響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取錐栗殼色素工藝研究

黃慶斌，任 俊，黃 艷

（1.福建林業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，福建 南平 353000；2.武夷學(xué)院 茶與食品學(xué)院，福建 武夷山 354300）

錐栗（Castanea henryi Rehd.et Wils） 屬山殼斗科植物，別名毛榛、尖栗、為落葉喬木[1]。錐栗外殼亮麗，營養(yǎng)價(jià)值高，富含碳水化合物、蛋白質(zhì)和脂肪等。據(jù)《本草綱目》記載，錐栗具有治腰腳不遂、內(nèi)寒腹瀉、補(bǔ)腎益氣等功效。在我國，錐栗種植于閩、浙、贛、川等地，閩北建甌市被稱為“錐栗之鄉(xiāng)”，種植面積廣、產(chǎn)量高、品種齊全[2-4]。對錐栗果實(shí)的開發(fā)利用已被廣泛關(guān)注，而大部分錐栗殼被焚燒或廢棄，不僅造成資源浪費(fèi)，而且極易造成環(huán)境污染[5]。錐栗殼不僅能去皺、止血，毛球具有消腫等功能，而且富含天然色素——棕色素等[6]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，建甌錐栗產(chǎn)量達(dá)3.3萬t/年，產(chǎn)值超過4.61億元，錐栗殼可達(dá)1.85萬t[7]，這為錐栗殼棕色素的提取提供了原料保障。

色素分為天然色素與合成色素[8-10]，合成色素與天然色素相比著色力強(qiáng)、性質(zhì)穩(wěn)定、價(jià)格便宜等優(yōu)點(diǎn)。研究表明，幾乎所有的合成色素都無法提供人體所需的營養(yǎng)素，有些合成色素的安全性受到質(zhì)疑，被嚴(yán)格限制使用[11-13]。天然色素因其無副毒作用、安全性高等優(yōu)點(diǎn)被人們所追捧，在市場上以每年保持10%以上的速度增長[14]。

在我國目前有34種色素已被批準(zhǔn)允許在食品行業(yè)中使用。歐美發(fā)達(dá)國家非常注重對天然色素的開發(fā)和利用[15-16]。近年來，隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)提高，食品飲料行業(yè)對色素的需求也隨之增長，天然色素是未來色素發(fā)展的主要趨勢[17]。

超聲波提取技術(shù)（Ultrasonic extraction）是利用超聲波的機(jī)械、空化、熱效應(yīng)等物理破碎方法來完成生物有效成分的提取[18]，該過程不會改變浸提物化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)[19]。超聲波輔助技術(shù)在食品有效成分提取方面有廣闊的應(yīng)用前景[20]。

國內(nèi)科學(xué)家對錐栗栽培[21-22]、生理特性[23]、加工貯藏[24]等方面的研究較多，對錐栗殼的有效利用研究不多見。以碳酸鈉溶液為溶劑，應(yīng)用超聲波輔助浸提，探究超聲時(shí)間（A）、超聲溫度（B）、超聲功率（C）、料液比等因素對錐栗殼色素提取的影響，再通過響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝參數(shù)，以期為錐栗殼天然色素開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

錐栗殼，市售，經(jīng)篩選除去霉?fàn)€，清洗晾曬至干，將貼殼帶絨毛果衣去除，然后置于60℃烘箱中24 h，再粉碎過100目篩，備用[5]。

碳酸鈉（AR），西隴化工股份有限公司提供；無水乙醇（AR），三明市三圓化學(xué)試劑有限公司提供。

DZF-6050型真空干燥箱，揚(yáng)州市培英實(shí)驗(yàn)儀器有限公司產(chǎn)品；RE52-99型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品；SartoriusBSA2245型電子分析天平，北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；HH-S4型數(shù)顯恒溫水浴鍋的，河北中捷儀器制造有限公司產(chǎn)品；DHF-9123型電熱恒溫鼓風(fēng)千燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品；PW80型高速萬能粉碎機(jī)，天津市泰斯特儀器有限公司產(chǎn)品；KQ-520ODE型超聲波清洗機(jī)，昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；UV-3200PC型紫外可見分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 錐栗殼粗提色素的制備

