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    驢源腸道乳酸細(xì)菌的篩選及生物學(xué)特性研究

    2022-11-19 07:02:04左立康王同浩董洪圣王長法馬青山
    關(guān)鍵詞:膽鹽球菌菌種

    左立康,黃 榮,羅 康,王同浩,董洪圣,王長法,馬青山

    (聊城大學(xué) 農(nóng)學(xué)院、山東省黑毛驢高效繁育與生態(tài)飼養(yǎng)工程技術(shù)研究中心、山東省驢產(chǎn)業(yè)科技協(xié)同創(chuàng)新中心,山東 聊城 252059)

    0 引言

    目前,我國畜牧業(yè)正處于“飼料禁抗”的關(guān)鍵時刻,對“替抗”、“減抗”相關(guān)技術(shù)和產(chǎn)品具有旺盛的需求。益生菌因其能夠促進(jìn)動物生長、提高飼料利用率[1],調(diào)節(jié)動物腸道菌群和免疫機(jī)能[2],預(yù)防腹瀉發(fā)生[3,4],且具有綠色、安全等方面特點,被認(rèn)為是畜禽飼料中極具潛力的促生長抗生素替代品。養(yǎng)殖中常用的益生菌菌種包括乳酸細(xì)菌、芽孢桿菌和酵母菌類等,其中以乳酸細(xì)菌為主。然而,實驗室篩得的菌種在養(yǎng)殖試驗驗證過程中,其功能往往不能較好的重現(xiàn),這主要是由于實驗室篩選益生菌的條件或許同其應(yīng)用的環(huán)境有所區(qū)別,從而使益生菌應(yīng)用后在靶位點難以生長、定植及發(fā)揮功能[5],因此,篩選來自同源動物的腸道土著益生菌種就顯得尤為重要。

    驢產(chǎn)業(yè)是我國的特色畜牧業(yè),也是關(guān)鍵的扶貧民生產(chǎn)業(yè),然而,在集約化養(yǎng)殖模式下腹瀉是影響犢驢駒成活率的主要因素之一,也已成為驢養(yǎng)殖業(yè)中的一大難點[6]。應(yīng)用抗生素僅對大腸桿菌引起的腹瀉有治療效果但對應(yīng)激源等因素引發(fā)的腹瀉效果不佳,且存在產(chǎn)生耐藥菌及二次感染的風(fēng)險[7],通過應(yīng)用益生菌制劑,尤其是乳酸菌制劑能夠減少應(yīng)用抗生素帶來的負(fù)面影響[8-10],但源自驢腸道的益生菌菌種資源還較為匱乏,制約了驢用益生菌制劑的開發(fā)和應(yīng)用。因此,本研究基于原位/宿主益生菌策略(Autochthonous/Host-associated probiotic)從健康驢腸道中篩選乳酸細(xì)菌,并對其生物特性進(jìn)行研究,為開發(fā)驢用微生態(tài)制劑提供候選菌種資源。

    1 材料與方法

    1.1 樣品來源及供試菌株

    試驗樣品來自山東省德州市禹城惠民驢場2歲德州驢直腸內(nèi)容物。試驗選用的指示菌株由聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)院分離并保存,2種供試菌株為金黃色葡萄球菌和大腸桿菌。

    1.2 主要培養(yǎng)基

    MRS液體培養(yǎng)基:蛋白胨10 g,牛肉粉8 g,葡萄糖20 g,酵母粉4 g,乙酸鈉5 g,磷酸氫二鉀2 g,硫酸鎂0.2 g,檸檬酸氫二銨2 g,硫酸錳0.04 g,蒸餾水1000 mL,121 ℃滅菌30 min;

    MRS固體培養(yǎng)基:在MRS液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入2%的瓊脂,121 ℃滅菌30 min。

    水解淀粉酶培養(yǎng)基:LB液體培養(yǎng)基1000 mL,可溶性淀粉2 g,瓊脂20 g。

    Tween-80培養(yǎng)基:蛋白胨1.0 g,酵母膏0.5 g,CaCl20.01 g,NaCl 0.5 g,Tween-80 1.0 g,瓊脂1.5~2.5 g。

