維甲酸/干擾素聯(lián)合誘導(dǎo)的細胞凋亡相關(guān)基因-19在惡性腫瘤中的研究進展

王瑞，陳斯泰

1泰州市人民醫(yī)院皮膚科，江蘇 泰州 225300

2大連醫(yī)科大學(xué)研究生院，遼寧 大連 116044

維甲酸/干擾素聯(lián)合誘導(dǎo)的細胞凋亡相關(guān)基因-19（gene associate with retinoid/interferon induced mortality-19，GRIM-19）是由干擾素、維甲酸聯(lián)合誘導(dǎo)表達的細胞凋亡調(diào)節(jié)基因，最早由Angell于2000年從β-干擾素和維甲酸誘導(dǎo)的細胞凋亡途徑中篩選分離出來[1]。研究表明，GRIM-19不僅通過與多種因子相互作用參與炎癥因子相關(guān)的病理生理過程，而且在腫瘤細胞凋亡、增殖、遷移和侵襲等方面發(fā)揮了重要作用[2]。本文就GRIM-19在惡性腫瘤中的研究進展進行綜述。

1 GRIM-19概述

細胞凋亡是抑制細胞增殖、維持組織內(nèi)環(huán)境平衡的重要生物學(xué)過程，多種細胞因子以多種形式參與誘導(dǎo)細胞凋亡。鑒于干擾素具有多效抗腫瘤作用，早在19世紀末期便被應(yīng)用于腫瘤的治療中；維甲酸在早期治療白血病等腫瘤性疾病和抑制異常細胞增殖的過程中也取得了較好的效果[3-4]。2000年，美國學(xué)者Angell所在團隊在探究干擾素及維甲酸誘導(dǎo)細胞死亡的分子生物學(xué)機制的過程中，發(fā)現(xiàn)干擾素和維甲酸聯(lián)合應(yīng)用可顯著抑制腫瘤細胞生長，因此該團隊通過反義基因敲除技術(shù)成功分離并鑒定了GRIM-19，在后續(xù)實驗中發(fā)現(xiàn)GRIM-19的反義表達可通過降低細胞內(nèi)GRIM-19蛋白水平而抑制干擾素及維甲酸聯(lián)合誘導(dǎo)的細胞凋亡，而上調(diào)GRIM-19的表達可使腫瘤細胞死亡，進一步證實了GRIM-19的促凋亡作用[1]。GRIM-19位于人19p13.2染色體上，含有552個堿基對，編碼16 kD的多肽，該多肽被認為是一種可促進細胞凋亡的核蛋白。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，GRIM-19是線粒體電子傳遞鏈復(fù)合物Ⅰ的關(guān)鍵組成部分之一，不僅能確保線粒體氧化磷酸化過程的完整性，還參與了線粒體相關(guān)的細胞凋亡過程[5]。當GRIM-19基因下調(diào)時，線粒體的產(chǎn)能供能效應(yīng)會受到影響，異常氧化應(yīng)激會導(dǎo)致腫瘤細胞異常增殖及侵襲，這在一定程度上解釋了上調(diào)GRIM-19對腫瘤具有抑制作用[6]。GRIM-19在真核生物中高度保守，其亞細胞定位主要在細胞質(zhì)線粒體中，在部分細胞的細胞核中也可發(fā)現(xiàn)GRIM-19，其在人體組織中的表達水平與線粒體豐度相關(guān)，因此其在人骨骼肌組織、心臟組織中的表達水平相對較高，而在胎盤、肝組織、腎組織中的表達水平相對較低[7]。GRIM-19不僅在自身免疫、先天免疫、胚胎發(fā)育、脂質(zhì)代謝、糖類代謝、細菌及病毒感染等多種生物學(xué)反應(yīng)中具有調(diào)節(jié)作用，還能通過多種方式抑制腫瘤細胞的增殖和生長。

