基于外切酶驅(qū)動(dòng)策略構(gòu)建熒光減弱式T4 PNK免標(biāo)記傳感器

劉業(yè)玲，袁 琿，劉炳鑫，黃圣榮，周冰倩，李 霞，薛慶旺

(聊城大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，山東 聊城 252059)

0 引言

T4多核苷酸激酶(T4 PNK)是PNK家族的主要成員，屬于DNA修復(fù)酶，其功能是將三磷酸腺苷(ATP)的γ位轉(zhuǎn)移到核酸的5′-OH端，以催化核酸的磷酸化過(guò)程[1-3]。T4 PNK在DNA損傷修復(fù)和維持基因組穩(wěn)定性中起關(guān)鍵作用，許多研究證明：T4 PNK活性的異常與人類(lèi)多種惡性疾病密切有關(guān)[4-6]。因此T4 PNK活性的靈敏檢測(cè)對(duì)臨床診斷和疾病治療至關(guān)重要。

目前，對(duì)T4 PNK活性分析檢測(cè)傳統(tǒng)方式有放射性同位素32P標(biāo)記[7]，聚丙烯酰胺凝膠電泳[8]等方式，但這些檢測(cè)方法存在操作復(fù)雜，靈敏度低等不足的缺點(diǎn)。為此，具有更高靈敏度的電化學(xué)[9]、比色[10]、熒光[11]檢測(cè)方法陸續(xù)被開(kāi)發(fā)。其中，通過(guò)熒光發(fā)射強(qiáng)度為信號(hào)的熒光分析方法以其簡(jiǎn)單、快速、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)模式靈活而被科研工作者所青睞[12]。核酸探針基于它的堿基互補(bǔ)配對(duì)原則以及良好的生物相容性備受關(guān)注。在常用的熒光檢測(cè)體系中，大多數(shù)報(bào)道的信號(hào)輸出探針以熒光標(biāo)記型核酸探針為主[11,13]，但將熒光基團(tuán)共價(jià)鍵合到DNA末端的操作過(guò)程復(fù)雜，需要專(zhuān)業(yè)的技術(shù)人員合成并對(duì)其進(jìn)行復(fù)雜的HPLC純化流程，實(shí)驗(yàn)成本較高，因此限制了標(biāo)記型探針的廣泛應(yīng)用。為此，各種成本低廉的免標(biāo)記熒光探針被逐漸開(kāi)發(fā)。通過(guò)熒光染料分子如：硫黃素T(ThT)[14]、鋅卟啉(ZnPPIX)、SYBR Green Ι(SG Ι)[15]，其中，鑒于游離態(tài)SYBR Green Ι(SG Ι)熒光染料分子幾乎不產(chǎn)生熒光，并且對(duì)DNA序列沒(méi)有要求，當(dāng)與雙鏈DNA特異性結(jié)合后激活出強(qiáng)烈穩(wěn)定免標(biāo)記熒光信號(hào)，因此DNA-SG免標(biāo)記信號(hào)輸出探針逐漸引起研究人員的廣泛關(guān)注。雖然DNA-SG Ι復(fù)合物為低背景、免標(biāo)記熒光分析提供了新契機(jī)，但所涉及的基底探針以雙鏈DNA或發(fā)夾DNA為主，雙鏈部分處于未封閉狀態(tài)，即使在靶標(biāo)不存在情況，仍能產(chǎn)生較高的背景信號(hào)。因此構(gòu)建一種低背景的免標(biāo)記熒光方法，對(duì)于提高T4 PNK活性測(cè)定靈敏度具有重要意義。

