平均采食量。

2.3 血液理化指標(biāo)測(cè)定 于給藥28 d后，每組20只大鼠（雌雄各半）摘眼球采血，用血液細(xì)胞分析儀測(cè)定白細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白含量測(cè)定。分離血清，用試劑盒測(cè)定AST、ALT、BUN、CRE、ALB、TP、CHOL、GLU、TG 等血液生化指標(biāo)。

2.4 臟器指數(shù)測(cè)定 上述于28 d后摘除眼球取血的大鼠，取血后剖檢，稱量心、肝、脾、腎、肺的重量，計(jì)算各臟器指數(shù)。稱量前用濾紙吸干表面水分。臟器指數(shù) ＝臟器濕重（g） ／體重（g） ×100。

2.5 主要臟器剖檢與組織學(xué)檢查 將對(duì)照組和高劑量組的試驗(yàn)大鼠及剖檢異常的試驗(yàn)大鼠進(jìn)行詳細(xì)檢查，其它劑量組的試驗(yàn)大鼠同時(shí)取材保存，當(dāng)高劑量組檢查有異常病變時(shí)再進(jìn)行檢查。受檢的臟器為：心、肝、脾、肺、腎、胃、小腸、大腸、卵巢、睪丸。

2.6 數(shù)據(jù)處理 用SPSS 19.0進(jìn)行單因素方差分析，采用多個(gè)試驗(yàn)組和一個(gè)對(duì)照組間的兩兩比較方法統(tǒng)計(jì)。

3 結(jié)果與分析

3.1 各組大鼠臨床表現(xiàn)觀察 在整個(gè)試驗(yàn)過程觀察并記錄高、中、低劑量試驗(yàn)組和對(duì)照組大鼠的毛色潔凈度，四肢、眼和瞳孔、攝食、飲水，糞便以及皮膚有無過敏反應(yīng)。結(jié)果均未見異常。

3.2 復(fù)方芩蘭口服液對(duì)大鼠體重的影響 由表1結(jié)果可以看出，試驗(yàn)開始時(shí)各試驗(yàn)組間大鼠的體重均無顯著差異（P ＞0.05），連續(xù)用藥后的 7、14、21和28 d，復(fù)方芩蘭口服液高、中、低劑量組大鼠的體重與對(duì)照組間也均無顯著差異（P＞0.05），表明以擬推薦劑量的40倍（80 mL／L）連續(xù)給藥4周，對(duì)大鼠的體重?zé)o明顯影響。

表1 復(fù)方芩蘭口服液對(duì)各組大鼠體重的影響（SD）Tab 1 The effect of Fufang Qilan Oral Liquid on body weight of rats in each group（SD）

表1 復(fù)方芩蘭口服液對(duì)各組大鼠體重的影響（SD）Tab 1 The effect of Fufang Qilan Oral Liquid on body weight of rats in each group（SD）

注：同一列標(biāo)記不同小寫字母代表差異顯著（P＜0.05）；無不同字母代表差異不顯著（P＞0.05）Note：Different lowercase letters in the same columnindicated that the difference was significant（P ＜0.05）； No different letters indicated that the difference was not significant（P ＞0.05）.

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3.3 復(fù)方芩蘭口服液對(duì)大鼠采食量的影響 由表2結(jié)果可以看出，各受試藥物組和不用藥對(duì)照組大鼠的每周平均采食量基本一致，無差異。表明復(fù)方芩蘭口服液對(duì)大鼠的采食量無明顯影響。

表2 復(fù)方芩蘭口服液對(duì)各組大鼠采食量的影響Tab 2 The effect of Fufang Qilan Oral Liquid on feed intake of rats in each group

3.4 復(fù)方芩蘭口服液對(duì)大鼠主要臟器指數(shù)的影響由表3結(jié)果可以看出，復(fù)方芩蘭口服液高、中、低劑量組大鼠的肝指數(shù)、脾指數(shù)、腎指數(shù)、心指數(shù)和肺指數(shù)均與不用藥對(duì)照組無顯著差異（P＞0.05），受試藥物以擬推薦劑量的40倍（80 mL／L）連續(xù)給藥4周，未見對(duì)大鼠的主要臟器指數(shù)造成明顯影響。

