天麻素對坐骨神經(jīng)痛模型大鼠TNF-α/STAT3通路及痛覺敏感性的影響①

胡 焓 馮 丹 田佳玉 童勝雄 張書力（武漢市第一醫(yī)院疼痛科，武漢 430022）

坐骨神經(jīng)痛（sciatica）是以椎間盤突出、腰椎退行性病變引起的一種外周神經(jīng)病理性疼痛，以陣發(fā)性、持續(xù)性麻木疼痛為主要臨床癥狀，其疼痛劇烈，發(fā)病率高達(dá)40%，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量［1-2］。坐骨神經(jīng)痛的病因及發(fā)病機(jī)制復(fù)雜且不明確，目前研究發(fā)現(xiàn)，炎癥細(xì)胞浸潤、星型膠質(zhì)細(xì)胞活化、神經(jīng)損傷等是導(dǎo)致坐骨神經(jīng)痛等神經(jīng)疼痛的關(guān)鍵因素［3］。炎癥介質(zhì)TNF-α不僅可以增加神經(jīng)節(jié)中鈉通道電流的產(chǎn)生，加劇嚙齒動物模型機(jī)械異常疼痛，還可通過激活轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）通路表達(dá)來激活星形膠質(zhì)細(xì)胞、炎癥反應(yīng)等，介導(dǎo)神經(jīng)病理性疼痛進(jìn)程［4-6］。但TNF-α/STAT3通路的調(diào)控機(jī)制在坐骨神經(jīng)痛過程中的研究較少。天然藥物天麻中的天麻素在臨床上常用于頭痛、癲癇、神經(jīng)衰弱等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療，且近來研究發(fā)現(xiàn)，天麻素對長春新堿誘導(dǎo)的外周神經(jīng)病理性疼痛有較好的鎮(zhèn)痛效果，但其鎮(zhèn)痛機(jī)制還不甚明確［7-8］。本研究建立大鼠坐骨神經(jīng)痛疼痛模型，從TNF-α/STAT3通路探討天麻素的鎮(zhèn)痛機(jī)制，以期闡明坐骨神經(jīng)痛疼痛的分子生物學(xué)機(jī)制，為臨床合理用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 清潔級SD大鼠60只，7～8周齡，體質(zhì)量220～240 g，由浙江維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK（浙）2020-0002。所有大鼠于武漢大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心動物房中常規(guī)飼養(yǎng)。動物實(shí)驗(yàn)按照國際疼痛學(xué)會（IASP）綱領(lǐng)和要求實(shí)施，并經(jīng)武漢市第一醫(yī)院動物倫理委員會批準(zhǔn)，批號：IACUC-01（20190917）。

