硫酸頭孢喹肟注射液在豬體內(nèi)的生物等效性研究

李龍飛，孔 梅，鄭 莉，陳 玲，馮言言，常 雪，崔 進(jìn)，吳連勇?

（1.齊魯動(dòng)物保健品有限公司，濟(jì)南250100；2.山東省獸藥質(zhì)量檢驗(yàn)所，濟(jì)南250022）

頭孢喹肟（cefquinome，CEF）又名頭孢喹諾、頭孢喹咪，是德國(guó)赫斯特公司（Hoechst）于20世紀(jì)80年代開(kāi)發(fā)的第一個(gè)第4代動(dòng)物專用頭孢類抗生素［1］，臨床應(yīng)用中常用其硫酸鹽。其抗菌譜廣，抗菌活性強(qiáng)，對(duì)臨床分離的大多數(shù)G＋菌、G-菌均有較強(qiáng)的抗菌活性。金黃色葡萄球菌、鏈球菌、埃希氏大腸桿菌、溶血性巴氏桿菌、胸膜肺炎放線桿菌等菌對(duì)其敏感性較高。由于頭孢母核的7位甲氧亞胺基-5-氨基噻唑取代基，其為抗菌活性的必須基團(tuán)，和第三代頭孢菌素不同的是其母核的3位有一個(gè)季銨鹽基團(tuán)，即頭孢喹肟是一個(gè)兩性離子，頭孢核帶負(fù)點(diǎn)荷，四價(jià)季銨離子基團(tuán)帶正電荷。這一結(jié)構(gòu)有助于頭孢喹肟快速穿透細(xì)胞膜，并決定了它對(duì)β-內(nèi)酰胺酶的親和力降低，且二者形成的復(fù)合物的穩(wěn)定性也降低，所以頭孢喹肟對(duì)β-內(nèi)酰胺酶高度穩(wěn)定，不易產(chǎn)生耐藥性和交叉耐藥性［2-3］。目前已被歐盟［4-6］批準(zhǔn)用于豬和牛的呼吸系統(tǒng)疾病、牛急性乳腺炎、牛蹄病、牛敗血癥、母豬子宮炎-乳腺炎-無(wú)乳綜合征、馬敗血癥和呼吸系統(tǒng)疾病等。7.5%的硫酸頭孢喹肟注射液，作為英國(guó)英特威（Intervet）公司于1994年研發(fā)的長(zhǎng)效注射液，具有半衰期長(zhǎng)、藥效持久的特點(diǎn)。鑒于其藥物作用范圍廣，毒性反應(yīng)小，國(guó)內(nèi)多為2.5%制劑，因此，市場(chǎng)應(yīng)用價(jià)值大。本研究采用長(zhǎng)效緩釋技術(shù)成功仿制了該產(chǎn)品。按照生物等效性試驗(yàn)相關(guān)規(guī)范要求，以豬為研究對(duì)象，按照農(nóng)業(yè)農(nóng)村部頒發(fā)的《獸用化學(xué)藥品生物等效性試驗(yàn)指導(dǎo)原則》的試驗(yàn)要求，對(duì)國(guó)產(chǎn)硫酸頭孢喹肟注射液在豬體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)特征研究，并與國(guó)外原研硫酸頭孢喹肟注射液進(jìn)行藥動(dòng)學(xué)參數(shù)比較及生物等效性分析，以期為國(guó)產(chǎn)硫酸頭孢喹肟注射的研制和臨床使用提供重要參考依據(jù)。

