正交試驗(yàn)優(yōu)化二味參蘇飲的提取工藝

趙冰潔，張 淵，王澳華，王 番，李紅玉，李悅寧，4，肖柯心，郭東艷，賈艷艷*

（1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽 712046；2.西京醫(yī)院，陜西 西安 710032；3.西安醫(yī)學(xué)院，陜西 西安 710021；4.西北大學(xué)，陜西 西安 710000）

古方參蘇飲始載于《婦科大全良方》，由人參、蘇木二味中藥組成，具有解表化痰、益氣寬胸的功效，臨床適用于因肺氣不能宣暢所導(dǎo)致的咳嗽痰多，胸悶鼻塞，倦怠乏力，氣短懶言。為進(jìn)一步開發(fā)古方，本課題擬優(yōu)化二味參蘇飲的提取工藝，以出膏率、巴西蘇木素含量和水浸出物作為評價指標(biāo)，以加水量、浸泡時間、提取次數(shù)和提取時間為考察因素，選取單因素試驗(yàn)和正交設(shè)計(jì)優(yōu)化該處方的提取工藝。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥品與試劑 人參、蘇木飲片購自西安灝洋生物技術(shù)有限公司，經(jīng)鑒定符合《中華人民共和國藥典》2020版一部的要求；巴西蘇木素對照品（大連美侖生物技術(shù)有限公司）；人參皂苷Rg1對照品（阿拉丁試劑有限公司）；甲醇（Fisher Chemical）；乙腈（Fisher Chemical）；正丁醇（富宇試劑）。

1.2 儀器DGU-20A高效液相色譜儀（日本島津）；DHG-9030A電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司）；N-1300旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛朗儀器有限公司）；KQ5200DE數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；SHB-3循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；BSA224S分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；JEA102電子天平（上海蒲春計(jì)量儀器有限公司）。

2 方法和結(jié)果

2.1 浸泡時間的單因素考察 根據(jù)二味參蘇飲的中藥比例關(guān)系，取人參30 g、蘇木60 g，總藥材量為90 g，分為10份，即每份含人參3 g、蘇木6 g。每份加10倍量（90 ml）的水，將藥材浸泡時間設(shè)置梯度，在10～100 min之間每10 min取1份藥材，濾過，計(jì)算不同時間內(nèi)藥材的吸水量和吸水率。結(jié)果見圖1。

圖1 浸泡時間與吸水量結(jié)果

從圖1中可以看出，二味參蘇飲中人參和蘇木兩味藥材的吸水量隨浸泡時間的增加呈現(xiàn)上升的趨勢，直到浸泡80 min后吸水量不再上升，此時藥材達(dá)到了吸水飽和的狀態(tài)。因此，將二味參蘇飲的浸泡時間定為80 min。

2.2 提取工藝的優(yōu)化 采用正交試驗(yàn)，經(jīng)單因素試驗(yàn)確定浸泡時間后，以加水量（A）、提取次數(shù)（B）和提取時間（C）為考察因素，以出膏率、水浸出物、巴西蘇木素含量作為評價指標(biāo)，運(yùn)用L9（34）設(shè)計(jì)篩選二味參蘇飲的提取工藝?？疾煲蛩睾退揭姳?。

表1 因素水平表

2.3 巴西蘇木素含量的測定

2.3.1 色譜條件DGU-20A高效液相色譜儀（日本島津）；流動相為甲醇∶水（90∶10，V/V）；流速0.8 ml/min；柱溫35℃；進(jìn)樣量20 μl；波長285 nm。

2.3.2 對照品溶液的制備 精密稱取巴西蘇木素對照品10.00 mg，加甲醇制成每1 ml含400 μg的對照品溶液母液。

2.3.3 供試品溶液的制備 精密稱取人參10 g、蘇木20 g，加入適量水浸泡80 min，按表3的正交試驗(yàn)方案進(jìn)行提取，濃縮至80 ml，蒸發(fā)皿中蒸干水分，烘箱干燥至恒重，密封保存，即得樣品。將所制備的9組樣品分別精密稱取10.00 mg，置于25 ml容量瓶中，用色譜級甲醇定容，搖勻，溶液過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即為供試品溶液。

精密吸取對照品溶液、供試品溶液各20 μl，按2.3.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，見圖2。

圖2 HPLC色譜圖

2.3.4 線性關(guān)系考察 精密吸取1 ml、2 ml、3 ml、4 ml、5 ml、10 ml巴西蘇木素對照品溶液母液置于10 ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，稀釋成濃度為40 mg/ml、80 mg/ml、120 mg/ml、160 mg/ml、200 mg/ml、400 mg/ml的溶液。溶液過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，分別進(jìn)樣20 μl，按照2.3.1項(xiàng)色譜條件測定，以對照品濃度（μg/ml）為橫坐標(biāo)（X），峰面積積分值為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：Y=33 562X+54 848，r2=0.999 9。結(jié)果表明，巴西蘇木素對照品在40～400 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.5 精密度試驗(yàn) 取巴西蘇木素對照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，每次20 μl，測定巴西蘇木素峰面積積分值，RSD為0.24%（n=6），表明本法測定精密度良好。