    1.3 乳酸菌的分離與純化及形態(tài)觀察

    取1 g驢腸道內(nèi)容物樣品于離心管中,加入9 mL無菌蒸餾水,振蕩搖勻。10倍稀釋,稀釋梯度為10-1~10-8。取不同稀釋度稀釋液100 μL均勻涂布于MRS平板上,37 ℃培養(yǎng)24 h。挑取表面光滑、菌落凸起、四周平整、乳白色、菌落直徑1.0~1.5 mm的單菌落,分區(qū)劃線接種于MRS平板上。純化3代,獲得菌種加入30%甘油,-80 ℃冰箱保存。

    挑取純化培養(yǎng)24 h的單菌落涂片,革蘭氏染色觀察細(xì)菌形態(tài)特征,根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》選取革蘭染色為陽性、形態(tài)為桿狀或者球狀的菌株進(jìn)行后續(xù)研究。

    1.4 乳酸菌的分子生物學(xué)鑒定及安全性分析

    純化的菌種采用正向引物P1:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′,反向引物P2:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′,引物由上海立菲生物技術(shù)有限公司(北京)合成,進(jìn)行16S rDNA擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系:2× PCR mix 30 μL,引物各2.5 μL,菌液2 μL,ddH2O 23 μL。PCR程序為:95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 90 s,共30個循環(huán);最后72 ℃延伸10 min,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠(含有萬分之一濃度的SYBR?Green I)上電泳30 min,紫外燈下觀察,確定產(chǎn)物PCR成功并達(dá)到要求后,將PCR產(chǎn)物送交上海立菲生物技術(shù)有限公司(北京)進(jìn)行序列測定。測序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行同源性分析。

    將受試菌點接于哥倫比亞兔血瓊脂平板(青島,海博生物),置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24~48 h,觀察是否有溶血圈以及溶血圈類別。

    1.5 乳酸菌生長曲線與產(chǎn)酸能力測定

    生長曲線測定:將菌液在MRS液體培養(yǎng)基中按1%比例接種,37 ℃培養(yǎng),每2 h取樣一次,分光光度計測其OD600值,繪制生長曲線。

    產(chǎn)酸能力測定:將菌液在MRS肉湯中按1%比例接種,37 ℃培養(yǎng),每6 h取樣一次,通過pH儀測其pH值,繪制菌株產(chǎn)酸曲線。

    1.6 乳酸菌的產(chǎn)酶能力分析

    產(chǎn)淀粉酶試驗:將受試菌接種于水解淀粉酶培養(yǎng)基上,37 ℃過夜培養(yǎng)。滴加碘液,顯色,為防止光分解,5 min內(nèi)觀察。

    脂肪酶試驗:將受試菌接種于Tween-80培養(yǎng)基上,37 ℃過夜培養(yǎng),室溫再培養(yǎng)1~2天。觀察是否有沉淀圈。

    1.7 乳酸菌的耐受性研究

    耐酸性試驗:利用0.5 mol/L HCl溶液和0.1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)MRS液體培養(yǎng)基pH值,分別為2、3、4、5、6、7、8、9,121 ℃滅菌30 min后,按1%比例接入待測乳酸菌種子液,設(shè)置3個重復(fù)。37 ℃培養(yǎng)24 h,分光光度計測其OD600值。

    耐膽鹽性試驗:配制含豬膽鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.1%、0.2%、0.3%的MRS液體培養(yǎng)基,121 ℃滅菌30 min后,按1%比例接入待測乳酸菌種子液,設(shè)置3個重復(fù)。37 ℃培養(yǎng)24 h,分光光度計測其OD600值。

    1.8 乳酸菌的抑菌性試驗

    以實驗室保藏的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌為指示菌,采用國標(biāo)濾紙片法進(jìn)行乳酸菌的抑菌試驗[11]。指示菌為經(jīng)過37 ℃培養(yǎng)過夜培養(yǎng),與生理鹽水 1∶9稀釋,渦旋器混勻后涂布LB平板,加入載有待測乳酸菌的濾紙片。37 ℃培養(yǎng)24 h,觀察指示菌生長情況,游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑。

    2 結(jié)果

    2.1 形態(tài)特征及革蘭氏染色結(jié)果

    分離菌株在MRS平板上37 ℃培養(yǎng)24 h后,菌落呈不透明灰白色、表面光滑凸起、邊緣整齊、直徑1 mm左右大小的圓形(圖1)。革蘭氏染色陽性,顯微鏡鏡檢觀察菌株HR-03為圓形或橢圓形(圖2)。

