毛蕊異黃酮對(duì)H2O2誘導(dǎo)的氧化損傷的星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖和凋亡的影響

許洋 吳成林 郭德華 張國(guó)福

1江西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院（南昌 330004）；2江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院創(chuàng)傷骨傷科（南昌 330006）

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）是指由于外傷或病理因素引起脊髓結(jié)構(gòu)與功能損害的神經(jīng)系統(tǒng)疾病［1］，通常導(dǎo)致感覺(jué)和運(yùn)動(dòng)功能障礙，嚴(yán)重者甚至癱瘓，其致殘率高，對(duì)患者的身心健康造成巨大傷害，并給家庭及社會(huì)帶來(lái)嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。盡管傳統(tǒng)的手術(shù)及藥物治療能一定程度上改善病情，但仍無(wú)法完全恢復(fù)脊髓功能，面對(duì)如此困境，尋求新的恢復(fù)脊髓功能的治療手段仍是當(dāng)代醫(yī)療的重大課題。

SCI分為原發(fā)性SCI和繼發(fā)性SCI，其中細(xì)胞凋亡、氧化損傷和炎癥反應(yīng)等是導(dǎo)致繼發(fā)性SCI的主要因素，其損傷程度遠(yuǎn)超原發(fā)性損傷［2-3］。研究發(fā)現(xiàn)，星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最豐富的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞之一，與脊髓神經(jīng)功能恢復(fù)的關(guān)系密切［4-5］。毛蕊異黃酮（Calycosin）是一種異黃酮植物雌激素，是從中藥黃芪中提取的有效活性成分之一［6］，具有抗氧化、抗炎癥以及抗腫瘤等作用［7］，并且毛蕊異黃酮可以通過(guò)促進(jìn)NF?κB通路介導(dǎo)的抗氧化途徑對(duì)腦損傷發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用［8］。據(jù)報(bào)道［9-10］，PI3K/Akt信號(hào)通路在SCI后脊髓功能恢復(fù)中起重要作用，并參與炎癥反應(yīng)、神經(jīng)膠質(zhì)瘢痕形成、細(xì)胞增殖和凋亡。而目前毛蕊異黃酮對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的影響及作用機(jī)制尚未明確，有待進(jìn)一步研究。筆者猜想毛蕊異黃酮可以通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生影響，故本研究將基于該通路探討毛蕊異黃酮苷對(duì)氧化損傷的星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖和凋亡的影響，并進(jìn)一步闡明其可能作用機(jī)制，進(jìn)而為治療脊髓損傷提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物SPF級(jí)新生24 h雌性SD乳鼠10只，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，飼養(yǎng)于江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技中心，飼養(yǎng)于潔凈環(huán)境中。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的處理嚴(yán)格依照國(guó)家對(duì)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的相關(guān)要求進(jìn)行。

1.2 細(xì)胞及培養(yǎng)將SD乳鼠，用75%的酒精泡3 min左右，將其俯臥于無(wú)菌操作臺(tái)中，剪開(kāi)其背部皮膚，鈍性分離背部肌肉，分離脊柱剖開(kāi)椎管取脊髓，體視鏡下去除包膜，剪碎組織，在0.25%胰蛋白酶中37℃中消化10～15 min左右后用完全培養(yǎng)基終止消化。用吸管輕柔吹散，過(guò)濾網(wǎng)，1 000 r/min離心5 min收集細(xì)胞，接種培養(yǎng)至培養(yǎng)瓶中，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)40 min后輕搖培養(yǎng)瓶，去除貼壁的成纖維收集未貼壁的細(xì)胞上液，1 000 r/min離心5 min收集細(xì)胞加入完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.3 主要試劑與儀器毛蕊異黃酮（上?；偕锟萍加邢薰荆?；PBS、CCK?8法細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司）；Rabbit Anti IL?6（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；Rabbit Anti p?AKT、Rabbit Anti gp130（安諾倫生物科技有限公司）；超高靈敏度化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品上海有限公司）；全自動(dòng)樣品快速研磨儀（上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司）；旋渦混合器（常州越新儀器制造有限公司）；全自動(dòng)酶標(biāo)（北京六一生物科技）；流式細(xì)胞儀（艾森生物杭州有限公司）。