參考陳世平[4]的方法，稍作調(diào)整，工藝如下：

錐栗殼粉→乙醇恒溫回流浸提→抽濾、離心→減壓濃縮→粗提液→加乙醇、乙酸乙酯及石油醚萃取除雜→減壓濃縮→冷凍干燥→粗提色素干品。

1.2.2 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

稱取5.00 mg錐栗殼粗提色素于100 mL容量瓶中，加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%的Na2CO3溶解定容，得質(zhì)量濃度為0.05 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液于5支10 mL具塞試管中，依次向試管中加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%的Na2CO3溶液9.0，8.0，7.0，6.0，5.0 mL定容至刻度，于最大波長277 nm處[5]測定吸光度，以質(zhì)量濃度和吸光度為橫、縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 提取率計(jì)算[25]

式中：C——錐栗殼色素溶液質(zhì)量濃度，mg/mL；

V——錐栗提取液體積，mL；

W——錐栗殼粉質(zhì)量，g。

1.2.4 單因素試驗(yàn)

（1）Na2CO3溶液對錐栗殼色素提取的影響。稱取1.000 0 g錐栗殼粉6份，分別裝入6個(gè)250 mL錐形瓶中，按料液比1∶30（g∶mL）加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為3.0%，2.5%，2.0%，1.5%，1.0%，0.5%的Na2CO3溶液30 mL，在超聲溫度為40℃，超聲功率為450 W浸提20 min，抽濾后以轉(zhuǎn)速5 000 r/min離心15 min。取1 mL上清液稀釋至100 mL，于波長277 nm處測定吸光度。

（2）超聲功率對錐栗殼色素提取的影響。稱取1.000 0 g錐栗殼粉6份，分別裝入6個(gè)250 mL錐形瓶中，以料液比1∶30（g∶mL）加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的Na2CO3溶液30 mL，于超聲溫度為40℃，分別置于超聲功率為500，450，400，350，300，250 W下浸提20 min，抽濾后操作同前文。

（3）超聲溫度對錐栗殼色素提取的影響。稱取1.000 0 g錐栗殼粉6份，分別裝入6個(gè)250 mL錐形瓶中，以料液比1∶30（g∶mL）加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的Na2CO3溶液30 mL，在超聲溫度分別為80，70，60，50，40，30℃，超聲功率為450 W條件下浸提20 min，抽濾后操作同前文。

（4）超聲時(shí)間對錐栗殼色素提取的影響。稱取1.000 0 g錐栗殼粉6份，分別裝入6個(gè)250 mL錐形瓶中，以料液比1∶30（g∶mL）加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的Na2CO3溶液30 mL，于超聲溫度為40℃，超聲功率為450 W條件下，分別浸提10，20，30，40，50，60 min，抽濾后操作同前文。

（5）料液比對錐栗殼色素提取的影響。稱取1.000 0 g錐栗殼粉6份，分別裝入6個(gè)250 mL錐形瓶中，在料液比分別為1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35，1∶40（g∶mL）加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的Na2CO3溶液30 mL，于超聲溫度為40℃，超聲功率為450 W條件下浸提20 min，抽濾后操作同前文。

（6）提取次數(shù)對錐栗殼色素提取的影響。稱取1.000 0 g錐栗殼粉6份，分別裝入6個(gè)250 mL錐形瓶中，以料液比1∶30（g∶mL）加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的Na2CO3溶液30 mL，于超聲溫度為40℃，超聲功率為450 W條件下浸提20 min，分別提取1，2，3，4次，抽濾后操作同前文。

1.2.5 Box-benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取提取次數(shù)1次、Na2CO3質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5%，料液比1∶30，以錐栗殼色素提取率為響應(yīng)值，以A、B、C為自變量，優(yōu)化Box-behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)重復(fù)3次以上。

因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 因素與水平設(shè)計(jì)

1.2.6 驗(yàn)證試驗(yàn)

將響應(yīng)曲面軟件回歸模型預(yù)測值與驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果比較，考查其擬合度，確定模型的可靠性和實(shí)際意義。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

單因素圖用Excel 2013繪制，采用Design Expert 8.0.6軟件建立回歸模型、繪制響應(yīng)曲面圖并進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

錐栗殼色素標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 錐栗殼色素標(biāo)準(zhǔn)曲線