2 GRIM-19促進細胞凋亡

信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transduction and activator of transcription 3，STAT3）是一種多結(jié)構(gòu)域蛋白，作為惡性腫瘤中組成性激活的重要轉(zhuǎn)錄因子之一，在細胞增殖、分化、存活和細胞因子誘導(dǎo)的信號反應(yīng)等生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要作用[8]。有學(xué)者通過酵母雙雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)GRIM-19對STAT3的活性具有負性調(diào)節(jié)作用，GRIM-19作用于STAT3的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，通過與該區(qū)域特異性結(jié)合，使STAT3及其下游基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯受到影響，以此相互作用抑制STAT3依賴性基因的表達。因此，GRIM-19被認為是STAT3的抑制劑，未來可能作為抗腫瘤治療的有效靶點[9]。此外，GRIM-19還能通過表皮生長因子抑制STAT3核轉(zhuǎn)位的興奮性，從而阻斷STAT3的復(fù)制及下游基因的表達。GRIM-19的促凋亡作用不僅受STAT3的影響，其組成活性還與細胞周期蛋白（cyclin）B1、轉(zhuǎn)錄因子 Dp-1（transcription factor Dp-1，TFDP1）、細胞生長促進因子（如cyclin D1、c-Myc）、基質(zhì)金屬蛋白酶家族的促轉(zhuǎn)移成員、髓細胞白血病因子1（myeloid cell leukemia 1，MCL1）、B細胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）等抗凋亡調(diào)節(jié)因子有關(guān)，上述因子均參與了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。GRIM-19還通過Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物（Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog，KRAS）、絲裂原活化的蛋白激酶激酶（mitogen-activated protein kinase kinase，MEK）、胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）等其他信號通路參與腫瘤的調(diào)控。

3 GRIM-19在惡性腫瘤中的研究

3.1 GRIM-19與胃癌

胃癌是全球第五大常見的惡性腫瘤，也是第三大常見的惡性腫瘤死亡原因[10]。Huang等[11]研究檢測了60例胃癌組織及癌旁正常組織中GRIM-19的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與癌旁正常組織相比，胃癌組織中GRIM-19mRNA表達水平顯著降低。免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中GRIM-19蛋白表達顯著降低，而在正常組織中GRIM-19表達水平較高，說明GRIM-19的表達與胃癌細胞的增殖潛能相關(guān)。GRIM-19缺失與侵襲性病理特征存在顯著關(guān)系，提示GRIM-19缺失與不良臨床結(jié)局有關(guān)，GRIM-19可能作為胃癌的預(yù)后標志物。應(yīng)用含GRIM-19片段的重組質(zhì)粒對胃癌細胞進行轉(zhuǎn)染，發(fā)現(xiàn)GRIM-19對胃癌細胞的增殖具有顯著的抑制作用，說明GRIM-19在胃癌中具有腫瘤抑制作用。Wang等[6]通過在線數(shù)據(jù)庫對胃癌組織中GRIM-19mRNA的表達水平進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與非腫瘤組織相比，原發(fā)性胃癌組織中GRIM-19mRNA表達顯著降低。在此基礎(chǔ)上，該團隊構(gòu)建體外實驗及動物模型，探究GRIM-19缺失對胃癌細胞遷移和侵襲能力的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GRIM-19缺失顯著增強了胃癌細胞的遷移和侵襲能力，GRIM-19表達下調(diào)對于遠處肺和肝轉(zhuǎn)移具有促進作用，GRIM-19表達缺失加速了胃癌的遠處轉(zhuǎn)移。當GRIM-19基因表達下調(diào)時，線粒體的產(chǎn)能供能效應(yīng)會受到影響，異常氧化應(yīng)激使線粒體內(nèi)活性氧含量增高，從而使腫瘤細胞增殖失控、侵襲性增強。使用抗氧化劑處理能夠顯著消除GRIM-19缺失驅(qū)動的細胞遷移和侵襲，這說明GRIM-19低表達導(dǎo)致的活性氧異常增多促進了胃癌的轉(zhuǎn)移。