1 材 料

1.1 儀器 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：Waters Acquity UPLC，配電噴霧離子源，Waters公司；色譜柱：Waters BEH C18，100 ×2.1 mm，1.7 μm，Waters 公司；UPH-11-20T型優(yōu)普超純水制造系統(tǒng)：成都超純科技有限公司；HQ-60-Ⅱ型漩渦混合器：北方同正生物技術(shù)有限公司；MIKRO 22R型高速冷凍離心機(jī)：德國(guó)Hettich科學(xué)儀器公司；ES 225SMDR型分析天平：感量0.00001 g，瑞士 Precisa公司；可調(diào)微量移液器：1～10、20～200、100～1000 μL，熱電（上海）儀器有限公司；指形管（5 mL及1.5 mL），揚(yáng)子化工玻璃儀器有限公司。

1.2 藥品與試劑 硫酸頭孢喹肟注射液受試品（惠可寧?）：規(guī)格為 50 mL：3.75 g，生產(chǎn)批號(hào)：2310001，生產(chǎn)企業(yè)為齊魯動(dòng)物保健品有限公司有限公司。硫酸頭孢喹肟注射液參比品（克百特?）：規(guī)格為50 mL：3.75 g，生產(chǎn)批號(hào)：A173A01，有效期3年，生產(chǎn)商為默沙東制藥有限公司。硫酸頭孢喹肟標(biāo)準(zhǔn)品：純度不小于99%，購(gòu)自Dr.Ehrenstorfer.GmbH，Lot：40416。 甲醇、乙腈，均為色譜純，美國(guó)TEDIA公司；甲酸，質(zhì)譜純，德國(guó)CNW公司；正己烷，色譜純，德國(guó)CNW公司；超純水，由MiLi-Q超純水儀制取的超純水，符合GB／T 6682二級(jí)用水規(guī)定。

乙腈飽和的正己烷：取100 mL正己烷和50 mL于250 mL分液漏斗中，振搖1 min，靜置分層后，棄掉乙腈。

2 方 法

2.1 試驗(yàn)動(dòng)物 根據(jù)硫酸頭孢喹肟注射液生物等效性預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，計(jì)算硫酸頭孢喹肟正式試驗(yàn)所需動(dòng)物的樣本容量為18頭，為了保證試驗(yàn)結(jié)果的可靠性，選擇北京市海淀區(qū)蘇家坨周春生養(yǎng)殖場(chǎng)內(nèi)平均70日齡的20頭體重27.62±1.84 kg健康三元雜交豬，公母各半。試驗(yàn)地點(diǎn)為北京市海淀區(qū)蘇家坨周春生養(yǎng)殖場(chǎng)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物符合國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)普通級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物學(xué)、寄生蟲(chóng)學(xué)等等級(jí)要求，且在試驗(yàn)前1 d經(jīng)獸醫(yī)檢查確認(rèn)是處于良好的健康狀況下，試驗(yàn)前1個(gè)月內(nèi)未用過(guò)相關(guān)藥物治療。試驗(yàn)豬于實(shí)驗(yàn)前在新環(huán)境經(jīng)過(guò)至少1周的適應(yīng)期。給藥前禁食過(guò)夜12 h，自由飲水，給藥4 h后恢復(fù)正常飲食。飼料為不添加任何藥物的全價(jià)飼料，給藥前1 d統(tǒng)一用磅秤稱量體重。

2.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與給藥方案 20頭體重較一致的試驗(yàn)豬隨機(jī)分為2組，每組豬公母各半，采用雙處理、雙周期隨機(jī)交叉試驗(yàn)設(shè)計(jì)。第一周期第一組1～10號(hào)豬單劑量（3 mg／kg b.w.）肌內(nèi)注射克百特?（參比制劑），第二組11 ～20 號(hào)豬單劑量（3 mg／kg b.w.）肌內(nèi)注射惠可寧?（受試制劑）；第二周期第一組1～10 號(hào)豬單劑量（3 mg／kg b.w.）肌內(nèi)注射惠可寧?（受試制劑），第二組 11～20號(hào)豬單劑量（3 mg／kg b.w.）肌內(nèi)注射克百特?（參比制劑）。兩階段給藥間隔期為2周。