表3 復(fù)方芩蘭口服液對(duì)大鼠主要臟器指數(shù)的影響結(jié)果（SD）Tab 3 The effect of Fufang Qilan Oral Liquid on the main organ index of rats （SD）

表3 復(fù)方芩蘭口服液對(duì)大鼠主要臟器指數(shù)的影響結(jié)果（SD）Tab 3 The effect of Fufang Qilan Oral Liquid on the main organ index of rats （SD）

注：同一行標(biāo)記不同小寫字母代表差異顯著（P＜0.05）；無不同字母代表差異不顯著（P＞0.05）。Note： Different lowercase letters in the same columnindicated that the difference was significant（P ＜0.05）； No different letters indicated that the difference was not significant（P ＞0.05）.

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3.5 試驗(yàn)大鼠血液常規(guī)指標(biāo)結(jié)果 由表4結(jié)果可以看出，復(fù)方芩蘭口服液高、中、低劑量組大鼠的紅細(xì)胞總數(shù)、白細(xì)胞總數(shù)、血紅蛋白、淋巴細(xì)胞百分率、單核細(xì)胞百分率、嗜中性粒細(xì)胞百分率、嗜酸性粒細(xì)胞百分率和嗜堿性

粒細(xì)胞百分率均與不用藥對(duì)照組無顯著差異（P ＞0.05），表明以擬推薦劑量的40 倍（80 mL／L）連續(xù)給藥4周，對(duì)大鼠的血常規(guī)無明顯影響。

表4 復(fù)方芩蘭口服液對(duì)大鼠血液常規(guī)指標(biāo)的影響結(jié)果（SD）Tab 4 The effect of Fufang Qilan Oral Liquid on blood routine indexes of rats

表4 復(fù)方芩蘭口服液對(duì)大鼠血液常規(guī)指標(biāo)的影響結(jié)果（SD）Tab 4 The effect of Fufang Qilan Oral Liquid on blood routine indexes of rats

注：同一行標(biāo)記不同小寫字母代表差異顯著（P＜0.05）；無不同字母代表差異不顯著（P＞0.05）。Note： Different lowercase letters in the same columnindicated that the difference was significant（P ＜0.05）； No different letters indicated that the difference was not significant（P ＞0.05）.

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3.6 試驗(yàn)動(dòng)物血液生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果 由表5可以看出，復(fù)方芩蘭口服液高、中、低劑量組大鼠的門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、尿素氮（BUN）、肌酐（CRE）、血清白蛋白（ALB）、總蛋白（TP）、總膽固醇（CHOL）、血糖（GLU）和甘油三酯（TG）均與不用藥對(duì)照組無顯著差異（P＞0.05），表明以臨床推薦劑量的40倍（80 mL／L）連續(xù)給藥4周，對(duì)大鼠的血常規(guī)無明顯不良影響。

表5 復(fù)方芩蘭口服液對(duì)大鼠血液生化指標(biāo)的影響結(jié)果（SD）Tab 5 The effect of Fufang Qilan Oral Liquid on blood biochemical parameters of rats

表5 復(fù)方芩蘭口服液對(duì)大鼠血液生化指標(biāo)的影響結(jié)果（SD）Tab 5 The effect of Fufang Qilan Oral Liquid on blood biochemical parameters of rats

注：AST：門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；ALT：丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；BUN：尿素氮；CRE：肌酐；ALB：血清白蛋白；TP總蛋白、CHOL總膽固醇；GLU：血糖；TG：甘油三酯。同一行標(biāo)記不同小寫字母代表差異顯著（P＜0.05）；無不同字母代表差異不顯著（P＞0.05）。Note： AST： Aspartate aminotransferase； ALT： Alanine aminotransferase； BUN： Urea nitrogen； CRE： Creatinine； ALB： Serum albumin； TP： Total protein； CHOL： Total cholesterol； GLU： Blood glucose； TG：Triglyceride.Different lowercase letters in the same columnindicated that the difference was significant（P ＜0.05）； No different letters indicated that the difference was not significant（P ＞0.05）

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3.7 試驗(yàn)大鼠病理組織學(xué)檢查結(jié)果 試驗(yàn)結(jié)束后對(duì)各組大鼠進(jìn)行捕殺剖檢，肉眼進(jìn)行病理學(xué)觀察。主要觀察心、肝、脾、肺、腎等主要臟器的外形、體積、色澤是否正常，有無充血、出血、腫脹和壞死等異?，F(xiàn)象。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各用藥組與對(duì)照組大鼠的心、肝、脾、肺、腎等主要臟器均未見任何異常。

