LC-MS法測定人血清中潑尼松的濃度

閆 晗，劉 穎，楊巧芝，呂學云，秦 媛，秦道剛，劉培漫，王 婷

(聊城市人民醫(yī)院中西醫(yī)結合兒科重點實驗室，山東 聊城 252000)

潑尼松廣泛應用于腎病綜合征(nephrotic syndrome，NS)[1-4]、甲狀腺炎[5]、皮膚病[6]和紅斑狼瘡[7]的治療，其臨床給藥方案通常憑醫(yī)生經(jīng)驗制定。在進行沖擊治療和長期給藥時往往帶來股骨頭壞死、高血壓、高脂血癥、糖尿病、骨質疏松癥、柯興綜合征和兒童發(fā)育遲緩等多種毒副作用[8]。因此，需要建立快捷、方便的潑尼松血藥濃度檢測方法，為潑尼松個體化用藥的相關研究奠定基礎。國內關于潑尼松生物樣本中濃度測定方法為高效液相色譜法[9]，但測定所需時間較長。國外文獻報道關于生物樣品中潑尼松的測定方法主要有高效液相串聯(lián)質譜法(LC-MS)和氣相色譜串聯(lián)質譜法(GC-MS)。樣品處理方法多為固相萃取法，預處理方法耗時且生物樣品用量較大[10]。本研究采集4名腎病綜合征患兒服用潑尼松后的血清樣品，使用LC-MS法進行血藥濃度檢測，建立了一種簡便、快速、準確的測定人血清中潑尼松濃度的LC-MS法。

1 儀器與材料

AB Sciex 4500 Qtrap質譜儀，島津液相色譜儀(包括LC-20AD泵2臺、DGU-20A3R在線脫氣儀、SIL-20AHT自動進樣器、CTO-20A柱溫箱)，EPPENDORF 5424R型高速冷凍離心機，萬分之一電子分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)，EPPENDORF系列微量移液器：10～1000 μL。

潑尼松(中國藥品生物制品檢定所，批號100199-201002，純度98.50%)，卡馬西平(中國食品藥品檢定研究院，批號100142-201105，純度99.70%)，甲醇(色譜級，賽默飛世爾科技有限公司)，乙酸乙酯、甲酸(色譜級，阿拉丁試劑有限公司)，水(純凈水，杭州娃哈哈集團有限公司)。

2 方法與結果

2.1 色譜及質譜條件

色譜柱：Poroshell 120 SB-C18色譜柱(2.1 mm×50 mm，2.7 μm)；流動相：甲醇(0.05%甲酸)-水(0.05%甲酸)(50:50),流速為0.3 mL/min，進樣量為2 μL，柱溫為40 ℃。離子源為電噴霧離子源(ESI源)，正離子方式檢測，噴霧電壓為5.5 kV；Gas1(N2)∶50 Arb，Gas2(N2):50 Arb。DP分別為50 eV(潑尼松)和115eV(卡馬西平)；EP分別為10 eV(潑尼松)和4 eV(卡馬西平)；CE分別為31 eV(潑尼松)和42 eV(卡馬西平)；CXP分別為9 eV(潑尼松)和13 eV(卡馬西平)；掃描方式為選擇反應監(jiān)測(MRM)。用于潑尼松定量的離子對為m/z359.1/237.2，用于卡馬西平定量的離子對為m/z237.9/194.1。

2.2 標準溶液的配制

精密稱取潑尼松對照品10 mg置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解定容成潑尼松儲備液。以上儲備液于4 ℃冰箱內儲存。臨用時將儲備液用甲醇稀釋成所需濃度，即得潑尼松系列標準溶液。精密稱取卡馬西平對照品，用甲醇溶解并稀釋至濃度為1 mg/L的內標溶液。

2.3 血清樣品的處理

取血清200 μL置于1.5 mL EP管中，加入20 μL內標溶液和20 μL甲醇，加入乙酸乙酯800 μL混勻并渦旋5 min，15 000 r/min離心5 min，取上清置另一EP管中，35 ℃氮氣流吹干。100 μL流動相溶解殘渣，渦旋振蕩5 min，15 000 r/min離心5 min，進樣2 μL分析。

2.4 方法專屬性

潑尼松在ESI正離子電離方式下，主要生成[M+H]+離子峰，為m/z359.1。選擇性對[M+H]+離子進行產(chǎn)物離子全掃描質譜分析。潑尼松生成的主要碎片離子為m/z237.2，將此主要碎片離子作為定量分析時監(jiān)測的產(chǎn)物離子。見圖1。

取人空白血清200 μL，按“2.3血清樣品的處理”項下的方法操作，進樣2μL記錄空白血清樣品的色譜圖(A)；將一定濃度的潑尼松標準溶液和內標液加入空白血清，依同法操作，得模擬血清樣品色譜圖(B)；取腎病綜合征患者口服潑尼松后4 h的血清樣品，依同法操作，得血清樣品色譜圖(C)。結果表明，在上述色譜條件下，內源性物質和代謝物不干擾血清中各成分的測定。潑尼松和內標卡馬西平的保留時間分別為為1.69 min和1.74 min,見圖2。

