艾司氯胺酮復(fù)合咪達(dá)唑侖對(duì)老年髖關(guān)節(jié)置換術(shù)后譫妄的影響及對(duì)HT22細(xì)胞的作用

楊子健 黃銘穎 劉湘鈺 張新建，

1廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院（廣州 510405）；2廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院麻醉科（廣州 510378）

術(shù)后譫妄（post operative delirium，POD）是術(shù)后1～3 d出現(xiàn)的急性認(rèn)知功能障礙［1］，其導(dǎo)致的并發(fā)癥嚴(yán)重影響患者恢復(fù)及生存質(zhì)量，特別是老年人關(guān)節(jié)置換術(shù)后發(fā)病率高且目前尚無有效預(yù)防和治療措施［2］。文獻(xiàn)［3-4］顯示術(shù)前應(yīng)用亞劑量氯胺酮（ketamine，KE）或咪達(dá)唑侖（MI）可降低患者術(shù)后譫妄（POD）發(fā)生率。而艾司氯胺酮（ESKE）作為KE的旋光異構(gòu)體是否具有相似作用尚無臨床資料，本研究應(yīng)用亞劑量ESKE復(fù)合MI麻醉前給藥觀察髖關(guān)節(jié)置換術(shù)患者POD的發(fā)生率，并從細(xì)胞層面觀察ESKE復(fù)合MI對(duì)谷氨酸（G）誘導(dǎo)損傷的HT22細(xì)胞的作用并初步探討其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

1.1.1 研究對(duì)象來源研究經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批號(hào)：2020024）。選取2021年1-7月擬行髖關(guān)節(jié)置換術(shù)的120例年齡>65歲的患者，隨機(jī)分為C組（n=30）、MI組（n=30）、ESKE組（n=30）以及ESKE+MI組（n=30）。

1.1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn)納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）擇期行單側(cè)全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)；（2）未合并其他嚴(yán)重疾病；（3）ASA分級(jí)Ⅰ～Ⅲ級(jí)；（4）精神狀態(tài)正常。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）中途不愿繼續(xù)試驗(yàn)；（2）術(shù)中出現(xiàn)大出血等嚴(yán)重情況；（3）術(shù)中出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)。

1.1.3 細(xì)胞及材料HT22細(xì)胞購(gòu)自上海盈灣生物公司，艾司氯胺酮溶液購(gòu)于江蘇恒瑞公司、咪達(dá)唑侖注射液購(gòu)于江蘇恩華藥業(yè)公司、PBS、DMSO、G、凋亡檢測(cè)試劑盒、CCK?8細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒均購(gòu)于北京索萊寶公司，LC5090高效液相色譜儀。

1.2 亞劑量ESKE復(fù)合MI麻醉對(duì)POD發(fā)生率的觀察

1.2.1 麻醉方法常規(guī)監(jiān)測(cè)各項(xiàng)生命體征和麻醉深度。各組于麻醉誘導(dǎo)前10 min給藥且稀釋為10 mL，ESKE組靜注ESKE 0.2 mg/kg；MI組靜注0.02 mg/kg MI；ESKE+MI靜注ESKE 0.2 mg/kg和0.02 mg/kg MI混合液，C組給等量生理鹽水。麻醉誘導(dǎo)：長(zhǎng)托寧0.5 mg、舒芬太尼0.2 μg/kg、丙泊酚1.5 mg/kg、順式阿曲庫(kù)銨0.15 mg/kg。麻醉維持瑞芬太尼0.2～0.3 μg/（kg·min）、七氟烷吸入濃度1%～2%、丙泊酚4～10 mg/（kg·h），術(shù)中維持BIS 40～60。術(shù)畢應(yīng)用舒芬太尼2 μg/kg、托烷司瓊15 mg、酮咯酸氨丁三醇2.5 mg/kg用生理鹽水稀釋至100 mL自控鎮(zhèn)痛48 h，背景劑量2 mL/h，單次按壓泵注0.5 mL，鎖定時(shí)間15 min。