2.3 血樣采集 豬站立保定后經(jīng)前腔靜脈叢采血。給藥前采空白血，記為0 h，肌內(nèi)注射給藥后分別于0.167、0.333、0.5、0.75、1、2、3、4、8、12、24、36、48 h采血。每次采血量約4 mL。血樣采集后置于用肝素浸潤(rùn)并烘干的離心管內(nèi)，3800 r／min離心10 min，吸取上層血漿放在聚丙烯管中，密封，避光，-20℃短時(shí)保存待用。

2.4 色譜條件［4］色譜柱：Waters BEH C 18（100×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相：0.1% 甲酸水溶液：0.1%甲酸乙腈溶液，流速：0.3 mL／min；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：5 μL（表 1）。

2.5 質(zhì)譜條件［4］質(zhì)譜儀：Waters Wuattro Premier；離子源：電噴霧離子源；掃描方式：正離子掃描；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)；離子源溫度：120℃；脫溶劑溫度：380℃；毛細(xì)管電壓：3.0 kV；脫溶劑氣流速：700 L／h；Q1，Q3 均為單位分辨率（表2）。

表1 超高效液相色譜梯度洗脫條件Tab 1 Ultrahigh performance liquid chromatography gradient elution conditions

表2 定性定量離子對(duì)、錐孔電壓和碰撞能量Tab 2 Qualitative and quantitative ion pair，tapered hole voltage and collision energy

2.6 方法學(xué)實(shí)驗(yàn) 對(duì)硫酸頭孢喹肟標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行準(zhǔn)確度、精密度和穩(wěn)定性試驗(yàn)（儲(chǔ)備液穩(wěn)定性、室溫穩(wěn)定性、冰凍和凍融穩(wěn)定性），考察方法的合理性。

2.7 血漿樣品處理［4］將冷凍保存的豬血漿室溫下自然解凍，搖勻后精密移取200 μL血漿置于5 mL離心管中，混合渦旋10 s，加入800 μL乙腈去蛋白，混合渦旋2 min，4℃以下8 000 r／min離心10 min，把上層提取液轉(zhuǎn)移至另一5 mL離心管，加入400 μL乙腈飽和的正己烷，振蕩2 min，棄去正己烷，過(guò)0.2 μm 的濾膜，取 30 μL 進(jìn)樣供 UPLCMS／MS分析［4］。每批生物樣品測(cè)定時(shí)建立新的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并將每批生物樣品測(cè)定結(jié)果（峰面積）采用新建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出硫酸頭孢喹肟的含量。每批生物樣品測(cè)定時(shí)隨行測(cè)定低、中、高（50、500、1000 ng／mL）三個(gè)濃度的質(zhì)控樣品。質(zhì)控樣品測(cè)定結(jié)果的偏差小于20%。

2.8 數(shù)據(jù)分析 將實(shí)測(cè)血藥濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)采用WINNONLIN 6.3藥動(dòng)學(xué)分析軟件進(jìn)行非房室模型分析，計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，藥動(dòng)學(xué)參數(shù)根據(jù)中國(guó)藥科大學(xué)的楊勁老師編的《人體生物利用度數(shù)據(jù)處理通用程序，BAPP》軟件進(jìn)行生物等效性檢驗(yàn)。對(duì)參數(shù)Cmax與AUC0-τ（已進(jìn)行對(duì)數(shù)處理）進(jìn)行多因素方差分析、90%置信區(qū)間及雙單側(cè)t檢驗(yàn)，對(duì)受試品和參比品進(jìn)行生物學(xué)等效性比較。

3 結(jié)果與分析

3.1 方法學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 硫酸頭孢喹肟注射液的血漿藥物濃度在20.0 ～2000.0 ng／mL 范圍內(nèi)，血漿藥物濃度與峰面積比值呈良好的線性關(guān)系（相關(guān)系數(shù)≥0.99）。以峰面積為橫坐標(biāo)，血藥濃度為縱坐標(biāo)，典型的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y＝2.49136x-21.9872，r2＝0.996563。