3.2 GRIM-19與肺癌

Fan等[12]研究對16例肺鱗狀細胞癌、15例肺腺癌、10例小細胞肺癌及10例肺炎患者的肺部組織進行免疫組化染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GRIM-19在肺癌組織中的表達水平顯著低于肺炎組織，小細胞肺癌中GRIM-19的表達相較于肺鱗狀細胞癌及肺腺癌顯著缺失。在小細胞肺癌中，臨床分期越高，GRIM-19表達越低，說明GRIM-19在不同臨床分期的腫瘤中可能存在表達差異。另有研究者采用免疫組化法檢測67例非小細胞肺癌患者腫瘤組織及癌旁正常組織中GRIM-19的表達情況，結(jié)果顯示，腫瘤組織、癌旁正常組織中GRIM-19陽性表達率分別為53.7%、89.7%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；Ⅰ～Ⅱ期、Ⅲ～Ⅳ期非小細胞肺癌患者腫瘤組織中GRIM-19陽性表達率分別為65.1%、33.3%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）[13]。說明GRIM-19低表達與非小細胞肺癌的發(fā)生及臨床分期有關(guān)，GRIM-19的表達隨著非小細胞肺癌惡性程度的升高而下降。

3.3 GRIM-19與卵巢癌

卵巢癌是婦科三大惡性腫瘤之一，也是全球最常見的惡性腫瘤死亡原因之一，患者的5年生存率低于45%，其具有較高的復(fù)發(fā)性且易耐藥，因此，尋找有價值的預(yù)后標志物可為治療方案的制訂提供依據(jù)[14]。Ilelis等[15]通過對Ⅲ～Ⅳ期高級別漿液性卵巢癌（high-grade serous ovarian cancer，HGSOC）患者手術(shù)切除的腫瘤組織及癌旁正常組織進行免疫組化檢測，評估GRIM-19、核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）和核因子κB激酶抑制劑B亞基（inhibitor of nuclear factor kappa B kinase beta subunit，IKK2）的表達水平及與化療反應(yīng)的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IKK2、NF-κB表達與預(yù)后有關(guān)，是HGSOC鉑類化療反應(yīng)的潛在預(yù)測因子，GRIM-19是HGSOC預(yù)后和疾病復(fù)發(fā)的潛在預(yù)測因子，較高的GRIM-19表達水平與較低的復(fù)發(fā)率和較高的總生存率相關(guān)，在復(fù)發(fā)HGSOC中，GRIM-19高表達可能是良性預(yù)后的標志。Wang等[16]采用免疫熒光法檢測STAT3和GRIM-19在上皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancer，EOC）中的亞細胞定位，觀察到STAT3和GRIM-19主要位于細胞質(zhì)中，GRIM-19與線粒體存在明顯的共定位現(xiàn)象，少量的STAT3蛋白在細胞核中表達。采用免疫組化鏈霉抗生物素蛋白-過氧化物酶（streptavidin-perosidase，SP）法對不同卵巢組織中STAT3和GRIM-19的表達水平進行檢測，發(fā)現(xiàn)STAT3在卵巢惡性腫瘤、交界性腫瘤、良性腫瘤和正常卵巢中的表達依次遞減，而GRIM-19的表達依次遞增。GRIM-19的表達水平隨著疾病進展呈下降趨勢，STAT3則相反，GRIM-19在卵巢組織中的表達與STAT3呈負相關(guān)，GRIM-19低表達與疾病進展有關(guān)。