1.1.2 主要試劑及儀器 天麻素標(biāo)準(zhǔn)品購自上海寶曼生物科技有限公司，貨號：D1355，規(guī)格：20 mg；HE染色試劑盒購自上海聯(lián)邁生物工程有限公司，貨 號：LMO105；前 列 腺 素E2（prostaglandin E2，PGE2）及降鈣素基因相關(guān)肽（calcitonin gene-related peptide，CGRP）等ELISA試劑盒購自上海圻明生物科技有限公司及浙江羽翔生物科技有限公司，貨號：R31545、EYX-DD02605；雞抗膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）、小鼠抗TNF-α、兔抗電壓門控鈉通道亞型（voltage-gated sodium channel subtype，Nav1.6）、雞抗微管相關(guān)蛋白2（microtubule-associated protein 2，MAP2）購 自 美 國Abcam公 司，貨 號：ab134436、ab109322、ab68153、ab5392；TNF-α、STAT3、Nav1.6、IL-6、環(huán)氧化酶-2（COX-2）、趨化因子配體2（CCL2）等抗體購自美國Abcam公司，貨號：ab109322、ab68153、ab230654、ab208113、ab179800、ab25124。蛋白電泳儀（型號：1659001）購自美國Bio-Rad公司；免疫熒光共聚焦顯微鏡（型號：DM2500）購自德國徠卡公司；Von Frey電子測痛儀（型號：BIOEVF4）購自深圳市瑞沃德生命科技有限公司；熱輻射刺激器（型號：BME-410C）購自天津伯爾尼科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 模型建立及分組給藥 參照文獻(xiàn)［9］掀開大鼠L6硬脊膜置入PE-10導(dǎo)管，行坐骨神經(jīng)結(jié)扎手術(shù)構(gòu)建坐骨神經(jīng)痛模型。術(shù)后2 d觀察大鼠行為，若大鼠出現(xiàn)激惹行為且機(jī)械痛敏閾值（paw withdrawal latency，PWL）及熱刺激反應(yīng)潛伏期（paw withdrawal threshold，PWT）檢測結(jié)果異常，視為造模成功。共造模成功50只，隨機(jī)分為模型組、天麻素組（120 mg/kg）、TNF-α過表達(dá)的重組腺病毒組（Ad-TNF-α，4μl/只）、空腺病毒組（Ad-GFP，4μl/只）、天麻素+Ad-TNF-α組（120 mg/kg+4μl/只），每組10只；另取10只大鼠，只暴露L6硬脊膜不結(jié)扎，其余操作同模型組，作為假手術(shù)組。各組大鼠均于術(shù)后第3天開始給藥，天麻素組參照文獻(xiàn)［10］設(shè)置劑量并用生理鹽水稀釋成濃度為12.00 mg/ml的混懸液，按10 ml/kg的容積經(jīng)腹腔注射給藥，1次/d；Ad-TNF-α及Ad-GFP參照文獻(xiàn)［11］經(jīng)脊髓鞘內(nèi)注射，4μl/只，2次/周；天麻素+Ad-TNF-α組腹腔注射天麻素的同時，經(jīng)鞘內(nèi)注射Ad-TNF-α溶液；模型組和假手術(shù)組注射等劑量生理鹽水，各組連續(xù)給藥14 d。

1.2.2 大鼠一般行為觀察 各組大鼠均于給藥期間觀察飲食、活動及精神狀態(tài)。

1.2.3 大鼠PWT及PWL檢測 各組大鼠于末次給藥12 h后，參照文獻(xiàn)［10］用Von Frey電子測痛儀及熱輻射刺激器測定各組大鼠PWT及PWL值。

1.2.4 大鼠背根神經(jīng)節(jié)標(biāo)本采集 各組大鼠檢測完P(guān)WT及PWL后，麻醉處死大鼠，迅速解剖手術(shù)同側(cè)的L4、L6、L5段背根神經(jīng)節(jié)，剪取約3 cm組織置于-80℃冰箱保存，其余組織迅速置于4%多聚甲醛中固定24 h后備用。

1.2.5 大鼠背根神經(jīng)節(jié)痛覺敏感相關(guān)物質(zhì)CGRP及PGE2水平檢測 取1.2.4項(xiàng)下-80℃冰箱保存的背根神經(jīng)節(jié)，用組織勻漿研磨器勻漿、研磨后，離心取上清液，按CGRP及PGE2試劑盒說明書方法檢測CGRP及PGE2水平。

1.2.6 各組大鼠脊髓HE染色 取1.2.4項(xiàng)下4%多聚甲醛固定的背根神經(jīng)節(jié)組織，常規(guī)處理并切成20μm厚的切片。取部分切片按HE試劑盒說明書染色、封片后，置于光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理變化。

1.2.7 免疫熒光雙標(biāo)記法檢測TNF-α與GFAP共表達(dá)水平 取1.2.6項(xiàng)下部分切片，室溫風(fēng)化及0.5%曲拉通（Triton X-100）透化后，加入一抗（小鼠抗TNF-α、雞抗GFAP，稀釋倍數(shù)均為1∶500）4℃孵育過夜后加入二抗（TRITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG、FITC標(biāo)記的山羊抗雞IgG，稀釋倍數(shù)為1∶200）孵育顯色后，置于熒光顯微鏡下觀察、拍照。

1.2.8 免疫熒光雙標(biāo)記法檢測TNF-α、Nav1.6與MAP2共表達(dá)水平 取1.2.6項(xiàng)下部分切片，室溫風(fēng)化及0.5%曲拉通（Triton X-100）透化后，加入一抗（小鼠抗TNF-α、兔抗Nav1.6、雞抗MAP2，稀釋倍數(shù)均為1∶500）4℃孵育過夜后加入二抗（TRITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG、TRITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG、FITC標(biāo)記的山羊抗雞IgG，稀釋倍數(shù)為1∶200），DAPI復(fù)染孵育顯色后，置于熒光顯微鏡下觀察、拍照。