3.1.2 準(zhǔn)確度和精密度 血漿中硫酸頭孢喹肟UPLC-MS／MS測(cè)定方法的結(jié)果表明，空白血漿添加樣品在50～1000 ng／mL范圍內(nèi)，批內(nèi)和批間系數(shù)分別小于8.23%和5.95%，精密度良好；空白血漿中硫酸頭孢喹肟添加濃度在50、500、1000 ng／mL時(shí)的平均回收率在99.42% ～100.31%，回收率穩(wěn)定（表3）。

表3 準(zhǔn)確度和精密度結(jié)果Tab 3 Accuracy and precision results

3.1.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 對(duì)于豬血漿中的硫酸頭孢喹肟而言，新鮮制備及制備后保存60 d的儲(chǔ)備液中待測(cè)藥物的響應(yīng)值的變異系數(shù)低于20%，依然保持穩(wěn)定，于-20℃條件下凍存時(shí)能夠保持穩(wěn)定21 d以上，在3個(gè)凍融循環(huán)之后仍可保持穩(wěn)定，于室溫條件（約22℃）下儲(chǔ)存時(shí)可保持穩(wěn)定達(dá)24 h。

3.2 豬單劑量肌內(nèi)注射硫酸頭孢喹肟受試品與參比品的實(shí)測(cè)血藥濃度及動(dòng)力學(xué)特征 豬單劑量（3 mg／kg b.w.）肌內(nèi)注射硫酸頭孢喹肟受試制劑和參比制劑后，不同時(shí)間測(cè)得的受試品和參比品對(duì)應(yīng)的平均血藥濃度-時(shí)間曲線見(jiàn)圖1。血藥濃度時(shí)間數(shù)據(jù)采用WINNONLIN 6.3版藥代參數(shù)計(jì)算軟件進(jìn)行非房室模型分析計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 兩種制劑主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)Tab 4 Major pharmacokinetic parameters of two formulations

圖1 兩種制劑平均血藥濃度-時(shí)間曲線Fig 1 Mean plasm concentration-time curves of two formulations

3.3 硫酸頭孢喹肟注射液注射液受試品和參比品的生物等效性結(jié)果 采用中國(guó)藥科大學(xué)的楊勁老師編的《人體生物利用度數(shù)據(jù)處理通用程序，BAPP》軟件進(jìn)行生物等效性檢驗(yàn)。釆用WINNONLIN 6.3藥動(dòng)學(xué)分析軟件對(duì)參數(shù)Cmax與AUC0-τ（已進(jìn)行對(duì)數(shù)處理）進(jìn)行多因素方差分析，每個(gè)參數(shù)在產(chǎn)品間、周期間以及個(gè)體間的差異均不顯著（P＞0.05），無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；對(duì)達(dá)峰時(shí)間（未進(jìn)行對(duì)數(shù)處理）應(yīng)用非參數(shù)檢驗(yàn)后，結(jié)果顯示兩組數(shù)據(jù)差異不顯著（P＞0.05），說(shuō)明兩種產(chǎn)品在豬體內(nèi)的達(dá)峰時(shí)間存在生物等效。受試產(chǎn)品參數(shù)AUC0-τ的對(duì)數(shù)平均值和參比產(chǎn)品參數(shù)AUC0-τ經(jīng)生物等效性分析后，90%置信區(qū)間為97.26% ～105.21%，介于參比產(chǎn)品80%～125%之間；受試產(chǎn)品參數(shù)Cmax的對(duì)數(shù)平均值和參比產(chǎn)品參數(shù)Cmax的對(duì)數(shù)平均值經(jīng)生物等效性分析后，90%置信區(qū)間為89.42% ～104.97%，介于參比產(chǎn)品70% ～143%之間［5］。綜上結(jié)果表明，國(guó)產(chǎn)自研硫酸頭孢喹肟注射液（惠可寧?）與默沙東制藥公司生產(chǎn)的注射液（克百特?）在豬體內(nèi)存在生物等效。