取高劑量組和對(duì)照組大鼠的心、肝、脾、肺、腎、胃、小腸、卵巢、睪丸等臟器以福爾馬林固定，石臘切片，鏡檢各臟器的組織學(xué)結(jié)構(gòu)變化（圖1～圖2）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高劑量組與對(duì)照組大鼠的心、肝、脾、肺、腎、胃、小腸、卵巢及睪丸組織學(xué)結(jié)構(gòu)清楚，未見明顯異常。

結(jié)果表明，受試藥物以擬推薦劑量的40倍（80 mL／L）連續(xù)給藥4周，未見對(duì)大鼠主要臟器外觀形態(tài)及組織結(jié)構(gòu)造成明顯影響。

圖1 大鼠主要臟器組織病理學(xué)（40×）Fig 1 The main organs of rats histopathology（40×）

圖2 大鼠主要臟器組織病理學(xué)（40×）Fig 2 The main organs of rats histopathology（40×）

4 討論與結(jié)論

中獸醫(yī)認(rèn)為傳染病為瘟病，病邪自口鼻而入，不在腑臟外，不在經(jīng)絡(luò)舍，于夾脊之內(nèi)。肺為嬌臟，易感風(fēng)邪，易受六淫侵犯，繼而感受多種疫病而發(fā)?。?］。雞傳染性喉氣管炎是由瘟疫之毒犯肺引起的一種肺熱咳喘之癥［5-6］。復(fù)方芩藍(lán)口服液四種藥材合用，共奏清熱解毒、宣肺平喘、利咽消腫之功效，用于多種原因引起的發(fā)熱、咳嗽、咽喉腫痛的防治。根據(jù)獸藥研究技術(shù)指導(dǎo)原則［7］，探究了復(fù)方芩藍(lán)口服液的安全性。

長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)即反復(fù)給藥的毒性試驗(yàn)，在實(shí)驗(yàn)過程中需要觀察動(dòng)物在反復(fù)給藥過程中的毒性反應(yīng)，了解藥物劑量與中毒程度的關(guān)系及毒性反應(yīng)的安全劑量。在藥物安全評(píng)價(jià)中，由于藥物作用的影響，常會(huì)引起動(dòng)物一些器官質(zhì)量的減低，根據(jù)臟器系數(shù)來檢驗(yàn)動(dòng)物的臟器是否受到藥物的不良影響［8］。本試驗(yàn)通過將復(fù)方芩蘭口服液在一定時(shí)間內(nèi)連續(xù)高劑量給試驗(yàn)動(dòng)物反復(fù)飲喂，觀察動(dòng)物出現(xiàn)損害的靶組織或靶器官及劑量效應(yīng)關(guān)系，了解試驗(yàn)動(dòng)物對(duì)復(fù)方芩蘭口服液能夠耐受的劑量范圍，從而為評(píng)價(jià)復(fù)方芩蘭口服液能否安全應(yīng)用于臨床提供科學(xué)依據(jù)，以保證用藥安全。

長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)結(jié)果表明，復(fù)方芩藍(lán)口服液以20、40、80 mL／L 劑量連續(xù)用藥 28 d，在觀察期內(nèi)未見大鼠有不良反應(yīng)，精神狀態(tài)良好、飲食正常，各劑量組對(duì)主要臟器的臟器指數(shù)未見明顯的影響，對(duì)試驗(yàn)大鼠心、肝、脾、肺、腎等主要臟器未見肉眼及組織學(xué)病理變化。

血液生理指標(biāo)是判定藥物毒性的重要指標(biāo)［9］，血液生化指標(biāo)判定了藥物對(duì)主要臟器毒性作用［10］。長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)結(jié)果表明，整個(gè)過程中受試藥物的三個(gè)劑量組的血液學(xué)常規(guī)、血液生化各項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定結(jié)果均與對(duì)照組無顯著差異（P＞0.05），受試藥物對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物大鼠未顯現(xiàn)任何毒性反應(yīng)，表明復(fù)方芩蘭口服液是安全、無毒性的中獸藥制劑，可以安全的用于臨床。