1.2.9 Western blot檢測背根神經(jīng)節(jié)組織TNF-α、STAT3、Nav1.6、CCL2、IL-6、COX-2蛋白相對表達(dá)水平 取1.2.4項(xiàng)下-80℃冰箱保存的背根神經(jīng)節(jié)組織，于4℃解凍后剪碎，加入RIPA裂解液，用組織勻漿器置于冰上研磨、裂解、離心后取上清液，BCA試劑盒測定蛋白濃度。取50μg蛋白進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉反應(yīng)后，加入抗體（TNF-α、STAT3、Nav1.6、CCL2、IL-6、COX-2抗體，稀釋倍數(shù)均為1∶800，內(nèi)參β-actin，1∶2 000）4℃孵育過夜，加入1∶1 000兔抗鼠二抗溶液，室溫孵育及漂洗后，用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色并拍照，并以Image J軟件分析各組蛋白相對表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 以SPSS22.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩組間比較行SNK-q檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 天麻素對大鼠一般行為的影響 假手術(shù)組大鼠進(jìn)食、飲水及精神活動正常；模型組大鼠進(jìn)食、飲水及活動量減少，精神萎靡，易激惹行為增多；天麻素組大鼠易激惹行為減少，活動量有所增加；Ad-TNF-α組大鼠易激惹行為進(jìn)一步增多；天麻素+Ad-TNF-α組、Ad-GFP組大鼠上述行為活動變化與模型組相似。

2.2 天麻素對大鼠PWL、PWT的影響 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠PWL、PWT降低（P＜0.05）。與模型組相比，天麻素組大鼠PWL、PWT升高（P＜0.05）；Ad-TNF-α組大鼠PWL、PWT降低（P＜0.05）。與天麻素組相比，天麻素+Ad-TNF-α組大鼠PWL、PWT降低（P＜0.05）。Ad-GFP組與模型組比較上述指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 各組大鼠PWT、PWL結(jié)果比較（±s）Tab.1 Comparison of PWT and PWL results of rats in each group（±s）

表1 各組大鼠PWT、PWL結(jié)果比較（±s）Tab.1 Comparison of PWT and PWL results of rats in each group（±s）

Note：Compared with sham operation group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05；compared with gastrodin group，3）P＜0.05.

Groups Sham operation Model Gastrodin Ad-TNF-α Gastrodin+Ad-TNF-α Ad-GFP n 10 10 10 10 10 10 PWT/s 42.96±2.23 9.96±0.411）28.31±1.121）2）6.30±0.321）2）9.78±0.491）3）9.89±0.421）3）PWL/s 19.94±0.82 6.09±0.311）12.43±0.691）2）4.43±0.291）2）6.63±0.311）3）6.03±0.321）3）

2.3 天麻素對大鼠痛覺敏感相關(guān)物質(zhì)CGRP、PGE2表達(dá)水平的影響 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠背根神經(jīng)節(jié)CGRP、PGE2水平升高（P＜0.05）。與模型組相比，天麻素組大鼠背根神經(jīng)節(jié)CGRP、PGE2水平降低（P＜0.05）；Ad-TNF-α組大鼠PWL、PWT背根神經(jīng)節(jié)CGRP、PGE2水平升高（P＜0.05）。天麻素+Ad-TNF-α組上述指標(biāo)高于天麻素組（P＜0.05）。Ad-GFP組與模型組比較上述指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

表2 各組大鼠背根神經(jīng)節(jié)CGRP、PGE2水平比較（±s）Tab.2 Comparison of CGRP and PGE2 levels in dorsal root ganglion of rats in each group（±s）

表2 各組大鼠背根神經(jīng)節(jié)CGRP、PGE2水平比較（±s）Tab.2 Comparison of CGRP and PGE2 levels in dorsal root ganglion of rats in each group（±s）

Note：Compared with sham operation group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05；compared with gastrodin group，3）P＜0.05.