1.4 毛蕊異黃酮濃度的篩選用不同濃度的毛蕊異黃酮（5、10、20 μmol/L）預(yù)處理星形膠質(zhì)細(xì)胞12 h，然后用100 μmol/L的H2O2處理24 h造成氧化損傷。用CCK8檢測(cè)各組細(xì)胞增殖情況篩選合適的毛蕊異黃酮處理濃度。

1.5 實(shí)驗(yàn)分組及給藥將實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、H2O2（100 μmol/L）模型組、H2O2（100 μmol/L）+毛蕊異黃酮（20 μmol/L）干預(yù)組，按照實(shí)驗(yàn)分組先用毛蕊異黃酮預(yù)處理24 h后進(jìn)行造模處理24 h，之后加抑制劑處理24 h后進(jìn)行CCK8檢測(cè)。

1.6 CCK8檢測(cè)將造模后的細(xì)胞換成新鮮培養(yǎng)基，每孔100 μL，每孔加入10 μL的CCK8試劑，置于培養(yǎng)箱中孵育2 h，酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)每孔的吸光值。

1.7 免疫熒光檢測(cè)在培養(yǎng)板中將已爬好細(xì)胞的培養(yǎng)皿用PBS浸洗3次，每次3 min；用4%的多聚甲醛固定15 min，PBS浸洗培養(yǎng)皿3次，每次3 min；0.5%Triton X?100（PBS配制）室溫通透20 min。PBS浸洗培養(yǎng)皿3次，每次5 min，移液槍吸干PBS，在培養(yǎng)皿內(nèi)滴加5% BSA，37℃封閉30 min。移液槍吸掉封閉液，不洗，培養(yǎng)皿內(nèi)滴加足夠量的稀釋好的一抗Brdu（1∶200），37℃孵育3 h。PBS浸洗培養(yǎng)皿3次，每次3 min，移液槍吸干培養(yǎng)皿內(nèi)多余液體后滴加稀釋好的熒光二抗Cy3（1∶200），37℃孵育45 min，PBS浸洗培養(yǎng)皿3次，每次3 min；注意：從加熒光二抗起，后面所有操作步驟都盡量在較暗處進(jìn)行。滴加DAPI避光孵育5 min，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行染核，用PBS沖洗多余的DAPI；用50%甘油封閉培養(yǎng)皿，然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

1.8 流式細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況收集1×106～3×106個(gè)細(xì)胞，加1 mL PBS 1 500 r/min離心3 min，洗兩遍，用雙蒸水將5×Binding Buffer稀釋為1×Binding Buffer，取300 μL預(yù)冷的1×Binding Buffer重懸細(xì)胞。每管各加入3 μL Annexin V?FITC和5 μL PI?PE。輕微混勻后，室溫避光孵育10 min。再向每管中加入200 μL預(yù)冷的1×Binding Buffer?；靹蚝笊狭魇郊?xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.9 Western blot法檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)取各組樣本獲取總蛋白，根據(jù)BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。蛋白變性，上樣，進(jìn)行十二烷基苯磺酸鈉凝膠電泳1～2 h，后濕法轉(zhuǎn)膜30～50 min。一抗溶液孵育，4℃過(guò)夜；二抗溶液中室溫孵育1～2 h。用ECL液顯色，Image J軟件觀察條帶灰度值并計(jì)算蛋白表達(dá)。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次以上，計(jì)量資料用（）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組之間比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 毛蕊異黃酮濃度的篩選H2O2顯著降低了細(xì)胞的增殖活力，在不同濃度毛蕊異黃酮干預(yù)下，各組星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖活力均增強(qiáng)，毛蕊異黃酮濃度在20 μmol/L時(shí)，星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖活力顯著增強(qiáng)（P<0.05），故選擇20 μmol/L繼續(xù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見(jiàn)圖1。