    圖1 菌株HR-03在MRS平板上的菌落形態(tài)

    圖2 菌株HR-03革蘭氏染色結(jié)果

    2.2 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

    測序結(jié)果在NCBI Blast網(wǎng)站上進(jìn)行同源性比較,菌株HR-03同屎腸球菌同源性高于99%,結(jié)合進(jìn)化樹分析可知(圖3),菌株HR-03鑒定為屎腸球菌。

    圖3 通過16SrDNA核酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹

    2.3 分離菌的安全性試驗

    如圖4所示,點接分離的四株受試菌于兔血瓊脂平板上,37 ℃培養(yǎng)24 h,無溶血圈,菌株具有較好的安全性。

    圖4 分離菌在兔血瓊脂平板上產(chǎn)生溶血圈情況

    2.4 生長特性和產(chǎn)酸能力試驗結(jié)果

    如圖5、6所示,屎腸球菌HR-03在0~6 h迅速生長,6 h后進(jìn)入對數(shù)生長期,pH值迅速下降;12 h后進(jìn)入生長平緩期,pH值也逐步趨于穩(wěn)定,最終菌珠HR-03發(fā)酵上清液pH值為4.57。

    圖5 菌株HR-03的生長曲線

    2.5 乳酸菌的產(chǎn)酶能力分析

    將受試菌分別接種于水解淀粉培養(yǎng)基和Tween-80培養(yǎng)基上,37 ℃培養(yǎng)24 h,未觀察到透明圈和沉淀圈,菌株HR-03無產(chǎn)淀粉酶和脂肪酶能力。

    圖6 菌株HR-03的產(chǎn)酸曲線

    2.6 乳酸菌的耐受性研究

    2.6.1 耐酸性。由圖7可知,菌株HR-03在pH值為2~9的MRS肉湯中均能存活,其中在pH 6~7之間OD600值最高,表明屎腸球菌HR-03最適生長pH值為6~7。在pH值為2~5之間菌株HR-03的OD600值隨著pH值的降低而明顯下降,表明酸性環(huán)境對菌株HR-03的生長有抑制作用,但仍有細(xì)菌生長。由此可見,菌株HR-03具有較強的耐酸性能。

    圖7 不同pH值對菌株HR-03生長的影響

    2.6.2 耐膽鹽性。由圖8可知,屎腸球菌HR-03能夠耐受質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.10%的豬膽鹽,其OD600值也隨著膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而下降,表明高濃度的膽鹽對菌株HR-03的生長有抑制作用,當(dāng)膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.30%時,菌株的OD600值仍在0.7左右,由此可見,菌株HR-03具有良好的耐膽鹽能力。

    圖8 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)膽鹽對菌株HR-03生長的影響

    2.7 乳酸菌的抑菌試驗

    如圖9所示,屎腸球菌HR-03對大腸桿菌抑菌圈直徑為12 mm,有較強抑制作用;而對金黃色葡萄球菌沒有產(chǎn)生抑菌圈,無抑制作用。

    圖9 菌株HR-03對大腸桿菌抑制結(jié)果

    3 討論

    屎腸球菌(Enterococcusfaecium)是動物腸道中正常菌群的重要組成部分,定植于動物腸道黏膜表面可降低腸道內(nèi)pH值、抑制病原菌生長、減少體內(nèi)毒素含量,維持腸道健康、提高動物免疫能力[12-15]。屎腸球菌作為飼料添加劑應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖已有多年歷史,其優(yōu)良性能已得到廣大畜牧生產(chǎn)者的認(rèn)可。然而,在畜牧生產(chǎn)中往往出現(xiàn)乳酸菌等益生菌應(yīng)用效果不穩(wěn)定等情況發(fā)生,這一方面或許是由于乳酸菌不耐高溫,導(dǎo)致產(chǎn)品中乳酸菌活菌數(shù)波動較大,從而影響應(yīng)用效果[16];另一方面主要是由于非同源菌株很難定植在動物腸道內(nèi),或是定殖后因為各種因素?zé)o法發(fā)揮理想效果[5],章文明等[17]研究也發(fā)現(xiàn),同源益生菌對動物更加安全,效果更為穩(wěn)定,由此可見,篩選動物同源益生菌菌種,并對其特性進(jìn)行研究對于開發(fā)新的益生菌制劑至關(guān)重要。