表5 生物等效性分析Tab 5 Bioequivalence analysis

4 討論與結(jié)論

肌內(nèi)注射受試產(chǎn)品和參比產(chǎn)品硫酸頭孢喹肟注射液后，受試產(chǎn)品與參比產(chǎn)品的主要藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)：藥 - 時(shí)曲線下面積 AUC0-τ、AUC0-∞、Cmax、Tmax數(shù)值接近，無(wú)顯著性差異。符合生物等效要求。相對(duì)于參比品，受試產(chǎn)品的相對(duì)生物利用度F為97.02%。

釆用 WINNONLIN 6.3軟件對(duì)參數(shù) Cmax與AUC0-τ（已進(jìn)行對(duì)數(shù)處理）進(jìn)行多因素方差分析，每個(gè)參數(shù)在產(chǎn)品間、周期間以及個(gè)體間的差異均不顯著（P ＞0.05），無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；（未進(jìn)行對(duì)數(shù)處理）應(yīng)用非參數(shù)檢驗(yàn)后，結(jié)果顯示兩組數(shù)據(jù)差異不顯著（P＞0.05），說(shuō)明兩種產(chǎn)品在豬體內(nèi)的達(dá)峰時(shí)間存在生物等效。依據(jù)制劑生物等效性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)［8］：供試制劑和參比制劑的 AUC對(duì)數(shù)比值的90%可信限在80%～125%置信區(qū)內(nèi)；供試制劑和參比制劑的Cmax對(duì)數(shù)比值的90%可信限在70%～143%置信區(qū)內(nèi)；供試制劑和參比制劑的AUC、Cmax的雙向單側(cè)t檢驗(yàn)均得到P＜0.05的結(jié)果，t1≥t1-α（υ）與 t2≥t1-α（υ）同時(shí)成立；Tmax經(jīng)非參數(shù)法檢驗(yàn)無(wú)差異，則供試品與參比制劑具有生物等效性。依據(jù)上述制劑生物等效性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)，表明受試品制劑和參比品制劑為生物等效制劑。

頭孢喹肟（cefquinome，CEF）作為第4代動(dòng)物專用頭孢類抗生素，其抗菌譜廣，抗菌活性強(qiáng)，對(duì)臨床分離的大多數(shù)G＋菌、G-菌均有較強(qiáng)的抗菌活性。金黃色葡萄球菌、鏈球菌、埃希氏大腸桿菌、溶血性巴氏桿菌、胸膜肺炎放線桿菌等菌對(duì)其敏感性較高。目前已被歐盟批準(zhǔn)用于豬和牛的呼吸系統(tǒng)疾病、牛乳腺炎、牛敗血病和馬呼吸系統(tǒng)疾病等多種嚴(yán)重感染的疾病。齊魯動(dòng)物保健品有限公司研制的7.5%的硫酸頭孢喹肟注射液，通過(guò)改變其劑型技術(shù)延長(zhǎng)了在動(dòng)物體內(nèi)作用時(shí)間，臨床藥效時(shí)間更持久，減少了給藥次數(shù)，為養(yǎng)殖戶帶來(lái)了更多選擇。