Groups Sham operation Model Gastrodin Ad-TNF-α Gastrodin+Ad-TNF-α Ad-GFP n 10 10 10 10 10 10 PGE2/（ng·g-1）48.69±4.03 198.96±19.611）85.91±8.021）2）272.30±21.121）2）199.18±19.191）3）199.09±18.201）3）CGRP/（pg·g-1）46.04±3.02 162.39±16.311）73.06±7.281）2）254.33±23.261）2）162.01±15.111）3）163.23±16.121）3）

2.4 天麻素對大鼠背根神經(jīng)節(jié)病理形態(tài)的影響假手術(shù)組大鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)纖維排列整齊致密，結(jié)構(gòu)正常。模型組大鼠神經(jīng)纖維排列紊亂、軸突及髓鞘崩解、雪旺細(xì)胞破壞較多，郎飛結(jié)構(gòu)重疊、模糊不清。天麻素組大鼠可見神經(jīng)纖維排列較為規(guī)則，雪旺細(xì)胞增殖分化及郎飛結(jié)構(gòu)新生明顯。Ad-TNF-α組大鼠神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)排列紊亂、軸突及髓鞘崩解、雪旺細(xì)胞及郎飛結(jié)構(gòu)破壞進(jìn)一步加重。天麻素+Ad-TNF-α組、Ad-GFP組大鼠上述病理變化與模型組相近，見圖1。

圖1 背根神經(jīng)節(jié)組織HE染色圖（×200）Fig.1 HE staining of dorsal root ganglion tissue（×200）

2.5 天麻素對大鼠TNF-α、GFAP陽性共表達(dá)的影響 與假手術(shù)相比，模型組大鼠TNF-α與GFAP陽性共表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與模型組相比，天麻素組大鼠TNF-α與GFAP陽性共表達(dá)水平降低（P＜0.05）；Ad-TNF-α組大鼠TNF-α與GFAP陽性共表達(dá)水平升高（P＜0.05）。天麻素+Ad-TNF-α組上述指標(biāo)高于天麻素組（P＜0.05）。Ad-GFP組與模型組比較上述指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖2、表3。

表3 各組大鼠背根神經(jīng)節(jié)組織TNF-α與GFAP陽性共表達(dá)水平比較（±s）Tab.3 Comparison of TNF-αand GFAP positive co-expression levels in dorsal root ganglion tissues of rats in each group（±s）

表3 各組大鼠背根神經(jīng)節(jié)組織TNF-α與GFAP陽性共表達(dá)水平比較（±s）Tab.3 Comparison of TNF-αand GFAP positive co-expression levels in dorsal root ganglion tissues of rats in each group（±s）

Note：Compared with sham operation group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05；compared with gastrodin group，3）P＜0.05.

Groups Sham operation Model Gastrodin Ad-TNF-α Gastrodin+Ad-TNF-α Ad-GFP n 10 10 10 10 10 10 TNF-α+GFAP+/（n·mm-2）32.22±3.10 59.32±5.141）49.02±4.131）2）70.71±7.121）2）58.52±5.111）3）59.51±5.101）3）

圖2 背根神經(jīng)節(jié)組織TNF-α與GFAP免疫熒光染色圖（×400）Fig.2 Immunofluorescence staining of TNF-αand GFAP in dorsal root ganglion tissue（×400）

2.6 天麻素對大鼠TNF-α、Nav1.6及MAP2陽性共表達(dá)的影響 與假手術(shù)相比，模型組大鼠TNF-α與MAP2、Nav1.6與MAP2陽性共表達(dá)水平均升高（P＜0.05）；與模型組相比，天麻素組大鼠TNF-α與MAP2、Nav1.6與MAP2陽性共表達(dá)水平降低（P＜0.05）；Ad-TNF-α組大鼠TNF-α與MAP2、Nav1.6與MAP2陽性共表達(dá)水平升高（P＜0.05）。天麻素+Ad-TNF-α組上述指標(biāo)變化與天麻素組相反，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Ad-GFP組與模型組比較上述指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖3、圖4、表4。

表4 各組大鼠TNF-α、Nav1.6及MAP2陽性共表達(dá)水平比較（±s）Tab.4 Comparison of positive co expression levels of TNF-α，Nav1.6 and MAP2 of rats in each group（±s）

表4 各組大鼠TNF-α、Nav1.6及MAP2陽性共表達(dá)水平比較（±s）Tab.4 Comparison of positive co expression levels of TNF-α，Nav1.6 and MAP2 of rats in each group（±s）

Note：Compared with sham operation group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05；compared with gastrodin group，3）P＜0.05.