2.5 標準曲線

取正常人空白血清200 μL，加入潑尼松系列標準溶液20 μL，制成相當于潑尼松10.0、20.0、40.0、80.0、160.0 μg/L的模擬血清生物樣品，按“2.3血清樣品的處理”項下的方法操作，每一濃度進行雙樣本分析，進樣2 μL，記錄色譜圖。以血清中待測物濃度(μg/L)為橫坐標(X)，待測物的峰面積為縱坐標(Y)，用加權(w=1/x2)最小二乘法進行回歸運算，所得的直線回歸方程為

y=3.706×103x-1.233×103(r=0.998 3)

2.6 精密度與準確度

取正常人空白血清200 μL，按“2.5標準曲線”項下的方法制備成低、中、高三個濃度(潑尼松10、40、160 μg/L)的QC樣品，每一濃度進行6樣本分析，連續(xù)測定3 d，根據(jù)當日的標準曲線，計算QC樣品的濃度。對測定結果進行分析，考察方法的日內與日間精密度RSD與準確度RE。結果見表1。表明方法的精密度與準確度良好，符合生物樣品測定的相關要求。

表 1 潑尼松的精密度和準確度(n=6)

2.7 提取回收率

取正常人空白血清200 μL，按“標準曲線和定量下限”項下方法操作，制備低、中、高3個濃度(10、40、160 μg/L)的QC樣品，每一濃度6樣本分析，按照“2.3血清樣品的處理”項下的方法操作，記錄被測物的峰面積A，另取正常人空白血清200 μL，除不加甲醇和內標溶液外，其余按照“2.3血清樣品的處理”項下方法處理。向獲得的上清液中加入標準溶液20 μL和內標溶液20 μL，并在35 ℃氮氣流吹干后再加起始比例流動相100 μL溶解，渦旋離心后取上清液進樣分析，記錄被測物的峰面積B。以每一濃度QC樣品的峰面積A與未經(jīng)提取的樣品峰面積B均值的比值計算，驗證方法的提取回收率，同法考察內標物的提取回收率。結果見表2。

2.8 基質效應

取標準溶液20 μL和內標溶液20 μL，置EP管中，35 ℃氮氣流吹干后加起始比例流動相100 μL溶解，渦旋混合，離心后取上清液進樣分析，每一濃度6樣本，記錄被測物的峰面積C。以“提取回收率”項下方法所得的峰面積B與峰面積C均值的比值計算潑尼松的基質效應，同法考察內標物的基質效應，結果見表2。表明本方法無明顯基質效應。

表 2 潑尼松和卡馬西平的基質效應和提取回收率(n=6)

2.9 樣品穩(wěn)定性

取正常人空白血清200 μL，按“2.5標準曲線”項下的方法制備成低、中、高三個濃度(潑尼松10、40、160 μg/L)的QC樣品，照“2.3血清樣品的處理”項下的方法操作每一濃度進行3樣本分析，考察血清樣品-20 ℃凍藏的穩(wěn)定性。另采用“2.6精密度與準確度”項下樣品，考察預處理后的樣品溶液進樣器放置24 h的穩(wěn)定性。結果表明，潑尼松在上述條件下穩(wěn)定性良好(RE在-7.20%～9.47%)。

2.10 方法學應用

潑尼松治療兒童腎病綜合征常與其他藥物聯(lián)合用藥。本實驗收集的4例腎病綜合征患兒均為聯(lián)合用藥(依那普利、鈣片和骨化三醇)。腎病綜合征患者于早上按2 mg/kg的劑量服用潑尼松后2 h和4 h分別取上肢靜脈血2 mL，離心分取血清，-20 ℃保存待測。LC-MS法測定血清中潑尼松的含量，重復性較好，結果見表3。

表 3 腎病綜合征患者口服潑尼松后的血藥濃度

3 討 論

文獻報道，NS患者服用潑尼松0.5 h后，血中可檢測出潑尼松，2 h左右達到峰值，2 h后潑尼松濃度開始下降[9]。本實驗測定4例NS患者潑尼松濃度，其結果與文獻報道相近[9]。

本實驗建立LC-MS法測定人血清中潑尼松濃度的方法，較文獻[9]方法有較高的靈敏度且快速、準確，適用于臨床上對人血清中潑尼松的測定。通過優(yōu)化色譜條件，采用甲醇(0.05%甲酸)-水(0.05%甲酸)(50∶50)等度洗脫，潑尼松能夠產(chǎn)生較大響應的[M+H]+，且峰形良好，色譜峰保留時間短。分別考察了乙酸乙酯和正己烷作為萃取劑進行液液萃取的血清樣品處理方法，液液萃取法對血清樣品凈化能力較好，內源性物質干擾減小，正己烷液液萃取，潑尼松回收率低，故最終采用乙酸乙酯作為血清樣品提取溶劑。采用乙酸乙酯一步萃取，內標法測定血藥濃度，減少了操作步驟，降低了誤差，使操作簡便，易于標準化，有較高的臨床實用價值。