在這里，我們提出了基于λ核酸外切酶驅(qū)動(dòng)熒光減弱式檢測(cè)T4 PNK活性的策略。首先，我們采用了兩種類(lèi)型的DNA探針sg和msg。二者可以雜交形成無(wú)任何標(biāo)記的雙鏈DNA(dsDNA)。在沒(méi)有T4 PNK的存在下，加入λ核酸外切酶(λexo)和核酸外切酶Ι(Exo Ι)之后不會(huì)對(duì)底物dsDNA產(chǎn)生影響，加入與dsDNA特定結(jié)合的熒光染料SG Ι后產(chǎn)生較強(qiáng)熒光；然而在靶標(biāo)T4 PNK存在的情況下，dsDNA的5′端由羥基變?yōu)榱姿峄鶊F(tuán)，而λexo催化dsDNA分子從5′-P末端進(jìn)行逐步的水解釋放出5′-單核苷酸。但不能降解5′-OH末端。之后加入Exo Ι 持續(xù)切割另一條單鏈sg，體系中的dsDNA減少，導(dǎo)致與熒光染料SG Ι鍵合位點(diǎn)減少，其熒光強(qiáng)度被大大減少。因此，可以利用熒光減弱的程度來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)T4 PNK的免標(biāo)記熒光檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)藥品

T4多核苷酸激酶、λ核酸外切酶、核酸外切酶Ι、三磷酸腺苷、RNase-free water、牛血清白蛋白(BSA)、SYBR Green Ι(SG Ι)、上樣緩沖液(Loading Buffer)、凝膠核酸染料Super Gelblue均購(gòu)買(mǎi)來(lái)自New England Biolabs公司(北京)。脫氧核苷酸溶液混合物(dNTPs)、三磷酸腺苷(ATP)和所有HPLC純化的寡核苷酸序列均由生工生物工程股份有限公司(上海，中國(guó))獲得；所涉及的寡核苷酸序列如下：具有5′-OH-TAA TAC GAC TCA CTA TA GGG TAA TTT CTA CTA AGT GTA GAT GAG AAG TCA TCT AAT AAG GCG-OH -3′的序列的DNA探針(表示為DNA-sg)；具有5′-OH-CGC CTT ATT AGA TGA CTT CTC ATC TAC ACT TAG TAG AAA TTA CCC TAT AGT GAG TCG TAT TA-OH-3′序列的引物探針(表示為DNA-msg)； 其他化學(xué)試劑(分析純)均購(gòu)自標(biāo)準(zhǔn)試劑提供商。實(shí)驗(yàn)中所用水均為高壓滅菌過(guò)的高純水(≥18.2 MΩ)

1.2 儀器

Milli-Q 超純水處理系統(tǒng)(美國(guó) Millipore)；立式壓力蒸汽滅菌器(LDZX-50KBS，上海申安醫(yī)療器械廠)；真空干燥箱(DZ-ZA型，天津市泰斯特儀器有限公司)；干式恒溫器(杭州奧盛儀器有限公司) ；凝膠成像儀(Bio-Rad，Gel Doc XR+，美國(guó))、電泳儀(DYY-6C型，北京六一儀器廠)。所有熒光強(qiáng)度的測(cè)量均使用F-7000熒光分光光度計(jì)(日本，日立)，激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)定為490 nm，發(fā)射波長(zhǎng)設(shè)定為510～650 nm，激發(fā)狹縫為5 nm，發(fā)射狹縫為10 nm，PMT檢測(cè)電壓為650 V。

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟

將兩種類(lèi)型的DNA探針sg和msg于37 ℃下在1X T4 PNK Buffer中孵育2 h形成dsDNA(濃度為2.1 μmol/L)。取5 μL dsDNA之后加入3 μL 10 mmol/L ATP和一定量的T4 PNK于37 ℃下在1X T4 PNK Buffer中孵育2 h。自然冷卻至室溫后，分別加入1 μL 5 Uλexo，1.5 μLλexo Buffer，0.5 μL 20 U Exo Ι和1.5 μL Exo Ι Buffer，在37 ℃下孵育2 h，80 ℃下反應(yīng)20 min對(duì)上述酶滅活。自然冷卻至室溫后加入10 μL SG Ι在37 ℃下避光反應(yīng)30 min。自然冷卻至室溫，加水稀釋到100 μL進(jìn)行熒光光譜表征。最后，用12%非變性聚丙烯酰胺(PAGE)凝膠電泳分析產(chǎn)物，其條件在1X TBE緩沖液(9 mmol/L Tris-HCl，pH 7.90，9 mmol/L H3BO3，0.2 mmol/L EDTA)，20 ℃、120 V恒定電壓下進(jìn)行。獲得的凝膠用Super Gelblue染色并使用凝膠成像儀拍攝。