Groups Sham operation Model Gastrodin Ad-TNF-α Gastrodin+Ad-TNF-α Ad-GFP n 10 10 10 10 10 10 TNF-α+MAP2+/（n·mm-2）30.12±3.09 56.12±5.041）46.02±4.031）2）71.01±7.151）2）56.12±5.011）3）56.11±5.091）3）Nav1.6+MAP2+/（n·mm-2）29.86±1.28 52.31±4.681）41.09±3.521）2）77.69±6.241）2）56.32±4.981）3）58.69±4.961）3）

圖3 背根神經(jīng)節(jié)組織TNF-α與MAP2免疫熒光染色圖（×400）Fig.3 Immunofluorescence staining of TNF-αand MAP2 in dorsal root ganglion tissue（×400）

2.7 天麻素對大鼠背根神經(jīng)節(jié)TNF-α、STAT3、Nav1.6蛋白表達(dá)的影響 與假手術(shù)組相比，模型組大 鼠TNF-α、STAT3、Nav1.6蛋 白 表 達(dá) 升 高（P＜0.05）；與模型組相比，天麻素組大鼠TNF-α、STAT3、Nav1.6蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）；Ad-TNF-α組大鼠TNF-α、STAT3、Nav1.6蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）。天麻素+Ad-TNF-α組上述指標(biāo)變化與天麻素組相反，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Ad-GFP組與模型組比較上述指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖5、表5。

表5 各組大鼠背根神經(jīng)節(jié)TNF-α、STAT3、Nav1.6蛋白表達(dá)比較（±s，n=10）Tab.5 Comparison of TNF-α，STAT3 and Nav1.6 protein expressions in dorsal root ganglion of rats in each group（±s，n=10）

表5 各組大鼠背根神經(jīng)節(jié)TNF-α、STAT3、Nav1.6蛋白表達(dá)比較（±s，n=10）Tab.5 Comparison of TNF-α，STAT3 and Nav1.6 protein expressions in dorsal root ganglion of rats in each group（±s，n=10）

Note：Compared with sham operation group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05；compared with gastrodin group，3）P＜0.05.

Groups Sham operation Model Gastrodin Ad-TNF-α Gastrodin+Ad-TNF-α Ad-GFP TNF-α/β-actin 1.18±0.11 2.36±0.211）1.61±0.161）2）2.91±0.291）2）2.31±0.211）3）2.40±0.221）3）STAT3/β-actin 1.23±0.10 2.48±0.201）1.52±0.161）2）2.92±0.281）2）2.46±0.211）3）2.45±0.201）3）Nav1.6/β-actin 1.01±0.11 2.26±0.221）1.41±0.141）2）2.89±0.291）2）2.21±0.211）3）2.20±0.221）3）

圖5 各組大鼠背根神經(jīng)節(jié)TNF-α、STAT3、Nav1.6蛋白表達(dá)Fig.5 TNF-α，STAT3 and Nav1.6 protein expressions in dorsal root ganglion of rats in each group

2.8 天麻素對大鼠背根神經(jīng)節(jié)CCL2、IL-6、COX-2蛋白表達(dá)結(jié)果 與假手術(shù)相比，模型組大鼠CCL2、IL-6、COX-2蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）；與模型組相比，天麻素組大鼠CCL2、IL-6、COX-2蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）；Ad-TNF-α組大鼠CCL2、IL-6、COX-2蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）。天麻素+Ad-TNF-α組上述指標(biāo)變化與天麻素組相反，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Ad-GFP組與模型組比較上述指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖6、表6。

圖6 各組大鼠背根神經(jīng)節(jié)CCL2、IL-6、COX-2蛋白表達(dá)Fig.6 CCL2，IL-6 and COX-2 protein expressions in dorsal root ganglia of rats in each group