1.2.2 檢測(cè)指標(biāo)記錄麻醉前T0、插管時(shí)T1、手術(shù)開始時(shí)T2、手術(shù)結(jié)束時(shí)T3的平均動(dòng)脈壓、心率、腦電雙頻指數(shù)。各組患者術(shù)后24、48、72 h采用譫妄評(píng)定方法（CAM）量表判斷POD發(fā)生率。評(píng)分＜19不存在譫妄、評(píng)分20～22分為可疑譫妄、評(píng)分＞22為譫妄［5］，任一時(shí)間點(diǎn)CAM評(píng)分＞22即記為POD發(fā)生1人次，該患者評(píng)估結(jié)束。POD組患者于譫妄發(fā)生48 h內(nèi)，NPOD組于最后一次評(píng)估結(jié)束時(shí)取靜脈血4 mL，用液相質(zhì)譜儀檢測(cè)血清谷氨酸水平。

1.3 ESKE復(fù)合MI對(duì)G誘導(dǎo)HT22損傷細(xì)胞作用

1.3.1 ESKE組、MI濃度篩選及G造模篩選取各組細(xì)胞，細(xì)胞濃度調(diào)整后鋪板培養(yǎng)24 h，各組給予可達(dá)到實(shí)驗(yàn)濃度的ESKE（0、0.1、1、10、100、1 000 μmol/L）、MI（0、12.5、25、50 μmol/L）、G（0、2.5、5、10、20 mmol/L），12、24 h后進(jìn)行CCK?8檢測(cè)。重復(fù)3次取均值并計(jì)算篩選出ESKE、MI實(shí)驗(yàn)濃度和G造模濃度。

1.3.2 ESKE復(fù)合MI對(duì)G誘導(dǎo)損傷的HT22細(xì)胞OD值的影響將細(xì)胞分為NC組、G組、MIC組、ESKEC組、ESKEC+MIC組，24 h后除NC組外均加入20 mmol/L G造模，同時(shí)加入實(shí)驗(yàn)濃度的藥物（MI組：MI 12.5 μmol/L、ESKE組：ESKE 100 μmol/L、ESKEC+MIC組：MI 12.5 μmol/L+ESKE 100 μmol/L），NC組加等量培養(yǎng)液，12、24 h后進(jìn)行CCK?8檢測(cè)。

1.3.3 ESKE復(fù)合MI對(duì)G誘導(dǎo)損傷的HT22細(xì)胞凋亡和壞死的影響取各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，除NC組外均加入20 mmol/L G造模，同時(shí)各組相應(yīng)處理（MI組：MI 12.5 μmol/L、ESKE組：ESKE 100 μmol/L、ESKEC+MIC組：MI 12.5 μmol/L+ESKE 100 μmol/L），NC組加等量培養(yǎng)液，24 h后行流式凋亡檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用GraphPad Prism 8.0.2軟件分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以（）表示，組間比較采用單因素方差分析；計(jì)數(shù)資料用百分比（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料及麻醉藥用量比較各組患者一般資料和血流動(dòng)力學(xué)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），各組麻醉藥用量［丙泊酚（F=1.756 4，P=0.461 3）、舒芬太尼（F=0.557 4，P=0.365 3）、瑞芬太尼（F=0.791 3，P=0.675 3）、順式阿曲庫(kù)銨（F=0.491 0，P=0.489 0）］差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）。

表1 患者的一般資料比較Tab.1 Comparison of general data of patients ±s

表1 患者的一般資料比較Tab.1 Comparison of general data of patients ±s

一般資料年齡（歲）體質(zhì)量（kg）手術(shù)時(shí)間（min）MAP T0 T1 T2 T3 HR T0 T1 T2 T3 BIS C組70.90±4.75 62.88±8.389 89.43±22.22 94.77±10.25 81.40±9.78 79.63±10.12 85.43±9.78 84.03±7.68 70.33±6.54 64.13±7.23 66.70±8.78 48.20±2.20 MI組71.95±5.34 61.25±7.64 89.45±21.25 93.25±9.85 85.45±9.36 80.25±10.25 87.36±10.24 86.21±8.23 72.06±7.14 68.65±7.54 69.76±9.12 47.30±2.40 ESKE組71.53±5.24 61.03±7.21 88.55±20.16 93.55±10.21 85.24±9.67 82.76±10.11 82.52±10.02 83.93±8.65 74.50±8.12 72.17±7.98 70.93±9.34 47.40±3.00 ESKE+MI組70.07±5.15 60.40±9.27 87.07±19.86 95.57±10.17 90.23±9.98 85.00±10.05 84.73±9.89 84.66±7.98 74.76±7.90 73.14±9.23 73.00±8.68 48.60±2.70