1.4 實(shí)際樣品檢測(cè)

為評(píng)估所提出的方法在實(shí)際樣品中的應(yīng)用效果，對(duì)細(xì)胞裂解液樣品中的T4 PNK進(jìn)行了檢測(cè)分析。所用細(xì)胞裂解液為Hela細(xì)胞的裂解液。在分析之前，將細(xì)胞裂解液樣品稀釋1000倍，之后，往細(xì)胞裂解液樣本中分別加入一定量的T4 PNK進(jìn)行分析，分析步驟與上述過(guò)程相同。

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)基本原理

本文所提出的外切酶驅(qū)動(dòng)的熒光減弱式T4 PNK傳感器原理如圖1所示。在提出的檢測(cè)策略中，以?xún)煞N類(lèi)型的DNA探針(sg和msg)雜交形成無(wú)任何標(biāo)記的雙鏈DNA(dsDNA)作為基底探針單元。由于SG Ι在游離態(tài)或與單鏈DNA(ssDNA)鍵合時(shí)熒光信號(hào)非常弱，但當(dāng)它嵌入到雙鏈DNA時(shí)熒光信號(hào)顯著增強(qiáng)。當(dāng)T4 PNK不存在時(shí)，msg探針的5′-OH末端未被磷酸化保持完整的5′-OH末端。隨后加入的λexo和Exo Ι無(wú)法降解dsDNA。因此，當(dāng)加入與dsDNA結(jié)合的熒光染料SG Ι后產(chǎn)生較強(qiáng)熒光。相反，在靶標(biāo)T4 PNK存在的情況下，msg探針的5′末端被磷酸化，并產(chǎn)生具有λexo特定的識(shí)別位點(diǎn)-磷酸基團(tuán)。因此，λexo催化dsDNA分子從5′-P末端進(jìn)行逐步的水解釋放出5′-單核苷酸，后續(xù)加入的Exo Ι繼續(xù)降解單鏈DNA-sg，體系中的dsDNA減少導(dǎo)致與熒光染料SG Ι鍵合位點(diǎn)減少，其熒光強(qiáng)度被大大減弱。因此，利用熒光減弱的程度可實(shí)現(xiàn)對(duì)T4 PNK的免標(biāo)記熒光檢測(cè)。

圖1 基于外切酶驅(qū)動(dòng)的熒光減弱式T4 PNK傳感器原理圖

2.2 可行性驗(yàn)證

為驗(yàn)證本工作所提出的T4 PNK檢測(cè)策略的可行性，首先進(jìn)行了熒光光譜分析。如圖2所示，在T4 PNK不存在的情況下，系統(tǒng)顯示出非常強(qiáng)的熒光信號(hào)(圖2，曲線a)。這表明：λexo對(duì)5′-OH末端基團(tuán)不起作用，無(wú)法產(chǎn)生ssDNA，Exo Ι不消化dsDNA，dsDNA仍然保持完整，因此加入SG Ι后嵌入到dsDNA時(shí)熒光信號(hào)顯著增強(qiáng)。在T4 PNK存在的對(duì)照體系中，系統(tǒng)顯示出微弱的熒光信號(hào)(圖2，曲線b)。這是因?yàn)椋?′-OH末端被磷酸化，并產(chǎn)生具有λexo特定的識(shí)別位點(diǎn)-磷酸基團(tuán)。因此，λexo催化雙鏈DNA分子從5′-P末端進(jìn)行逐步的水解釋放出5′-單核苷酸，生成單鏈DNA-sg，加入的Exo Ι繼續(xù)降解單鏈DNA-sg，體系中的dsDNA減少導(dǎo)致與熒光染料SG Ι鍵合位點(diǎn)減少，其熒光強(qiáng)度被大大減弱。綜合上述結(jié)果表明，通過(guò)熒光光譜表征證明了本檢測(cè)方案具有良好的可行性。