圖1 不同濃度的毛蕊異黃酮對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖的影響Fig.1 Effects of different concentrations of Calycosin on astrocytes proliferation

2.2 毛蕊異黃酮對(duì)氧化損傷的星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖的影響和對(duì)照組相比，在H2O2誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞氧化損傷24h后，星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖活力明顯下降（P<0.05），而毛蕊異黃酮能顯著增強(qiáng)星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖活力（P<0.05）。見(jiàn)圖2。

圖2 毛蕊異黃酮對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖的影響Fig.2 Effect of Calycosin on proliferation of astrocytes

Brdu免疫熒光結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，H2O2抑制了星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖（P<0.05），而毛蕊異黃酮能明顯增強(qiáng)星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖。見(jiàn)圖3。

圖3 Brdu免疫熒光檢測(cè)結(jié)果Fig.3 BrdU immunofluorescence test results

2.3 毛蕊異黃酮對(duì)氧化損傷的星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡的影響與對(duì)照組相比，H2O2組星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡率顯著上升，與H2O2組相比，毛蕊異黃酮組的星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡率顯著降低（P<0.05），明顯抑制了星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡。見(jiàn)圖4。

圖4 流式細(xì)胞術(shù)星形膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡率Fig.4 Apoptosis rate of astrocytes by flow cytometry

2.4 毛蕊異黃酮對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白的影響與對(duì)照組相比，H2O2組的GP130、IL?6、p?AKT的蛋白表達(dá)水平顯著增加（P<0.05），與H2O2組相比，毛蕊異黃酮能顯著抑制GP130、IL?6、p?AKT蛋白表達(dá)（P<0.05）。見(jiàn)表1及圖5。

圖5 毛蕊異黃酮對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的p?AKT、GP130、IL?6蛋白表達(dá)水平的影響Fig.5 Effects of Calycosin on the expression levels of p?Akt，gp130 and IL?6 proteins in astrocytes

表1 各組GP130、IL?6、p?AKT蛋白表達(dá)Tab.1 Expression of GP130，IL?6，p?AKT protein in each group ±s

表1 各組GP130、IL?6、p?AKT蛋白表達(dá)Tab.1 Expression of GP130，IL?6，p?AKT protein in each group ±s

注：*P<0.05，與Control組相比；#P<0.05，與H2O2組相比

組別Control H2O2 H2O2+calycosin F值P值GP130 0.133±0.010 1.268±0.221*0.351±0.087*#57.951<0.01 IL?6 0.448±0.195 1.565±0.286*0.491±0.370*#14.052<0.01 p?AKT 0.510±0.172 1.242±0.326*0.439±0.029*#12.995<0.01

3 討論

在脊髓損傷發(fā)生后，會(huì)產(chǎn)生一系列復(fù)雜的病理學(xué)反應(yīng)，對(duì)脊髓造成進(jìn)一步的繼發(fā)性損傷。盡管SCI的病因和發(fā)病機(jī)制仍有待充分了解，但多項(xiàng)研究證實(shí)神經(jīng)星形膠質(zhì)細(xì)胞在SCI的病理生理學(xué)中具有重要作用［11-13］，減輕星形膠質(zhì)細(xì)胞的氧化損傷是干預(yù)脊髓功能恢復(fù)的有效策略［14］。毛蕊異黃酮作為中藥黃芪中提取的有效活性成分之一，其抗氧化、抗炎和對(duì)神經(jīng)的保護(hù)作用顯著。但目前仍缺乏毛蕊異黃酮對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的作用及影響的研究，需要進(jìn)行更多的研究佐證。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)毛蕊異黃酮對(duì)氧化損傷的星形膠質(zhì)細(xì)胞的干預(yù)，分析其對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖和凋亡的影響，并探究其可能機(jī)制，為脊髓功能恢復(fù)尋求新的治療手段。