2.2 各組患者POD發(fā)生率比較各組間POD發(fā)生率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；ESKE+MI組POD發(fā)生率低于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.954 1，P=0.004 2）。見表2。

表2 各組POD發(fā)生率的比較Tab.2 Comparison of postoperative delirium rate in each group例（%）

2.3 血清谷氨酸水平比較由表3可見，POD組血清G水平高于NPOD組（t=4.799，P=0.023 7）。見表3。

表3 POD與NPOD組血清G水平比較Tab.3 Comparison of serum glutamate levels between delirium and non?delirium groups ±s

表3 POD與NPOD組血清G水平比較Tab.3 Comparison of serum glutamate levels between delirium and non?delirium groups ±s

注：*P<0.05

組別POD NPOD例數(shù)28 92血清G水平（μmol/L）121.67±10.32 92.76±8.78 t值4.799 P值0.023 7

2.4 ESKE、MI的實(shí)驗(yàn)濃度以及G造模濃度通過濃度篩選實(shí)驗(yàn)，選ESKE 100 μmol/L、MI 12.5 μmol/L、G 20 mmol/L為實(shí)驗(yàn)濃度（圖1）。2.5 ESKE復(fù)合MI對(duì)G誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞OD值的影響在12 h和24 h G組OD值低于NC組（P<0.05），ESKEC和ESKEC+MIC組OD值高于G組（P<0.05，表4）。

圖1 ESKE、MI及G實(shí)驗(yàn)濃度篩選Fig.1 Screening results of experimental concentrations of esketamine，midazolam and glutamate

表4 ESKE復(fù)合MI對(duì)G誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞OD值的影響Tab.4 Effects of esketamine combined with midazolam on OD value of HT22 cells induced by glutamate ±s

表4 ESKE復(fù)合MI對(duì)G誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞OD值的影響Tab.4 Effects of esketamine combined with midazolam on OD value of HT22 cells induced by glutamate ±s

注：*表示G組和NC組相比，P<0.05；#表示實(shí)驗(yàn)組與G組相比，P<0.05

組別NC G MIC ESKEC ESKEC+MIC F值P值12 h各組OD值1.479 1±0.156 5 0.875 5±0.059 7*0.929 7±0.073 2 0.992 7±0.080 3#1.002 1±0.076 9#15.3310<0.05 24 h各組OD值1.791 3±0.098 7 1.291 6±0.052 8*1.314 1±0.064 1 1.415 3±0.093 3#1.412 8±0.094 1#21.2970<0.05

2.6 ESKE復(fù)合MI對(duì)G誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞凋亡和壞死的影響流式結(jié)果顯示，Q1壞死率G組高于NC組，MIC組、ESKEC組、ESKEC+MIC組均低于G組（P<0.05）；Q2+Q4凋亡率G組高于NC組，ESKEC組、ESKEC+MIC組低于G組（P<0.05），見圖2。

圖2 ESKE復(fù)合MI對(duì)G誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞壞死和凋亡的影響Fig.2 Effects of esketamine combined with midazolam on glutamate?induced necrosis and apoptosis of HT22 cells