圖2 不同條件下的熒光光譜驗(yàn)證所構(gòu)筑的T4 PNK傳感器的可行性(曲線a)在T4 PNK(10 U·mL-1)存在下；(曲線b)在沒(méi)有T4 PNK存在下；λexo，50 U·mL-1；Exo Ι，200 U·mL-1；SG I(10X)，10 μL

圖3 聚丙烯酰胺凝膠電泳表征圖

因此，為了進(jìn)一步驗(yàn)證所提出的基于外切酶驅(qū)動(dòng)的熒光減弱式傳感器的可行性，進(jìn)行了非變性PAGE實(shí)驗(yàn)。泳道1和泳道2分別對(duì)應(yīng)sg與msg，因此只有單一條帶作為參與反應(yīng)的初始鏈存在，二者可以通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則進(jìn)行雜交生成dsDNA(泳道3)，因sg與msg的雜交產(chǎn)物，分子量大于sg與msg單鏈，因此位置高于泳道1和泳道2，泳道3表明sg與msg成功雜交形成dsDNA分子量增加，因此出現(xiàn)一條位置靠上的新的條帶。在目標(biāo)T4 PNK存在時(shí)，dsDNA的5′-OH末端被磷酸化，產(chǎn)生具有λexo特定的識(shí)別位點(diǎn)-磷酸基團(tuán)，在λexo的作用下被識(shí)別降解，同時(shí)產(chǎn)生可被Exo Ι識(shí)別降解的DNA鏈，最后在Exo Ι作用下降解DNA單鏈，導(dǎo)致體系中的dsDNA被降解，條帶明顯變淺(泳道5、6)；而在沒(méi)有T4 PNK存在的情況下，dsDNA的5′-OH末端保持不變，λexo與Exo Ι無(wú)法進(jìn)行作用，dsDNA保持不變(泳道4)。非變性PAGE結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了所提出的基于外切酶驅(qū)動(dòng)的熒光減弱式傳感器是可行性。

2.3 條件優(yōu)化

磷酸化反應(yīng)時(shí)間和外切酶對(duì)磷酸化DNA的酶切效果會(huì)影響傳感系統(tǒng)的熒光強(qiáng)度。為探索該方法的最佳反應(yīng)條件，我們利用單因素變量法對(duì)λexo、Exo Ι和磷酸化反應(yīng)時(shí)間分別進(jìn)行了優(yōu)化。如圖4(a)所示，熒光強(qiáng)度的變化隨著λexo含量的增加，熒光強(qiáng)度不斷減弱。當(dāng)達(dá)到4 U時(shí)，熒光強(qiáng)度降至最低達(dá)到平臺(tái)。在平臺(tái)期，λexo的最佳用量記錄為4 U。如圖4(c)所示，隨著Exo Ι的不斷增加，熒光強(qiáng)度出現(xiàn)一個(gè)低谷，此時(shí)的Exo Ι用量為15 U。因此，將Exo Ι的最佳反應(yīng)用量選擇15 U。T4 PNK可以使dsDNA的5′端由羥基化變?yōu)榱姿峄?，T4 PNK與dsDNA作用時(shí)間的長(zhǎng)短決定體系中dsDNA磷酸化的程度。隨著T4 PNK與dsDNA的作用時(shí)間的延長(zhǎng)，熒光信號(hào)發(fā)生變化。當(dāng)T4 PNK與dsDNA的作用時(shí)間為40 min時(shí)，熒光減弱的程度最多。最終，選擇40 min作為最佳反應(yīng)時(shí)間(圖4(b))。因此根據(jù)圖4的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，最終選擇λexo的用量、Exo Ι的用量和磷酸化反應(yīng)時(shí)間分別為 4 U、15 U和40 min 作為反應(yīng)體系的最佳反應(yīng)條件。

圖4 (a)λexo用量變化對(duì)熒光強(qiáng)度的影響；(b)磷酸化反應(yīng)時(shí)間對(duì)熒光強(qiáng)度的影響；(c)Exo Ι用量變化對(duì)熒光強(qiáng)度的影響