3.4 GRIM-19與肝癌

據(jù)統(tǒng)計，全球約半數(shù)的肝癌發(fā)生在中國[17]。流行病學(xué)調(diào)查顯示，到2025年，全球?qū)⒂谐^100萬人罹患肝癌[18]。Kong等[19]采用免疫組化法評估GRIM-19在肝癌組織和癌旁非腫瘤肝組織中的表達情況，同時用表達GRIM-19的慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞，通過半定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）和免疫印跡法檢測GRIM-19mRNA和GRIM-19蛋白的表達，采用噻唑藍法和流式細胞儀檢測細胞增殖情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GRIM-19蛋白在癌旁非腫瘤肝組織中高表達，在肝癌組織中低表達，GRIM-19低表達可促進腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移，GRIM-19表達上調(diào)對腫瘤具有抑制作用，GRIM-19在肝癌中的過表達能夠明顯抑制細胞周期，促進腫瘤細胞凋亡。另有學(xué)者通過構(gòu)建體內(nèi)外實驗?zāi)Ｐ蜋z測GRIM-19對肝癌細胞生長增殖能力的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GRIM-19對肝癌細胞具有明顯的抑制作用，且GRIM-19蛋白濃度越高，對肝癌細胞的生長抑制作用越強；給予不同濃度GRIM-19蛋白注射并對瘤重進行對比，發(fā)現(xiàn)GRIM-19蛋白處理組的瘤重與對照組相比顯著降低，GRIM-19對肝癌細胞的增殖具有抑制作用，這一結(jié)論證實了GRIM-19作為細胞凋亡基因能夠抑制肝癌生長，GRIM-19低表達能夠促進肝癌的增殖及轉(zhuǎn)移[20]。

3.5 GRIM-19與腎細胞癌

透明細胞腎細胞癌（clear cell renal cell carcinoma，ccRCC）占全部腎細胞癌的80%，在所有泌尿系統(tǒng)腫瘤中病死率最高[21]。Yan等[22]研究篩選了93例配對的ccRCC組織及癌旁正常組織，對38例成對手術(shù)組織進行液氮快速冷凍，采用實時定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR）和西方墨點法分析GRIM-19mRNA水平的變化情況，發(fā)現(xiàn)GRIM-19表達與腫瘤T分期和Fuhrman分級呈負相關(guān)。西方墨點法顯示，相對于癌旁正常組織，GRIM-19蛋白表達在相應(yīng)的腫瘤組織中普遍被抑制，GRIM-19蛋白表達與其mRNA呈正相關(guān)，且蛋白質(zhì)水平的下調(diào)與腫瘤分期和Fuhrman分級的增加有關(guān)。免疫組化染色顯示，GRIM-19在正常腎上皮細胞和腎小管、集合管上皮細胞中高表達，未觀察到其在腎小球細胞核著色，GRIM-19低表達與腫瘤分期和Fuhrman分級的增加均有關(guān)。該發(fā)現(xiàn)與qRT-PCR和西方墨點法的結(jié)果一致。

3.6 GRIM-19與結(jié)直腸癌

內(nèi)化NGR（internalizing Asn-Gly-Arg，iNGR）是一種腫瘤穿透肽，通過結(jié)合在腫瘤細胞上大量表達的細胞表面蛋白CD13將生物分子遞送至細胞。Pang等[23]構(gòu)建了iNGR-GRIM-19融合蛋白，并測試了其在體外培養(yǎng)的結(jié)直腸癌細胞和體內(nèi)異種移植裸鼠中的腫瘤靶向性和腫瘤抑制效果。該研究發(fā)現(xiàn)，iNGR-GRIM-19融合蛋白能夠抑制結(jié)直腸癌細胞遷移和侵襲，并促進結(jié)直腸癌細胞凋亡，該研究還表明GRIM-19過表達對腫瘤細胞的侵襲和遷移具有抑制作用。Zhang等[24]對比了不同類型結(jié)直腸癌細胞與正常結(jié)直腸上皮細胞中GRIM-19的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GRIM-19在結(jié)直腸癌細胞系中顯著下調(diào)。缺氧在腫瘤轉(zhuǎn)移和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中具有至關(guān)重要的作用，自噬是缺氧導(dǎo)致的應(yīng)激反應(yīng)之一。通過將腫瘤細胞置于缺氧環(huán)境下，并測定細胞活力，發(fā)現(xiàn)在缺氧刺激下，GRIM-19過表達可導(dǎo)致結(jié)直腸癌細胞的侵襲能力顯著降低，低氧誘導(dǎo)的自噬可被GRIM-19逆轉(zhuǎn)。缺氧誘導(dǎo)因子（hypoxia-inducible factor，HIF）-1α在腫瘤進展、治療抵抗、侵襲和轉(zhuǎn)移中具有重要作用，GRIM-19的過表達減弱了HIF-1α的積累[25-26]。GRIM-19能夠抑制STAT3的磷酸化和轉(zhuǎn)錄活性，從而阻斷STAT3信號通路。缺氧條件下，GRIM-19能夠抑制下游靶HIF-1α的激活，靶HIF-1α能夠抑制自噬，從而促進結(jié)直腸癌細胞的侵襲和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化?？傊珿RIM-19/HIF-1α/STAT3信號通路能夠抑制缺氧環(huán)境中的腫瘤侵襲和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，GRIM-19過表達為結(jié)直腸癌的治療提供了一種新的治療策略。