3 討論

POD增加老年患者術(shù)后并發(fā)癥，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量［6］。全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)是治療難治性退行性疾病和終末期風(fēng)濕性病的重要手段［7］，但手術(shù)創(chuàng)傷大且術(shù)后POD發(fā)生率（4.0%～53.3%）高于其他擇期手術(shù)（3.6%～28.3%）［8］。研究［9］表明麻醉用藥與POD的發(fā)生密切相關(guān)，麻醉前應(yīng)用MI可降低POD發(fā)生率［10］；KE是同時(shí)具有鎮(zhèn)靜和鎮(zhèn)痛作用的麻醉藥，術(shù)前給予亞劑量KE可降低POD的發(fā)生率［11］。ESKE作為KE的旋光異構(gòu)體有KE鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛特點(diǎn)的同時(shí)具有麻醉期間快速抗抑郁等優(yōu)點(diǎn)且副作用少［12］，因此本研究術(shù)前應(yīng)用亞劑量ESKE復(fù)合MI觀察老年髖關(guān)節(jié)置換術(shù)后POD的發(fā)生率，以期找到臨床麻醉更加合理的用藥方式。ESKE對(duì)NMDA受體和阿片u受體的親和力是KE的2倍［13］，本研究在考慮患者年齡因素和KE亞麻醉劑量基礎(chǔ)上，ESKE采用0.2 mg/kg亞麻醉劑量［14］。POD確認(rèn)采用國(guó)內(nèi)外廣泛應(yīng)用于老年人POD輔助診斷的CAM量表評(píng)估法，其準(zhǔn)確性及可信度高［7］，患者術(shù)后72 h內(nèi)CAM評(píng)分>22即記為發(fā)生POD。研究結(jié)果表明：ESKE復(fù)合MI誘導(dǎo)前給藥可以降低老年患者POD發(fā)生率（P<0.05）；而單獨(dú)應(yīng)用ESKE或MI此效果不明顯（ESKE或MI與C組比較P>0.05）。有文獻(xiàn)［15-16］表明KE或MI單獨(dú)應(yīng)用均可降低POD發(fā)生率，與本研究結(jié)果不同的原因可能與手術(shù)類型、患者年齡、麻醉用藥以及ESKE與KE劑量等差異有關(guān)。

文獻(xiàn)表明圍術(shù)期不良刺激導(dǎo)致興奮性神經(jīng)遞質(zhì)G在組織內(nèi)含量增高誘發(fā)神經(jīng)細(xì)胞損傷可能是導(dǎo)致老年患者POD發(fā)生的因素之一［17-19］，而本研究發(fā)現(xiàn)POD組患者血清G水平高于NPOD組（P<0.05），這表明POD的發(fā)生可能與G的升高有關(guān)，因此本研究從細(xì)胞層面來探索麻醉藥的保護(hù)作用。HT22是小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞系，是研究神經(jīng)興奮性損傷的優(yōu)質(zhì)模型，因此本研究采用G誘導(dǎo)損傷的HT22細(xì)胞為研究對(duì)象來觀察ESKE復(fù)合MI對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的作用。NC組OD值顯著高于G組（P<0.05），說明造模成功；藥物處理過的ESKEC和ESKEC+MIC組OD值均高于G組（P<0.05），說明ESKE和ESKE復(fù)合MI可以減輕G對(duì)HT22細(xì)胞的損傷；流式結(jié)果中G組凋亡和壞死率高于NC組（P<0.05），說明G可以通過促進(jìn)凋亡和壞死來?yè)p傷HT22細(xì)胞；ESKEC和ESKEC+MIC組壞死和凋亡率低于G組（P<0.05），說明ESKE和ESKE復(fù)合MI可以減輕G誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞凋亡和壞死而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。ESKE復(fù)合MI減輕G對(duì)神經(jīng)細(xì)胞損傷的腦保護(hù)作用與ESKE復(fù)合MI誘導(dǎo)前給藥可降低老年患者POD發(fā)生率結(jié)果相吻合，據(jù)此筆者推測(cè)POD發(fā)生可能與此機(jī)制相關(guān)。減輕神經(jīng)細(xì)胞損傷的腦保護(hù)作用降低POD發(fā)生率的觀點(diǎn)與文獻(xiàn)報(bào)道基本相同，且POD患者血清中存在多種代謝途徑改變，其中包括G含量的升高［17-20］，因此本研究采用G處理的HT22細(xì)胞進(jìn)行神經(jīng)保護(hù)作用驗(yàn)證，但本課題尚需對(duì)圍術(shù)期腦內(nèi)G含量與POD之間的相關(guān)性進(jìn)行深入研究；實(shí)驗(yàn)中觀察ESKE對(duì)HT22細(xì)胞作用僅是為了驗(yàn)證神經(jīng)保護(hù)作用可能與POD發(fā)生率降低相關(guān)。

總之，亞劑量ESKE復(fù)合MI麻醉前給藥可降低髖關(guān)節(jié)置換術(shù)老年患者POD發(fā)生率；ESKE復(fù)合MI可通過減輕G引起的HT22細(xì)胞凋亡和壞死產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用，ESKE復(fù)合MI降低患者POD發(fā)生率可能與此機(jī)制相關(guān)。