歐洲藥物委員會(huì)（EMEA）［6-9］報(bào)道，牛、豬、馬、羊、狗等動(dòng)物肌內(nèi)注射、皮下注射1 mg／kg b.w.的頭孢喹肟后，達(dá)峰時(shí)間Tmax介于0.5～2 h之間，達(dá)峰濃度在 2.5 ～3.8 μg／mL 之間，血漿蛋白結(jié)合率為5% ～15%。其半衰期較短，豬、牛、山羊分別為1～2、1～3、2 h。主要以原型經(jīng)腎隨尿液排出。劉利峰［10］等進(jìn)行了硫酸頭孢喹肟在豬體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究。 結(jié)果顯示，豬肌內(nèi)注射（2 mg／kg b.w.）的主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)消除半衰期（t1／2）為2.28±0.49 h，達(dá)峰時(shí)間（Tmax）為 0.80 ± 0.05 h，峰濃度（Cmax）為 2.44 ± 0.24 μg／mL；楊大偉［11］等進(jìn)行了頭孢喹肟注射液在豬體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)及生物利用度的研究，研究發(fā)現(xiàn)，豬頸部肌肉單劑量注射給藥后，消除半衰期（t1／2）為 2.76 h，達(dá)峰時(shí)間（Tmax）為0.32 h，峰濃度（Cmax）為 1.80 μg／mL。 本試驗(yàn)中，單劑量肌內(nèi)注射（3 mg／kg b.w.）硫酸頭孢喹肟注射液（7.5%）參比品后，參比品的平均消除半衰期（t1／2） 為 5.56 ± 0.42 h， 藥 時(shí) 曲 線 下 面 積（AUC0-τ）為 27.19 ± 2.19 μg·h／mL，達(dá)峰時(shí)間（Tmax）為（2.30 ±0.73） h，達(dá)峰濃度（Cmax）為（2.45±0.36） μg／mL。 單劑量肌內(nèi)注射硫酸頭孢喹肟受試品（7.5%）后，平均消除半衰期（t1／2）為（5.64±0.80） h，藥時(shí)曲線下面積（AUC0-τ）為 26.38 ±2.30 μg·h／mL，達(dá)峰時(shí)間（Tmax）為 2.25 ±0.55 h，達(dá)峰濃度（Cmax）為 2.37 ± 0.34 μg／mL，相對(duì)于參比品的平均相對(duì)生物利用度為97.02%。通過(guò)對(duì)比以上藥動(dòng)學(xué)研究結(jié)果表明，硫酸頭孢喹肟注射液（7.5%）與普通制劑相比，肌內(nèi)注射給藥后自注射部位吸收較迅速，半衰期時(shí)間明顯增長(zhǎng)，體內(nèi)消除較緩慢，36 h能檢測(cè)到血液中的藥物濃度，達(dá)到了長(zhǎng)效的目的，因此，本研究開(kāi)發(fā)的長(zhǎng)效硫酸頭孢喹肟制劑，對(duì)延長(zhǎng)該藥物在體內(nèi)的作用時(shí)間具有重要的臨床意義。

本次實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵守藥動(dòng)學(xué)試驗(yàn)要求規(guī)范展開(kāi)［12］，根據(jù)生物等效性分析標(biāo)準(zhǔn)，采用常用的雙單側(cè)t檢驗(yàn)和90%置信區(qū)間統(tǒng)計(jì)分析方法來(lái)評(píng)價(jià)和判斷藥物間的生物等效性，結(jié)果表明符合國(guó)內(nèi)仿制藥生物等效要求。對(duì)國(guó)產(chǎn)自研硫酸頭孢喹肟注射液（7.5%）肌內(nèi)注射給藥在豬的藥動(dòng)學(xué)特征研究，不僅對(duì)指導(dǎo)臨床合理用藥、新藥評(píng)價(jià)、個(gè)體化給藥及預(yù)測(cè)藥物在豬體內(nèi)的消除動(dòng)態(tài)、蓄積特性和殘留消除規(guī)律等具有重要的參考價(jià)值；同時(shí)藥動(dòng)學(xué)研究成果還可用于指導(dǎo)優(yōu)選給藥方案、新藥設(shè)計(jì)、改進(jìn)藥物劑型，對(duì)提供高效、長(zhǎng)效、低毒、低副作用的藥物制劑具有重要指導(dǎo)意義，為國(guó)產(chǎn)自研硫酸頭孢喹肟注射液（7.5%）的研制以及上市提供重要參考依據(jù)。