3.7 GRIM-19與前列腺癌

有研究者采用qRT-PCR和蛋白質(zhì)印跡法檢測前列腺癌組織和正常前列腺組織中微小RNA（microRNA，miRNA）-423-5p和GRIM-19的表達，發(fā)現(xiàn)miRNA-423-5p在人前列腺癌細胞中的表達水平顯著高于正常前列腺組織和前列腺上皮細胞，而GRIM-19在人前列腺癌細胞中的表達水平較低。進一步采用噻唑藍法、流式細胞儀檢測，發(fā)現(xiàn)GRIM-19是miRNA-423-5p的靶蛋白。miRNA-423-5p敲除破壞了二者間的反饋作用，導(dǎo)致GRIM-19表達上調(diào)，從而抑制腫瘤細胞的增殖并促進其凋亡[27]。

3.8 GRIM-19與皮膚鱗狀細胞癌（cutaneous squamous cell carcinoma，CSCC）

CSCC起源于表皮或附屬器的角質(zhì)形成細胞，是非黑色素瘤皮膚癌中發(fā)生率僅次于基底細胞癌的惡性皮膚腫瘤，多種通路在其侵襲性進展中發(fā)揮作用，GRIM-19與STAT3的相互作用可能是導(dǎo)致CSCC進展的原因。研究顯示，GRIM-19在正常皮膚組織中呈陽性表達，在高分化、中分化和低分化CSCC中表達逐漸減弱，STAT3在正常皮膚組織中不表達，隨著CSCC惡性程度的增加，其表達水平逐漸升高[28]。另有研究者采用攜帶GRIM-19的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染頭頸部CSCC細胞，發(fā)現(xiàn)上調(diào)GRIM-19的表達可以顯著抑制頭頸部CSCC細胞的增殖、侵襲及遷移[29]。有學(xué)者采用PCR和蛋白質(zhì)印跡法檢測了GRIM-19在CSCC細胞系中的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GRIM-19的轉(zhuǎn)錄及翻譯水平均較低。上調(diào)GRIM-19的表達對CSCC細胞的增殖和侵襲具有抑制作用，而敲除GRIM-19促進了腫瘤細胞的增殖和遷移。此外，GRIM-19的過表達不僅對STAT3的磷酸化和轉(zhuǎn)錄活性具有抑制作用，對STAT3靶基因的表達也存在負性調(diào)控，GRIM-19過表達能夠抑制與STAT3信號下調(diào)相關(guān)的CSCC的增殖和侵襲[30]。

4 小結(jié)與展望

GRIM-19低表達與多種惡性腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移有關(guān)，其在腫瘤的進展中具有重要作用。通過技術(shù)手段將外源性GRIM-19導(dǎo)入腫瘤細胞可抑制腫瘤細胞的侵襲及轉(zhuǎn)移，從而導(dǎo)致腫瘤細胞凋亡。因此，GRIM-19可能成為腫瘤的潛在治療靶點，以GRIM-19為基礎(chǔ)靶向治療腫瘤可能是未來的研究方向。然而，GRIM-19在信號通路中的作用、與其他凋亡基因的關(guān)系及相互作用、對相關(guān)因子的調(diào)控及缺失表達后的替代機制等仍需進一步研究。