以質(zhì)量濃度、吸光度為橫、縱坐標(biāo)，得回歸方程：

式中：A——吸光度；

C——色素質(zhì)量濃度，mg/mL。

由圖1可知，錐栗殼色素質(zhì)量濃度為0.005～0.025 mg/mL時(shí)，吸光度與質(zhì)量濃度線性關(guān)系良好。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 Na2CO3溶液對錐栗殼色素提取的影響

Na2CO3溶液對錐栗殼色素提取的影響見圖2。

圖2 Na2CO3溶液對錐栗殼色素提取的影響

由圖2可知，Na2CO3溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低時(shí)，提取率與Na2CO3溶液呈正相關(guān)，當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%時(shí)，提取率為14.18%，為最大值；之后隨質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，色素提取率有所下降，可能過高的Na2CO3溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)對色素結(jié)構(gòu)有一定的破壞[26]。因此，選取Na2CO3為2.5%開展下一步試驗(yàn)。

2.2.2 超聲功率對錐栗殼色素提取的影響

超聲功率對錐栗殼色素提取的影響見圖3。

圖3 超聲功率對錐栗殼色素提取的影響

由圖3可知，超聲功率小于450 W時(shí)，提取率與超聲功率呈正比；當(dāng)超聲功率為450 W時(shí)，提取率達(dá)到32.15%，為最大；超聲功率大于450 W時(shí)，提取率隨超聲功率的增大而降低，可能是較強(qiáng)的熱效應(yīng)使色素加快分解，致使提取率下降[27]。因此，選取超聲功率為450 W開展下一步試驗(yàn)。

2.2.3 超聲溫度對錐栗殼色素提取的影響

超聲溫度對錐栗殼色素提取的影響見圖4。

圖4 超聲溫度對錐栗殼色素提取的影響

由圖4可知，提取率隨超聲溫度的升高而提高，當(dāng)超聲溫度為80℃時(shí)，提取率最大，為37.07%。超聲溫度繼續(xù)升高提取率下降，可能是到一定溫度時(shí)色素分子降解加快，使其提取率降低[27]。因此，選取超聲溫度80℃開展下一步試驗(yàn)。

2.2.4 超聲時(shí)間對錐栗殼色素提取的影響

超聲時(shí)間對錐栗殼色素提取的影響見圖5。

由圖5可知，提取率與超聲時(shí)間的關(guān)系是先呈正相關(guān)而后呈負(fù)相關(guān)，當(dāng)超聲時(shí)間40 min時(shí)，提取率最大，為38.47%。超聲時(shí)間繼續(xù)增加，其空化效應(yīng)增強(qiáng)可能會破壞部分色素結(jié)構(gòu)，使其提取率降低[28]。因此，超聲時(shí)間40 min為最佳。

圖5 超聲時(shí)間對錐栗殼色素提取的影響

2.2.5 料液比對錐栗殼色素提取的影響

料液比對錐栗殼色素提取的影響見圖6。

圖6 料液比對錐栗殼色素提取的影響

由圖6可知，當(dāng)料液比達(dá)1∶30（g∶mL）時(shí)，提取率最大，為38.66%，之后提取率趨于平穩(wěn)；可能是料液比增加提取液在色素細(xì)胞內(nèi)的擴(kuò)散增強(qiáng)，但提取液濃度低于一定程度時(shí)，滲透壓變大，擴(kuò)散能力反而降低[29]。為節(jié)約耗材、降低成本，宜選用料液比1∶30（g∶mL）。

2.2.6 提取次數(shù)對錐栗殼色素提取的影響

提取次數(shù)對錐栗殼色素效果的影響見圖7。

圖7 提取次數(shù)對錐栗殼色素效果的影響

由圖7可知，錐栗殼色素提取率隨著提取次數(shù)的增加而呈上升趨勢，但上升不明顯。為提高效益，選用1次提取。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 建立回歸模型響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