表6 各組大鼠背根神經(jīng)節(jié)CCL2、IL-6、COX-2蛋白表達(dá)水平（±s，n=10）Tab.6 Protein expression levels of CCL2，IL-6 and COX-2 in dorsal root ganglia of rats in each group（±s，n=10）

表6 各組大鼠背根神經(jīng)節(jié)CCL2、IL-6、COX-2蛋白表達(dá)水平（±s，n=10）Tab.6 Protein expression levels of CCL2，IL-6 and COX-2 in dorsal root ganglia of rats in each group（±s，n=10）

Note：Compared with sham operation group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05；compared with gastrodin group，3）P＜0.05.

Groups Sham operation Model Gastrodin Ad-TNF-α Gastrodin+Ad-TNF-α Ad-GFP CCL2/β-actin 1.19±0.10 2.01±0.251）1.56±0.161）2）2.85±0.291）2）2.09±0.231）3）2.01±0.201）3）IL-6/β-actin 1.01±0.12 2.19±0.231）1.32±0.151）2）2.76±0.111）2）2.18±0.201）3）2.19±0.201）3）COX-2/β-actin 0.96±0.13 2.35±0.211）1.89±0.171）2）2.95±0.291）2）2.39±0.221）3）2.32±0.211）3）

3 討論

坐骨神經(jīng)痛疼痛常呈放射性，疼痛常分布在臀部大腿及小腿后外側(cè)、足外側(cè)等，其疼痛癥狀常由坐骨神經(jīng)壓迫、損傷、炎癥等因素刺激所致［12］。本研究采用壓迫坐骨神經(jīng)法建立坐骨神經(jīng)痛模型，發(fā)現(xiàn)大鼠易激惹行為增多，且足底PWT、PWL降低，大鼠出現(xiàn)疼痛及疼痛敏感性增強(qiáng)癥狀，提示造模成功。另外，機(jī)體CGRP及PGE2變化與疼痛關(guān)系密切。ZHANG等［13］發(fā)現(xiàn)具有感受傷害信號的神經(jīng)介質(zhì)CGRP在三叉神經(jīng)痛患者血漿中表達(dá)升高，且CGRP表達(dá)增多可導(dǎo)致痛覺敏感提高，并長時間維持傷害性疼痛及炎癥性疼痛狀態(tài)，加重患者疼痛感。PINTO等［14］發(fā)現(xiàn)PGE2與炎癥性疼痛產(chǎn)生有關(guān)，能夠通過調(diào)控非特異性陽離子通道瞬態(tài)受體電位香草酸1、嘌呤能受體、電壓門控鈣或鈉通道等傷害感受器中的通道蛋白表達(dá)，導(dǎo)致痛覺過敏，加重疼痛感。本研究在坐骨神經(jīng)痛大鼠坐骨神經(jīng)節(jié)中也檢測到CGRP及PGE2表達(dá)水平升高，進(jìn)一步表明造模成功。

大量研究證實(shí)炎癥細(xì)胞因子TNF-α在慢性疼痛的建立和維持中發(fā)揮重要作用［15］。KANDA等［16］發(fā)現(xiàn)脊髓中活化的膠質(zhì)細(xì)胞可分泌促炎介質(zhì)TNF-α、IL-6、COX-2等刺激神經(jīng)興奮，促進(jìn)機(jī)體對傷害刺激的敏感性，而鞘內(nèi)注射TNF-α抑制劑可迅速降低血管中COX-2表達(dá)，減輕神經(jīng)損傷后的機(jī)械性異常疼痛，并推測TNF-α是參與疼痛敏化，導(dǎo)致神經(jīng)病理性疼痛的重要促炎細(xì)胞因子。本研究在坐骨神經(jīng)痛坐骨神經(jīng)節(jié)中檢測到TNF-α與MAP2共表達(dá)神經(jīng)元、TNF-α與GFAP共表達(dá)星形膠質(zhì)細(xì)胞均顯著增加，且鞘內(nèi)注射TNF-α重組腺病毒，進(jìn)一步激活TNF-α在神經(jīng)元及活化膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)后，大鼠足底PWT、PWL減少及痛覺過敏相關(guān)物質(zhì)CGRP、PGE2表達(dá)進(jìn)一步升高，證實(shí)了TNF-α與疼痛敏化關(guān)系密切。