氧化應(yīng)激是由過(guò)氧化氫（H2O2）等活性氧（ROS）的積累引起的［15］，與SCI、腦缺血和神經(jīng)退行性疾病等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病因有關(guān)［16-17］，前期研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激會(huì)誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡，且實(shí)驗(yàn)中常用H2O2誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞氧化損傷建立模型［18-20］。本實(shí)驗(yàn)研究先通過(guò)不同濃度毛蕊異黃酮對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞干預(yù)，再使用H2O2誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞造成氧化損傷，結(jié)果發(fā)現(xiàn)H2O2降低了細(xì)胞的增殖活力，20 μmol/L的毛蕊異黃酮濃度顯著增強(qiáng)了細(xì)胞的增殖活力（P<0.05），故選用該濃度進(jìn)行后續(xù)研究。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示H2O2使星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡率升高，而毛蕊異黃酮顯著抑制了星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡，初步證明毛蕊異黃酮對(duì)氧化損傷的星形膠質(zhì)細(xì)胞具有保護(hù)作用，可以增強(qiáng)其增殖活力并抑制凋亡。

在星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡和增殖的機(jī)制研究中，PI3K/Akt信號(hào)通路一直是該研究的熱點(diǎn)。日本路邊青可以通過(guò)BDNF/PI3K/Akt/CREB途徑促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖，并抑制凋亡［21］；而Annexin?A1卻通過(guò)PI3K/AKT信號(hào)通路抑制了神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和遷移［22］，這表明PI3K/AKT信號(hào)通路在星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡和增殖機(jī)制中起重要作用。另一方面，研究證實(shí)毛蕊異黃酮可以通過(guò)PI3K/AKT信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞炎癥、凋亡與增殖產(chǎn)生作用［23-24］。在ZEGEYE等［25］的報(bào)道中證實(shí)IL?6可以激活PI3K/AKT信號(hào)通路，IL?6的主要β受體是GP130，其在星形膠質(zhì)細(xì)胞中也有表達(dá)，并且PI3K/AKT信號(hào)通路正是位于IL?6細(xì)胞因子共用信號(hào)傳導(dǎo)亞單位GP130下游的信號(hào)通路［26］。當(dāng)細(xì)胞損傷后，PI3K/Akt信號(hào)通路會(huì)被異常激活，其表達(dá)迅速升高，可磷酸化磷脂酰肌醇，生成磷酸化PI3K（p?PI3K），在p?PI3K的作用下又可引起AKT磷酸化，形成磷酸化AKT（p?AKT）。因此，磷酸化AKT（p?AKT）可作為衡量PI3K活性的指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示：氧化損傷的星形膠質(zhì)細(xì)胞GP130、IL?6、p?AKT等蛋白表達(dá)顯著高于正常星形膠質(zhì)細(xì)胞（P<0.05）；而毛蕊異黃酮能顯著下調(diào)H2O2誘導(dǎo)氧化損傷后GP130、IL?6、p?AKT蛋白的表達(dá)（P<0.05）。以上結(jié)果表明毛蕊異黃酮能有效抑制炎癥反應(yīng)，促進(jìn)H2O2誘導(dǎo)的氧化損傷的星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖并抑制其凋亡，其作用機(jī)制與抑制PI3K/Akt信號(hào)通路磷酸化有關(guān)。

綜上所述，毛蕊異黃酮可以通過(guò)抑制PI3K/Akt信號(hào)通路磷酸化促進(jìn)氧化損傷的星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖，并抑制其凋亡。本研究豐富了中藥（毛蕊異黃酮）對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞作用的研究，有一定參考意義。但在細(xì)胞凋亡與增殖過(guò)程中可能涉及到多條信號(hào)通路的參與，本實(shí)驗(yàn)中僅設(shè)計(jì)PI3K/Akt一條信號(hào)通路的研究，存在一定局限性，未來(lái)應(yīng)對(duì)其他相關(guān)信號(hào)通路進(jìn)行研究，不斷完善星形膠質(zhì)細(xì)胞具體機(jī)制的研究，為治療脊髓損傷提供新的臨床研究依據(jù)。