    本研究從健康德州驢腸道內(nèi)容物中分離純化得到一株乳酸菌HR-03,利用形態(tài)特征觀察、分子生物學(xué)手段鑒定為屎腸球菌,并對其安全性能、生長性能、產(chǎn)酸性能、產(chǎn)酶性能、耐受性能及抑菌特性等進(jìn)行了初步研究,獲得安全性高、耐受性好且具有抑制病原菌性能的屎腸球菌HR-03,可作為后續(xù)開發(fā)驢源益生菌制劑的候選菌種。以往研究中,篩選驢源益生菌的研究報道較為有限,王卓等[18]從驢腸道內(nèi)分離鑒定出羅伊氏乳桿菌,并對其安全性進(jìn)行了研究,結(jié)果表明分離的乳酸菌對小鼠安全,而且能夠增強小鼠免疫力,這同本試驗中篩選的屎腸球菌無潛在致病性結(jié)果一致;劉宇等[19]也從驢糞便樣本中分離出具有較好安全性的干酪乳桿菌LV1,并對其生長性能、pH耐受性進(jìn)行了研究,但并未對篩選菌種的產(chǎn)酶、抑菌等性能進(jìn)行分析。

    作為飼喂養(yǎng)殖動物的益生菌,能否耐受胃酸和膽鹽是衡量一個菌種性能是否優(yōu)良的重要指標(biāo)。以往研究發(fā)現(xiàn),屎腸球菌具有較好的耐酸性,Guerra等[20]研究表明屎腸球菌CECT410在pH=2.0的條件下可以存活;盧冰霞等[21]從健康雞盲腸中分離出1株屎腸球菌J4,該菌株在pH值為2.0的條件下也可存活。同以上結(jié)果一致,本試驗分離的屎腸球菌HR-03在pH值為2.0的條件下也能存活,且在pH值為4.0的MRS肉湯中培養(yǎng)24 h后,其OD600值仍在0.3以上,表明此菌株具有較好的的耐酸性。膽鹽有助于脂肪的消化,可促進(jìn)脂肪酸和維生素的吸收,但對微生物具有抑殺作用。研究發(fā)現(xiàn),屎腸球菌對膽鹽也具有較好的耐受性,王煒宏等[22]分離出的1株屎腸球菌,用含膽鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%的MRS肉湯處理后,菌株存活率仍能保持在50%以上。本試驗中分離出的屎腸球菌HR-03也具有較好的膽鹽耐受性,同以往研究結(jié)果一致。

    菌種的產(chǎn)酶、抑菌等特性同益生菌制劑的能否發(fā)揮作用有重要關(guān)系。以往研究發(fā)現(xiàn),屎腸球菌具有較好的抑菌活性但產(chǎn)酶活性較低,Valenzuela等[23]研究發(fā)現(xiàn),分離的屎腸球菌對金黃色葡萄球菌和李斯特菌具有較好的抑制作用。本研究發(fā)現(xiàn)屎腸球菌HR-03對致病性大腸桿菌有明顯抑制作用,抑菌圈直徑為12 mm,但對金黃色葡萄球菌沒有抑制效果,這或許同不同屎腸球菌菌株產(chǎn)生的不同代謝產(chǎn)物有關(guān)。另外,Zeyner等[24]研究發(fā)現(xiàn),仔豬飼喂屎腸球菌SF68后,可以明顯抑制腸道內(nèi)致病性大腸桿菌的生長,這同本研究結(jié)果一致,本研究篩選的驢源屎腸球菌HR-03對致病性大腸桿菌也有明顯抑制作用,而且產(chǎn)酸性能較好,這對于防控大腸桿菌導(dǎo)致的驢駒腹瀉具有重要意義。

    4 結(jié)論

    本研究從健康驢腸道內(nèi)容物中,分離篩選得到一株安全性、耐受性良好,且能夠抑制病原性大腸桿菌的屎腸球菌HR-03。作為驢源腸道菌種,有利于在驢腸道內(nèi)定植,可為后續(xù)驢用益生菌制劑研制提供菌種資源。

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