2.3.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一份供試品溶液，按2.3.1項(xiàng)下色譜條件，分別在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h進(jìn)樣測定，結(jié)果巴西蘇木素峰面積積分值RSD為0.64%（n=6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一供試品溶液2份，各20 μl，分別按2.3.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，結(jié)果巴西蘇木素的平均含量為0.056 1 mg/ml，RSD為1.90%（n=2）。

2.3.8 加樣回收試驗(yàn) 取已知含量的二味參蘇飲供試品溶液（巴西蘇木素平均含量為0.056 1 mg/ml），共取9份，每份25 ml，分別加入對照品溶液（0.400 0 mg/ml）1 ml、2 ml、3 ml各3份，按2.3.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.3.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定峰面積積分值。結(jié)果巴西蘇木素平均回收率為92.68%，RSD為2.16%（n=9），見表2。

表2 巴西蘇木素加樣回收試驗(yàn)結(jié)果 （n=9）

2.3.9 含量測定 取9份供試品溶液，按2.3.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，測定樣品中巴西蘇木素的含量，結(jié)果見表3。

2.4 出膏率的測定 取按2.3.3項(xiàng)方法制備得的9份樣品，分別置于蒸發(fā)皿中蒸干，蒸干后置于烘箱中干燥至恒重，最后將其置于干燥器干燥30 min后迅速稱重，計(jì)算出膏率，結(jié)果見表3。

2.5 水浸出物的測定 按照《中華人民共和國藥典》水溶性浸出物測定法測定水浸出物的含量。分別取按2.3.3項(xiàng)方法制備得的9份樣品各3.5 g，精密稱定，置于150 ml錐形瓶中，精密加水100 ml，密塞，稱定重量，靜置1 h后，連接回流冷凝管，加熱至沸騰，并保持微沸1 h，放冷后，取下錐形瓶，密塞，再稱定重量，用水補(bǔ)足減少的重量，水浴上蒸干后，于105℃干燥3 h，置于干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定重量，以干燥品計(jì)算供試品中水浸出物的重量，結(jié)果見表3。

2.6 正交試驗(yàn)方案及結(jié)果 正交試驗(yàn)結(jié)果見表3，方差分析見表4～表6。

表3 二味參蘇飲提取工藝正交設(shè)計(jì)方案及結(jié)果

表4 出膏率方差分析

表6 巴西蘇木素含量方差分析

表5 水浸出物含量方差分析

從表4～表6得出，以出膏率為評價指標(biāo)時，C因素差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其重要性依據(jù)順序?yàn)镃＞A＞B；以水浸出物含量為評價指標(biāo)時，A、B、C三個因素均無顯著影響；以巴西蘇木素含量為評價指標(biāo)時，A、B、C三個因素也均無顯著影響。

再直觀分析表3，出膏率的極差（R值）C＞A＞B，表明：各因素對提取效果的影響為提取時間＞加水量＞提取次數(shù)，最佳參數(shù)為A3B3C3，即加12倍水量回流提取120 min，10倍水量回流提取90 min，8倍水量回流提取60 min，共3次，將3次提取液合并，供下一步使用。

3 討 論

二味參蘇飲由人參和蘇木兩味藥材組成，人參斂氣補(bǔ)氣［1］，蘇木活血祛瘀［2］?！夺t(yī)宗金鑒》喘咳篇曰“損傷之證喘咳者，若因出血過多，面黑胸脹，胸膈痛而發(fā)喘者，乃氣血乘于肺也，急用二味參蘇飲，緩則難救”，《婦人大全良方》記載二味參蘇飲主治“婦人產(chǎn)后血入于肺，面黑發(fā)喘欲死者”［3］。水提法不僅符合該方的傳統(tǒng)用藥理念，而且與該方中人參和蘇木的理化性質(zhì)相符合，有利于發(fā)揮藥效。

蘇木的主要藥效成分巴西蘇木素在腎臟組織分布濃度最高，可抑制NF-κB信號通路調(diào)控炎性因子的表達(dá)進(jìn)而發(fā)揮腎保護(hù)作用［4］。本研究前處理方法參考藥典中巴西蘇木素的前處理方法［5］，通過對巴西蘇木素含量以及出膏率、水浸出物含量指標(biāo)進(jìn)行綜合評價，采用L9（3）4正交試驗(yàn)優(yōu)化二味參蘇飲的提取工藝，從而得到最優(yōu)的提取方案，即加入12倍水量回流提取120 min，10倍水量回流提取90 min，8倍水量回流提取60 min，共3次。本試驗(yàn)確定了二味參蘇飲的最佳提取方案，可為二味參蘇飲的現(xiàn)代應(yīng)用提供參考。