2.4 傳感器的線性范圍分析

在上述最佳反應(yīng)條件下，我們?cè)u(píng)估了本工作提出的基于外切酶驅(qū)動(dòng)的熒光減弱式傳感器對(duì)T4PNK靈敏檢測(cè)的靈敏度。如圖5(a)和(b)所示，發(fā)現(xiàn)熒光強(qiáng)度與T4PNK的濃度在0.01～5.00U·mL-1的范圍內(nèi)線性良好，T4PNK濃度的線性函數(shù)為ΔF=3265.29×logC+5691.71(C為T(mén)4PNK的濃度；R2=0.99945),檢測(cè)下限為0.0173U·mL-1，所得的檢測(cè)限優(yōu)于和跟之前文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果相當(dāng)。

圖5 (a) 不同濃度的T4 PNK所對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度-波長(zhǎng)曲線，T4 PNK濃度由0～10 U·mL-1;(b) 熒光強(qiáng)度與T4 PNK濃度的線性范圍關(guān)系圖

表1 不同方法檢測(cè)T4 PNK酶活性的比較

2.5 傳感選擇性考察

為了評(píng)估T4 PNK傳感器的選擇性，在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，我們研究了滅活后的T4 PNK，牛血清白蛋白(BSA)、Klenow片段聚合酶(KFP)等幾種非特異性蛋白對(duì)體系的干擾。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示，在T4 PNK存在的情況下，熒光強(qiáng)度發(fā)生較明顯的降低。而在滅活后的T4 PNK存在時(shí)，熒光強(qiáng)度沒(méi)有明顯的下降，因?yàn)轶w系中dsDNA沒(méi)有磷酸化反應(yīng)的發(fā)生，無(wú)法觸發(fā)之后的切割反應(yīng)，導(dǎo)致體系中存在較多的dsDNA與SG Ι相互作用，發(fā)出強(qiáng)烈的熒光信號(hào)。同樣，在BSA和KFP存在時(shí)，也未檢測(cè)到明顯的熒光信號(hào)降低。這一結(jié)果表明該方法對(duì)T4 PNK檢測(cè)具有良好的選擇性。

圖6 基于所構(gòu)筑的T4 PNK傳感器選擇性考察(滅活T4 PNK、KFP、BSA、T4 PNK濃度均為10 U·mL-1)

2.6 實(shí)際樣品分析

為了證明該傳感方法在實(shí)際樣品測(cè)定中的應(yīng)用前景，對(duì)細(xì)胞裂解液樣品中的T4 PNK進(jìn)行了研究。結(jié)果表明回收率為104.7%，并且相應(yīng)的RSD值小于7.5%。因此，該方法在復(fù)雜的生物樣品中可以很好地工作，在實(shí)際樣品分析中具有很大的應(yīng)用潛力。

3 結(jié)論

開(kāi)發(fā)了一種新的基于外切酶驅(qū)動(dòng)的熒光減弱式傳感器對(duì)T4 PNK的靈敏檢測(cè)。在我們的策略中，利用λexo、Exo Ι的切割反應(yīng)，成功地建立了一種無(wú)標(biāo)記、靈敏的熒光測(cè)定T4 PNK活性的方法。該方案顯示出對(duì)T4 PNK檢測(cè)的良好分析性能，具有較高的靈敏度、特異性和可重復(fù)性。在最佳條件下，測(cè)得線性范圍在0.01～5.00 U·mL-1。并且與其他基于熒光的策略相比，所提出的方法具有以下的優(yōu)點(diǎn)：它不需要使用熒光染料或用熒光團(tuán)、淬滅劑對(duì)其標(biāo)記，使得DNA探針的設(shè)計(jì)具有成本效益且簡(jiǎn)單；并且該種方法具有普適性，對(duì)任何序列的DNA都適用。此策略為探測(cè)T4 PNK活動(dòng)提供了一種非常簡(jiǎn)便的方法，有望應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究。