利用Design Expert 8.0.6軟件對表2中的響應(yīng)面值開展回歸分析，得錐栗殼色素提取率與A、B、C的二項(xiàng)多元回歸方程為：

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.3.2 方差分析

二項(xiàng)多元回歸方程的方差分析見表3。

表3 二項(xiàng)多元回歸方程的方差分析

由表3可知，模型F值為2 347.59（p＜0.000 1），說明該模型有極顯著差異；失擬項(xiàng)p=0.072 1＞0.05，說明無顯著差異、誤差小，擬合度高；R2=0.971 2，表明97.12%的響應(yīng)值變化能夠用該模型解釋，該模型不能解釋剩余2.88%的變異值。各因素對錐栗殼色素提取效果影響程度為A＞B＞C，即超聲時(shí)間＞超聲溫度＞超聲功率。表4顯著性可知，A、A2，B2，C、C2均有極顯著影響（p＜0.000 1），交互項(xiàng)AC、BC這2個(gè)因素有顯著影響（p＜0.05），其他因素?zé)o顯著影響（p＞0.05）。

2.3.3 錐栗殼色素提取率響應(yīng)曲面

經(jīng)Design Expert 8.0.6軟件分析，圖8～圖10為試驗(yàn)所得響應(yīng)面圖。

超聲時(shí)間和超聲功率的交互作用對錐栗殼色素提取的影響見圖8。

圖8 超聲時(shí)間和超聲功率的交互作用對錐栗殼色素提取的影響

由圖8可知，A和C的交互作用的等高線圖為橢圓形，說明AC交互作用對錐栗殼色素提取率有顯著影響。當(dāng)超聲功率固定時(shí)，色素提取率隨超聲時(shí)間的延長，呈先增后減的趨勢，提取率達(dá)最大值出現(xiàn)在40 min時(shí)。

超聲溫度和超聲功率的交互作用對錐栗殼色素提取的影響見圖9。

圖9 超聲溫度和超聲功率的交互作用對錐栗殼色素提取的影響

由圖9可知，B與C交互作用的等高線圖為橢圓形，表明BC交互作用對錐栗殼色素的提取率有顯著影響。當(dāng)超聲溫度一定時(shí)，色素提取率隨超聲功率的增加呈先增后降的趨勢，最大值出現(xiàn)在超聲功率為450 W時(shí)。

超聲時(shí)間和超聲溫度的交互作用對錐栗殼色素提取的影響見圖10。

圖10 超聲時(shí)間和超聲溫度的交互作用對錐栗殼色素提取的影響

由圖10可知，AB交互作用等高線圖為橢圓形，說明AB交互作用對錐栗殼色素提取率有顯著影響。超聲溫度達(dá)到80℃時(shí)，提取率最大，之后隨超聲溫度和超聲時(shí)間增加，提取率均呈下降。

2.4 參數(shù)優(yōu)化及驗(yàn)證

對試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行優(yōu)化，得超聲波輔助Na2CO3溶液提取錐栗殼色素的最佳工藝參數(shù)為超聲時(shí)間47.1 min，超聲溫度81.38℃，超聲功率445 W，理論提取率為39.177 9%。為優(yōu)化工藝參數(shù)操作性，修正為超聲時(shí)間47 min，超聲溫度81℃，超聲功率450 W，用修正后的參數(shù)做驗(yàn)證試驗(yàn)，測得提取率為38.41%，兩者相對誤差約為0.77%。由此表明，試驗(yàn)優(yōu)化的方程具有實(shí)踐意義，利用該數(shù)學(xué)模型對優(yōu)化錐栗殼色素提取工藝是可行的。

3 結(jié)論

利用Design Expert 8.0.6軟件中Box-behnken功能，設(shè)計(jì)超聲時(shí)間、超聲溫度、超聲功率與錐栗殼色素提取率之間的數(shù)學(xué)模型為：

相關(guān)系數(shù)R2=0.971 2，p=0.072 1，說明數(shù)學(xué)模型顯著，擬合度高。

利用該模型的響應(yīng)面，討論了影響錐栗殼色素提取率的關(guān)鍵因素及其相互作用，優(yōu)化得出最佳工藝參數(shù)為超聲時(shí)間47.2 min，超聲溫度81.39℃，超聲功率450 W，此工藝條件理論預(yù)測值（39.18%）與修正工藝后的驗(yàn)證結(jié)果（38.41%）間的相對誤差約為0.77%，說明該模型合理，對指導(dǎo)實(shí)踐有一定作用。