另外電壓門控鈉通道Nav1.6及STAT3活化參與痛覺敏化過程。ZHANG等［4］及ZYBURA等［17］發(fā)現(xiàn)在調(diào)節(jié)神經(jīng)元興奮和放電模式中起關(guān)鍵作用的電壓門控鈉通道亞型Nav1.6表達(dá)升高，可調(diào)控神經(jīng)元的動作電位和放電特性，并助長神經(jīng)性疼痛的發(fā)生。廖維勇等［18］及MATSUMOTO等［19］證實(shí)STAT3及磷酸化水平增加，可促進(jìn)炎癥介質(zhì)如CCL2、TNF-α表達(dá)增加，而抑制STAT3通路活化可降低星形膠質(zhì)細(xì)胞活化及炎癥介質(zhì)釋放，減弱大鼠機(jī)械異常性疼痛和熱痛覺過敏。近來有研究發(fā)現(xiàn)，Nav1.6及STAT3活化與TNF-α的調(diào)控有關(guān)。DING等［11］發(fā)現(xiàn)Nav1.6、STAT3及TNF-α可重疊表達(dá)于背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元，TNF-α抑制劑可抑制Nav1.6表達(dá)的上調(diào)及STAT3通路的激活，推測TNF-α降低大鼠神經(jīng)病理性疼痛的痛覺敏化過程可能與抑制Nav1.6及STAT3有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)TNF-α在坐骨神經(jīng)痛模型大鼠及Ad-TNF-α組表達(dá)升高的同時，Nav1.6及STAT3、CCL2、IL-6、COX-2蛋白表達(dá)也隨之升高，提示TNF-α可能通過介導(dǎo)Nav1.6及STAT3通路活化參與坐骨神經(jīng)痛大鼠疼痛敏化過程。

抗抑郁藥、抗炎藥、局麻藥、辣椒素、阿片物質(zhì)等是目前治療坐骨神經(jīng)痛等神經(jīng)病理性痛的常用藥物，但這些藥副作用較大，且長期應(yīng)用易發(fā)生耐受性和成癮性［3］。天麻素為來源于天麻的活性成分，臨床上常用其治療三叉神經(jīng)痛、偏頭疼等中樞神經(jīng)疼痛［7］。但坐骨神經(jīng)痛等外周神經(jīng)疼痛與外周神經(jīng)及脊髓神經(jīng)元興奮及異位自發(fā)放電活動關(guān)系密切，且因不受血腦屏障保護(hù)而不同于中樞神經(jīng)病理性疼痛［20-21］。QIU等［22］發(fā)現(xiàn)天麻素可抑制酸敏感離子通道介導(dǎo)的質(zhì)子門控電流改變大鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元興奮及去極化動作電位數(shù)量，從而減輕大鼠疼痛癥狀，提示天麻素對外周神經(jīng)疼痛具有一定的治療效果。本研究發(fā)現(xiàn)，天麻素可抑制坐骨神經(jīng)痛大鼠足底PWT、PWL減少及痛覺過敏相關(guān)物質(zhì)CGRP、PGE2增多，并降低TNF-α介導(dǎo)的Nav1.6及STAT3通路在背根神經(jīng)節(jié)中的表達(dá)，且上述作用可被Ad-TNF-α逆轉(zhuǎn)，提示天麻素降低坐骨神經(jīng)痛大鼠痛覺敏感性作用，可能與抑制TNF-α/STAT3/Nav1.6通路有關(guān)。

綜上所述，天麻素可能通過抑制TNF-α/STAT3通路激活下調(diào)Nav1.6表達(dá)，降低坐骨神經(jīng)痛模型大鼠痛覺敏感性，為臨床治療坐骨神經(jīng)痛和闡明天麻素發(fā)揮鎮(zhèn)痛的可能機(jī)制提供一定參考。但TNF-α/STAT3通路與痛覺敏感性的靶向調(diào)控關(guān)系復(fù)雜，且TNF-α/STAT3與疼痛相關(guān)通路的內(nèi)在作用機(jī)制仍有待深入探討。